霍新慧,周知然,蘭永利,韋 芳,阿斯卡爾·牙生

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830001;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830001)

胃黏膜損傷的致病因素有很多,較為常見的是過度或長期飲酒導(dǎo)致的急性損傷。損傷過程中存在大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子,一般而言,炎癥反應(yīng)是人體對抗損傷性刺激的一種自我防御,但是伴隨著炎癥反應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng),機(jī)體無法繼續(xù)維持穩(wěn)態(tài)的正性調(diào)控狀態(tài)時,則會導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》最早提出了“治未病”思想,孫思邈在《備急千金要方》中首次將灸法與“治未病”理論結(jié)合。艾灸作為“治未病”的有效手段,得到廣泛應(yīng)用。研究[4]表明,針灸防治慢性胃炎的機(jī)制主要是去除感染因素、調(diào)整胃腸激素、增強(qiáng)機(jī)體免疫、增加胃黏膜血流量、提高防御能力以及抑制腺體萎縮與增生。本課題組前期研究[5]證實,灸預(yù)處理可減輕大鼠急性胃黏膜損傷,增強(qiáng)胃黏膜微循環(huán)屏障,與針刺預(yù)處理比較,灸預(yù)處理的效果更佳[6]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是炎癥反應(yīng)啟動的重要環(huán)節(jié)[7]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLRs受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵接頭分子。在TLR4信號通路中,核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)處于樞紐位置,可激發(fā)胃黏膜相關(guān)炎癥反應(yīng)[8],影響胃黏膜損傷程度,介導(dǎo)炎癥因子釋放,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等[9]。

因此,本研究通過檢測胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平,探討灸法預(yù)處理對胃黏膜的保護(hù)機(jī)制,從而為臨床預(yù)防以胃黏膜損傷為病理基礎(chǔ)的消化系統(tǒng)疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 30只清潔級SD大鼠,雌雄各半,6周齡,體質(zhì)量(180±20)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(新)2018-0003。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,溫度 20～25 ℃,濕度 50%～54%,自然照明,自由攝食攝水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批,倫理審批號: IACUC-20230227-3。

1.2 藥物與試劑 大鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號202205)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(批號YX-E21122):上海優(yōu)選生物科技有限公司;TLR4抗體(批號AF7017)、MyD88抗體(批號bs-1047R)、NF-κB p65抗體(批號 AF0874):江蘇親科生物;兔抗TLR4熒光抗體(批號YT0744)、兔抗MyD88熒光抗體(批號YT2928)、鼠抗NF-κB熒光抗體(批號Ym3111):美國Immunoway公司。

1.3 儀器 特制香煙型純艾條(4 mm×120 mm):南陽臥龍漢醫(yī)艾絨廠;非接觸式紅外額溫計(型號IM-9001):江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;光學(xué)顯微鏡(型號 BX51T-PHD-J11):日本奧林巴斯;多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(型號Image-Pro Plus):美國Media Cybernetics公司;酶標(biāo)分析儀(型號Infinite F50):上海生物科技有限公司;蛋白印跡儀(型號Yrdimes SW07D0567)、凝膠成像分析系統(tǒng)(型號 KETA M):中國臺灣威泰克有限公司。

2 方法

2.1 動物分組 將30只大鼠隨機(jī)分為3組:正常組、模型組、灸預(yù)處理組,每組10只。實驗過程嚴(yán)格遵守中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

2.2 干預(yù)與模型復(fù)制

2.2.1 艾灸干預(yù)治療 正常組和模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),正常抓取,固定于鼠板,不予干預(yù),每次20 min,每日1次,連續(xù)7 d。灸預(yù)處理組于實驗第1天起予以艾灸,每日均在上午10時開始進(jìn)行艾灸治療。取“足三里”(雙)、“中脘”穴。操作:剃除大鼠穴位區(qū)域被毛,將大鼠仰臥位固定于鼠板,盡量保持自然狀態(tài),彩色筆標(biāo)記穴位,采用特制香煙型純艾條固定于懸灸支架上,使艾條點(diǎn)燃部位垂直距離大鼠穴位約2 cm,應(yīng)用皮膚溫度測定儀將灸處局部溫度控制在42 ℃左右,治療過程中注意處理艾灰,并不斷調(diào)整艾條的固定長度,以保持穴區(qū)灸溫,每次持續(xù)20 min,每日1次,連續(xù)7 d。第8天不予干預(yù),自上午10時開始禁食不禁水。

2.2.2 模型復(fù)制 參照文獻(xiàn)[10],結(jié)合前期經(jīng)驗[6],制備胃黏膜損傷模型。第9天開始(禁食不禁水24 h)進(jìn)行模型復(fù)制:每日采用無水乙醇灌胃,劑量為每只大鼠6 mL/kg,然后灌胃阿司匹林混懸液200 mg/kg。每日22:00(即每次灌胃前12 h),模型組和灸預(yù)處理組禁食不禁水,連續(xù)灌胃4 d(第9天至第12天)。

2.2.3 組織取材 模型復(fù)制結(jié)束后,各組大鼠禁食24 h、禁水8 h,10%水合氯醛腹腔麻醉3 mL/kg,腹主動脈取血,后將胃取出,迅速用生理鹽水沖洗,首先肉眼觀察胃黏膜損傷情況,拍照并進(jìn)行胃黏膜潰瘍指數(shù)(ulcer index, UI)評估。將胃縱切為2份,每一份均含胃底、胃體和胃竇。其中一份胃組織用于蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫組織化學(xué)檢測;另一份胃組織刮取黏膜(置冰上進(jìn)行),凍存管收集后立即置于液氮-80 ℃保存。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

2.3.1 胃黏膜UI觀察 將大鼠胃黏膜組織平展放置于預(yù)冷的濾紙上,參照文獻(xiàn)[11]標(biāo)準(zhǔn),采用卡尺對損傷部位進(jìn)行測定。0分為正常,1分為斑點(diǎn)糜爛,2分為糜爛長度小于1 mm,3分為糜爛長度1～2 mm,4分為糜爛長度2～3 mm,5分為糜爛長度大于3 mm。當(dāng)寬度大于1 mm 時各分值乘以2。UI值為各分值累計相加。

2.3.2 胃黏膜病理學(xué)觀察 進(jìn)行UI觀察后,將含有胃底、胃體和胃竇部分的大鼠胃組織固定后常規(guī)石蠟包埋并切片,顯微鏡下觀察胃黏膜病理變化。

2.3.3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平 取腹主動脈血自然凝固10～15 min,3 000 r/min離心20 min后收集上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作,檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

2.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測胃黏膜組織TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)水平 嚴(yán)格按照試劑盒方法進(jìn)行操作,將常規(guī)石蠟包埋和組織切片經(jīng)抗原修復(fù)后,用正常羊血清液封閉20 min,將配置好的TLR4工作液(1∶50稀釋),以及MyD88、NF-κB p65一抗工作液(1∶100稀釋)滴在組織上,4 ℃過夜,PBS洗滌后滴加生物素化二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,DAB顯色、復(fù)染、封片后,拍照并進(jìn)行圖像分析。

2.3.5 Western blot法檢測胃黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 分別稱取大鼠胃黏膜組織100 mg,剪碎組織后置于裂解液中,勻漿后12 000 r/min離心20 min,提取總蛋白。分別經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉操作后,加入稀釋的TLR4、MyD88和NF-κB (1∶1 000) 一抗,4 ℃孵育、洗膜,二抗(1∶8 000)37 ℃孵育、洗膜,使用凝膠成像儀成像。采用Gel-Pro Analyzer 4軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用GraPhad Prism 7.0軟件進(jìn)行圖表繪制。計量資料比較用單因素方差分析,先進(jìn)行方差齊性檢驗,方差齊用LSD法分析,方差不齊用Dunnett’sT3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 灸預(yù)處理對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜UI的影響 正常組大鼠胃黏膜光滑完整;模型組大鼠胃黏膜可見斑點(diǎn)狀出血灶,UI顯著高于正常組(P<0.05);灸預(yù)處理組大鼠胃黏膜僅見少量斑點(diǎn)狀出血,UI顯著低于模型組(P<0.05)。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預(yù)處理組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 灸預(yù)處理對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜組織形態(tài)的影響 正常組大鼠胃黏膜各層結(jié)構(gòu)完整、清晰,未見破損,細(xì)胞排列緊密、整齊有序,未見脫落及萎縮、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象。模型組大鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,可見腺體中斷,部分可見紅細(xì)胞滲出,腺體擴(kuò)張,有紅細(xì)胞外滲形成出血灶,炎癥細(xì)胞浸潤。灸預(yù)處理組大鼠胃黏膜損傷情況較輕,結(jié)構(gòu)較清晰,有輕微的上皮細(xì)胞脫落,有少量炎性滲出物,可見新生的肉芽組織和毛細(xì)血管。見圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預(yù)處理組

3.3 灸預(yù)處理對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,灸預(yù)處理組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預(yù)處理組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.4 免疫組織化學(xué)法檢測灸預(yù)處理對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,灸預(yù)處理組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4。

3.5 Western blot 法檢測灸預(yù)處理對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,灸預(yù)處理組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預(yù)處理組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

正常情況下,人體胃黏膜能夠抵御物理因素、化學(xué)因素以及細(xì)菌或毒素等致病因素,當(dāng)致病因素超出胃黏膜保護(hù)的程度,或當(dāng)胃黏膜自我防御能力不足時,就會引起胃黏膜損傷[12]。胃黏膜損傷的病理狀態(tài),在常見的消化道疾病中均可出現(xiàn),進(jìn)行未病先防減輕胃黏膜損傷程度,進(jìn)而緩解消化系統(tǒng)疾病的發(fā)展,在臨床中有重要意義。

中醫(yī)認(rèn)為,脾胃為“后天之本”“氣血生化之源”,脾氣健則氣血足,抵御各種病邪,即陰平陽秘則安和[13]。灸法操作簡便,在“治未病”方面具有優(yōu)勢。艾灸“養(yǎng)胃”主要體現(xiàn)為調(diào)補(bǔ)溫通的作用,艾灸通過溫?zé)岽碳る蜓?調(diào)動經(jīng)絡(luò)之氣,從而激發(fā)機(jī)體自身的調(diào)節(jié)防御能力,在疾病尚未發(fā)生時就進(jìn)行艾灸,可激發(fā)一身經(jīng)氣,扶助正氣,以防止疾病的發(fā)生[14]。本課題組前期研究[5-6]證實,針灸預(yù)處理對胃黏膜具有一定的保護(hù)作用。

“足三里”作為足陽明經(jīng)的合穴兼胃腑的下合穴,是主治胃病的首選穴[15],也是歷代醫(yī)家防病保健、扶助正氣的必用穴位。中脘作為胃的募穴,善治胃腑病,是防治消化系統(tǒng)疾病的重要腧穴。中脘與足三里“合募配穴”,調(diào)理脾胃,補(bǔ)中益氣,相輔相成。

無水乙醇是高刺激性化學(xué)類攻擊因子,當(dāng)其被攝入過量、超出胃黏膜屏障保護(hù)的范圍時,則可能產(chǎn)生影響胃黏膜屏障微循環(huán)、激發(fā)炎癥因子、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等病理變化[16]。乙醇損傷大鼠胃黏膜與人類胃黏膜損傷基本相似,故將其作為研究胃黏膜損傷的經(jīng)典動物模型[17]。

TNF-α、IL-6是常見的炎癥因子,通常用于評價胃黏膜的損傷程度[18]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能夠啟動一系列相關(guān)的炎癥信號的級聯(lián)反應(yīng),引起多種炎癥因子的釋放,如TNF-α和IL-6,在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[19]。

本研究顯示,與正常組比較,模型組和灸預(yù)處理組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均顯著升高,與模型組比較,灸預(yù)處理組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均顯著降低。模型組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)水平顯著升高,而灸預(yù)處理組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)水平均低于模型組,提示艾灸通過調(diào)控TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平,增強(qiáng)胃黏膜自我防御能力,通過調(diào)控炎癥因子的釋放對抗炎癥反應(yīng),以減輕大鼠胃黏膜的損傷。

綜上所述,灸預(yù)處理可減輕胃黏膜損傷程度,防止消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展,灸法可通過多個方面激發(fā)胃黏膜的保護(hù)作用,其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。