沈 奇,王艷昕,朱晶晶,文 曼,束道賢,王 穎,孫 敏

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科,安徽 合肥 230031;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;3.淮南聯(lián)合大學(xué),安徽 淮南 232038;4.安徽大學(xué),安徽 合肥 230601)

Wilson病(Wilson’s disease,WD)是一種罕見的先天性銅代謝障礙的常染色體遺傳病,由位于人染色體13q14.3上ATP7B基因變異所致,表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀、精神異常、肝功能異常、角膜K-F環(huán)等癥狀[1]。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn),認(rèn)知功能障礙作為WD的非運(yùn)動(dòng)癥狀之一,表現(xiàn)為執(zhí)行功能、記憶力、注意力障礙,影響患者正常生活。WD腦型多因銅離子存積于大腦各處,尤其是基底節(jié)區(qū),損傷基底節(jié)—丘腦—皮質(zhì)環(huán)路,影響認(rèn)知功能[3]。但是有部分研究表明,認(rèn)知功能障礙并非完全與銅離子在腦的沉積有關(guān),提示W(wǎng)D的認(rèn)知功能障礙還有更復(fù)雜的原因。相關(guān)研究[4]表明,WD患者代謝紊亂導(dǎo)致腸道功能失調(diào),影響腸道菌群的多樣性。腸道菌群對(duì)人體腦功能、情緒以及行為等具有調(diào)節(jié)作用,其功能失調(diào)容易引起帕金森病、精神分裂癥、阿爾茨海默病和腦卒中等神經(jīng)、精神疾病[5]。目前,尚未有對(duì)WD的認(rèn)知功能障礙與腸道微生物多樣性的研究?；谀c道菌群與WD的相關(guān)性,本研究運(yùn)用16S rRNA基因測序技術(shù)對(duì)WD認(rèn)知功能障礙患者和WD無認(rèn)知功能障礙患者的糞便進(jìn)行檢測,分析WD認(rèn)知功能障礙與腸道微生物類型是否存在相關(guān)性,以期為臨床診療WD伴認(rèn)知功能障礙提供思路及參考。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 WD西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《肝豆?fàn)詈俗冃栽\斷和治療指南》[6]:按照錐體外系體征或有肝臟損害病史,合并24 h尿銅>100 μg,或銅藍(lán)蛋白<200 mg/L,或肝銅含量>250 μg/g,K-F環(huán)陽性便可確診;若銅藍(lán)蛋白正?；騅-F環(huán)陰性,而兩條染色體均攜帶ATP7B基因致病變異等明確診斷。

1.1.2 認(rèn)知功能障礙診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7],并結(jié)合臨床癥狀擬定認(rèn)知功能障礙診斷標(biāo)準(zhǔn):①記憶力受損超出根據(jù)年齡與教育的期望值;②有客觀的證據(jù)顯示存在短期和(或)長期的記憶損傷;③整體的認(rèn)知能力降低;④有抽象思維損害和(或)判斷障礙;⑤經(jīng)醫(yī)師通過認(rèn)知量表檢測,可明確其存在認(rèn)知功能障礙;⑥日常生活能力下降。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①確診WD者。②觀察組蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估(Montreal cognitive assessment,MoCA)量表認(rèn)知評(píng)分<26分,受教育年限≤12年,可將結(jié)果加1分;對(duì)照組MoCA量表認(rèn)知評(píng)分≥26分,受教育年限≤12年,可將結(jié)果加1分,但總分不能超過30分。③首次就診患者或近3個(gè)月未服用治療WD的相關(guān)藥物及改善認(rèn)知功能的藥物。④年齡13～65歲。⑤患者及其家屬知情同意。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡>65歲或<13歲;②嚴(yán)重肝功能異常、腦梗死、惡性腫瘤、凝血功能異常、免疫功能異常、心血管疾病患者;③入組前1個(gè)月曾服用治療WD的藥物及改善認(rèn)知功能的藥物;④顱腦MRI檢查可見額葉皮質(zhì)下對(duì)稱性受累,顯示雙側(cè)T2高信號(hào)影;⑤患者拒絕簽署知情同意書。

1.4 一般資料 篩選2017年6月至2018年12月在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科住院且滿足納入標(biāo)準(zhǔn)的WD患者,調(diào)查所有患者的基本情況,且做好數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)工作,即患者的年齡、性別、既往史、家族史、飲食情況以及過敏史等內(nèi)容。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)用MoCA量表篩查滿足認(rèn)知功能障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的WD患者作為觀察組,MoCA量表評(píng)分正常且滿足納入標(biāo)準(zhǔn)的WD患者作為對(duì)照組。 共納入對(duì)照組32例、觀察組患者38例。對(duì)照組:男16例,女16例;平均年齡(28.81±10.67)歲;平均受教育年限(9.91±3.19)年;統(tǒng)一Wilson病評(píng)分量表(unified Wilson’s disease rating scale,UWDRS)評(píng)分為(103.91±19.45)分。觀察組:男19例,女19例;平均年齡(27.35±9.45)歲;平均受教育年限(9.39±3.14)分;UWDRS評(píng)分為(105.11±20.97)分。兩組患者性別、年齡、UWDRS、受教育年限比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。 兩組患者在入組前1個(gè)月未出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病,在收集樣本的1周內(nèi)未服用過任何藥物。

2 方法

2.1 標(biāo)本收集 收集兩組患者的晨起大便樣本(為了避免其他因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,全部待檢者需在無菌區(qū)排便)3～4 g,然后將樣本放入一次性便簽盒中,密封后立即送至冷藏柜中冷藏待檢。

2.2 糞便DNA抽提 取糞便樣本0.2～0.3 g,放進(jìn)存有預(yù)熱溶液A的離心管中,震蕩離心5～10 min后放入65 ℃水溫中至少5 min;將樣本所得的上清液與溶液B相互混合,然后將其置于離心管內(nèi)冰浴5 min以上。然后離心3 min,將其轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)1.5 mL的離心管,管內(nèi)上清液不得多于0.6 mL,然后將其添加到1.5倍的溶液C中,使其充分混合;隨后將上柱分2次(將沖洗液分別加入柱內(nèi),離心1 min后除去穿透液),將其余的液體離心1 min,以便在DNA樣品中清洗溶液。將該溶液移到另外一個(gè)離心管中,再加DNA洗脫液,1～2 min后進(jìn)行最后一次離心,持續(xù)1 min,最終獲得的DNA樣本,放于-20 ℃冰箱中。所提取的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

2.3 PCR擴(kuò)增 選擇可變區(qū)的特定區(qū)段(V3～V4區(qū)),選用通用引物338F和806R對(duì)總DNA樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA序列片段擴(kuò)增,引物序列:上下游引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)與338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′),經(jīng)過27個(gè)循環(huán),每一個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù),將重復(fù)樣品中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行合并,初步檢測濃度后用于后續(xù)高通量測序。

2.4 熒光定量和高通量測序 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量檢測,采用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測;依據(jù)定量結(jié)果和測序量要求,將PCR產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫,通過第二代DNA高通量測序技術(shù),使用Illumina Miseq PE300測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

2.5 生物信息學(xué)分析 將測序后得到所有序列基于聚類單元分析以及分類學(xué)分析,獲得腸道菌群豐度及多樣性,在門、科、屬等生物分類水平上分析統(tǒng)計(jì)各樣品的物種相對(duì)豐度。

3 結(jié)果

3.1 測序數(shù)據(jù)優(yōu)化情況

3.1.1 DNA的序列長度 采用高通量測序系統(tǒng),對(duì)兩個(gè)組別的DNA樣品進(jìn)行比較,并選取12例子樣品序列優(yōu)化,得到1～520 bp的DNA序列長度,大部分DNA的序列長度為421～460 bp。見圖1。

圖1 樣品序列長度分布

3.1.2 樣本多樣性分析 多樣性指數(shù)為腸道菌群種類多樣性的程度,均通過Alpha多樣性分析而獲得。其中Sobs指數(shù)表示觀測到的物種數(shù)目,Simpson指數(shù)是物種豐富度的指標(biāo),即菌群中每個(gè)物種豐度的比例,其數(shù)值越大,代表菌群多樣性越低;Shannon指數(shù)表示物種豐富度和均勻性的指標(biāo),數(shù)值越大代表菌群多樣性越大。兩組樣本多樣性指數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組樣本多樣性比較

3.1.3 稀釋曲線分析 稀釋曲線是用來估計(jì)比較測序數(shù)據(jù)量不同樣品中物種的豐度,可以對(duì)兩組腸道菌群群落豐度進(jìn)行深入對(duì)比,并且也用于檢測樣品測序量是否充足。稀釋曲線斜率平滑、變化不大,提示測序數(shù)據(jù)量較為充足,測序深度基本包含樣本中所有物種,每個(gè)樣本中物種分布也相對(duì)均勻。兩組稀釋曲線斜率較為平滑,且兩組測序的數(shù)據(jù)具有充分的合理性,可以為進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析提供依據(jù)。見圖2。

圖2 兩組稀釋曲線

3.2 樣品分組分析 非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析顯示:兩組微生物組成差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。通過相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM )評(píng)估的腸道菌群結(jié)構(gòu)在兩組之間存在顯著差異(R=0.650 5,P=0.009)。 主成分分析(principal component analysis,PCA)(圖3B)和主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(圖3C)表明兩組患者的腸道微生物存在明顯差異。

3.3 物種差異 組間物種差異研究,即對(duì)兩個(gè)群落中不同種類進(jìn)行監(jiān)測,并進(jìn)行假定檢驗(yàn),以評(píng)價(jià)其差異的顯著程度。本研究樣品的物種進(jìn)行差異顯著性分析,分別從門、科和屬3個(gè)不同生物分類信息比較其相對(duì)豐度信息,以探討腸道菌群和WD認(rèn)知障礙的相關(guān)性。

3.3.1 兩組門水平相對(duì)豐度比較 兩組差異明顯的物種有擬桿菌門(Bacteroidetes),分別占14.36%和48.78%;厚壁菌門(Firmicutes),分別占49.46%和32.02%;放線菌門(Actinobacteria),分別占1.21%和11.12%;變形菌門(Proteobacteria),分別占34.96%和8.08%。與對(duì)照組比較,觀察組擬桿菌門和放線菌門豐度明顯升高(P<0.05);厚壁菌門和變形菌門豐度明顯降低(P<0.05)。見圖4。

3.3.2 兩組科水平菌群相對(duì)豐度比較 兩組差異明顯的物種有產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae),分別占0.005%和5.224%;韋榮氏球菌科(Veillonellaceae),

注:A.NDMS分析;B.PCA分析;C.PCoA分析

分別占0.520%和4.693%;乳酸菌科(Lactobacillaceae),分別占0.005%和4.844%;紫單胞菌科(Porphyromonadaceae),分別占0.876%和3.828%;雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae),分別占0.251%和11.090%;理研菌科(Rikenellaceae),分別占0.415%和3.082%;擬桿菌科(Bacteroidaceae),分別占0.961%和41.840%;鏈球菌科(Streptococcaceae),分別占9.363%和0.071%;腸桿菌科(Enterobacteriaceae),分別占34.120%和2.391%;普氏菌科(Prevotellaceae),分別占11.450%和0.027%;毛螺菌科(Lachnospiraceae),分別占15.350%和14.720%;科里桿菌科(Coriobacteriaceae),分別占0.938%和0.018%;乳球菌科(Ruminococcaceae),分別占21.210%和7.396%;梭菌科(Clostridiaceae_1),分別占2.298%和0.018%;未分類擬桿菌(Bacteroidales_S24-7_group),分別占0.657%和0%。與對(duì)照組比較,觀察組雙歧桿菌科、紫單胞菌科、擬桿菌科、產(chǎn)堿桿菌科、理研菌科、乳酸菌科、韋榮氏球菌科豐度明顯升高(P<0.05),梭菌科、科里桿菌科、未分類擬桿菌、腸桿菌科、毛螺菌科、乳球菌科、普氏菌科、鏈球菌科豐度明顯降低(P<0.05)。見圖5。

注:P值為Ae-b形式,為A×10-b次方值,其值遠(yuǎn)小于0.05

3.3.3 兩組屬水平菌群相對(duì)豐度比較 兩組差異明顯的物種有擬桿菌屬(Bacteroides),分別占0.961%和41.840%;柯林斯氏菌屬(Parabacteroides),分別占0.459%和3.648%;Lachnoclostridium,分別占0.237%和9.064%;乳球菌屬(Ruminococcus_2),分別占0.037%和4.467%;帕拉斯氏菌屬(Parasutterella),分別占0%和5.224%;雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),分別占0.251%和11.090%;另枝菌屬(Alistipes),分別占0.415%和3.082%;小桿菌屬(Dialister),分別占0%和4.613%;乳酸菌屬(Lactobacillus),分別占0.005%和4.844%;棲糞桿菌屬(Faecalibacterium),分別占16.270%和1.599%;克雷伯氏菌(Klebsiella),分別占33.800%和0.049%;鏈球菌屬(Streptococcus),分別占9.363%和0.071%;普雷沃氏菌屬(Prevotella_9),分別占10.860%和0.014%;布勞特氏菌屬(Blautia),分別占3.187%和1.973%;直腸真桿菌屬([Eubacteri-um]_rectale_group),分別占5.047%和0.271%。與對(duì)照組比較,觀察組乳酸菌屬、小桿菌屬、乳球菌屬、柯林斯氏菌屬、另枝菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、帕拉斯氏菌屬豐度明顯升高(P<0.05),直腸真桿菌屬、布勞特氏菌屬、克雷伯氏菌、棲糞桿菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬豐度明顯降低(P<0.05)。見圖6。

注:P值為A e-b形式,為A×10-b次方值,其值遠(yuǎn)小于0.05

注:P值為Ae-b形式,為A×10-b次方值,其值遠(yuǎn)小于0.05

4 討論

WD是一種銅代謝異常的常染色體隱性遺傳病,臨床主要以錐體外系癥狀及肝臟損害為主,除了以上損害外,認(rèn)知功能障礙也十分常見[2]。在認(rèn)知功能障礙的整個(gè)發(fā)展過程中,腸道微生物,如放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門起到重要作用[8]。但是關(guān)于WD合并認(rèn)知功能障礙的研究較少,因此本研究在既往研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)WD患者腸道菌群與認(rèn)知的相關(guān)性展開研究。

中醫(yī)理論認(rèn)為人的意識(shí)、思維、情感等腦神的變化與腑氣通暢關(guān)系密切,例如腦卒中后便秘就是腦神的改變影響腸腑氣的通暢,便秘患者腸腑通降失常,腑氣不通,上擾清竅,也可影響神明。腦與腸在生理、功能或病理上相互影響、相互制約?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)將腸道微生物與大腦之間的雙向交流稱為微生物群—腸—腦軸,涉及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、大腦功能和認(rèn)知調(diào)節(jié)等方面[9]?，F(xiàn)有研究[10-11]發(fā)現(xiàn),腸道微生物主要通過以下兩個(gè)方面影響認(rèn)知功能:腸道微生物產(chǎn)生的代謝物(如短鏈脂肪酸、神經(jīng)遞質(zhì)及其前體)通過影響大腦中相關(guān)代謝物水平,從而調(diào)節(jié)大腦功能和認(rèn)知;腸道炎癥以及腸道屏障功能失調(diào),腸道通透性增加可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變,影響認(rèn)知功能。其中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽,是腸道微生物厚壁菌門、普氏菌科、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬和真桿菌屬等代謝的主要產(chǎn)物[12],能夠提供能量以及維持腸道菌群和電解質(zhì)的穩(wěn)定[13]。同時(shí)能影響血腦屏障通透性,維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,被認(rèn)為是微生物—腸—腦相互作用的關(guān)鍵遞質(zhì),能夠調(diào)控宿主認(rèn)知功能等行為[14]。SCFAs減少則更容易發(fā)生認(rèn)知障礙,進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病[15]。

丁酸鹽是厚壁菌門的主要產(chǎn)物[16],在大腦中可通過抑制組蛋白脫乙酰酶,對(duì)神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用并改善記憶[17]。帕金森病患者SCFAs濃度降低,尤其是丁酸鹽濃度降低,腸道屏障滲透性和血腦屏障的通透性增加[18],脂多糖等促炎產(chǎn)物通過腸壁進(jìn)入血液,穿過血腦屏障激活小膠質(zhì)細(xì)胞并引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致人和動(dòng)物的認(rèn)知能力下降[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn),厚壁菌門中毛螺菌科和梭菌科數(shù)量與認(rèn)知表現(xiàn)呈正相關(guān),在2型糖尿病患者中觀察到其相對(duì)豐度降低。其中,梭菌的減少會(huì)增加腸道通透性,增加的滲透性使細(xì)菌或細(xì)菌成分如脂多糖和其他抗原滲入并引發(fā)炎癥反應(yīng),從而影響大腦的認(rèn)知能力[21]。本研究發(fā)現(xiàn),WD認(rèn)知功能障礙患者擬桿菌門增加,厚壁菌門、毛螺菌科、梭菌科、普氏菌科、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬、直腸真桿菌屬降低,與相關(guān)研究結(jié)果一致。

綜上所述,WD認(rèn)知功能障礙的發(fā)病或整個(gè)病程中存在腸道菌群的參與,這些腸道菌群的改變可能通過SCFAs影響WD認(rèn)知功能障礙。但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。