董曉微， 郭 東， 柳 斌， 張俊華， 樊瑞軍

（寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗診斷中心，銀川 750002）

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的95%，居我國惡性腫瘤發(fā)病率第3 位，在全球范圍內(nèi)，每年可造成近100 萬人死亡[1]。切除、移植、化療栓塞、乙醇注射和冷凍消融術(shù)是治療肝細(xì)胞癌的潛在方法，但僅對小且具有局限性的腫瘤有效[2]。不幸的是，大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者在診斷時已到晚期，目前治療效果不佳。因此，迫切需要為肝細(xì)胞癌研究新的治療策略。近年來，在癌癥治療中，生物免疫治療作用越來越突出，抗原提呈細(xì)胞之一的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）不僅參與T 細(xì)胞的激活、免疫功能的恢復(fù)，并可促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的釋放等過程，從而發(fā)揮抗腫瘤效果[3]。細(xì)胞因子信號抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）作為細(xì)胞因子信號抑制因子（SOCS）家族的一員，近年來得到廣泛關(guān)注。SOCS1 不僅參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)，而且參與泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程，與DC 分化、T 細(xì)胞功能以及腫瘤進(jìn)展息息相關(guān)，這些功能在腫瘤細(xì)胞的生長和增殖中都起著重要作用[4]。微小RNA-618（micro RNA-618，miR-618）能夠調(diào)節(jié)DC 以及T 細(xì)胞，作為抗癌免疫治療的新方法，miR-618 在肝癌中也可能發(fā)揮著重要的抑癌因子作用。因此，miR-618 作為SOCS1的靶向miRNA，探究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控和相關(guān)功能對DC 表面抗原及其免疫調(diào)控的影響，對于指導(dǎo)肝細(xì)胞癌臨床免疫治療意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料

采集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2020 年10月至2021 年10 月收治的60 例肝細(xì)胞癌患者的外周靜脈血，其中男性38 例，女性22 例；年齡52～75 歲，平均年齡（64.45±4.22）歲。通過淋巴細(xì)胞分離液離心得到外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。PBS 緩沖液、Lipofectamine3000 試劑盒、RPMI 1640 培養(yǎng)基和Gibco Opti-MEM 培養(yǎng)基均購自賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；TransScriptⅡGreen One-Step RT-qPCR、SuperMix 試劑盒、TRIzol 試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）12、干擾素-α（interferon-α，IFN-α）和腫瘤壞死因子-γ（tumor necrosis factor-γ，TNF-γ）、ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HEK-293T 細(xì)胞來自國家中心細(xì)胞庫，所有序列均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；所有抗體均購自美國Abcam 公司；pmirGLO 質(zhì)粒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海源葉生物科技有限公司；FC 500 MCL 型五色流式細(xì)胞儀、7500 型全自動PCR 儀及UniCel DxI 800 型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀均購自美國Beckman 公司。

1.2 方法

1.2.1 DC 孵育 在RPMI 1640 全培養(yǎng)基中培養(yǎng)PBMC，第2 天去原培養(yǎng)液，加入等量含有IL-4和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）與肝細(xì)胞癌細(xì)胞裂解液的新培養(yǎng)液繼續(xù)孵育約7 d，在其分化成未成熟的DC 時去原培養(yǎng)液，更換等量IFN-α 的培養(yǎng)液，孵育至第9 天時獲得成熟的DC。

1.2.2 T 細(xì)胞孵育 使用含10%牛血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞PBMC 配成計數(shù)為4×107個/mL。使用37 ℃培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，以約6 滴/min 放出Hanks 液，在尼龍毛柱中加入0.5 mL 的PBMC 懸液后，馬上加0.2 mL 培養(yǎng)液后封閉塑料管，放入CO2培養(yǎng)箱中使PBMC 充分黏附尼龍毛柱，約培養(yǎng)60 min。接著用5 mL 培養(yǎng)液洗脫尼龍毛柱并收集，2 500 r·min-1離心8 min，去上清，繼續(xù)常規(guī)孵育。

1.2.3 分組與轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine3000說明書，將DC 轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行分組：僅含mimic 脂質(zhì)體陰性對照組（mimic NC 組）、僅含miR-618 mimic 脂質(zhì)體組（miR-618 mimic 組）、僅含SOCS1 shRNA 質(zhì)粒脂質(zhì)體組（sh-SOCS1 組）、僅含shRNA NC 質(zhì)粒脂質(zhì)體對照組（shRNA-NC組）、含SOCS1 shRNA 與miR-618 mimic 脂質(zhì)體組（miR-618 mimic+sh-SOCS1 組）。

1.3 檢測方法

1.3.1 相關(guān)細(xì)胞表面標(biāo)記物水平的檢測 首先將培養(yǎng)基重懸細(xì)胞配成計數(shù)為2×106個/mL。接著在流式細(xì)胞管中分別加入50 μL 的CD3 抗原提呈細(xì)胞（CD3-APC）、CD4 異硫氰酸熒光素（CD4 fluorescein isothiocyanate，CD4-FITC） 或CD8 藻紅蛋白（CD8 phycoerythrin，CD8-PE）以及相應(yīng)的50 μL 細(xì)胞，混勻后冰浴20 min。在4 ℃下2 500 r·min-1離心8 min，去上清，加入500 μL PBS 吹洗，重復(fù)2 次。最后加入400 μL PBS，使用FC 500 MCL 型五色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

1.3.2 沉默SOCS1 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成野生型SOCS1 及突變型3’UTR，隨后將其克隆到含熒光素酶報告基因pmirGLO上游，提純備用。按Lipofectamine3000 說明書將對照序列miR-618 mimic 和陰性轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞，孵育48 h 后收獲細(xì)胞。檢測細(xì)胞的相對熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶值/海腎熒光素酶值）。

1.3.3 miR-618 表達(dá)量 用TRIzol 試劑盒提取DC 中總RNA。用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）溶解RNA，使用7500 型全自動熒光定量PCR 儀測量260 nm 和280 nm 下吸光值，測定總RNA 含量。使用RT-qPCR SuperMix試劑盒及PCR 儀擴(kuò)增測定（上游引物：5’-GGGGAAACTCTA-CTTGTCCTT-3’，下游引物：5’-TCGTATCCAGTGC-GTGTCGT-3’）。依據(jù)試劑盒說明書完成反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，miR-618表達(dá)水平用2－ΔΔCt法分析。

1.3.4 SOCS1 蛋白表達(dá) 將DC 培養(yǎng)基棄液，PBS 洗滌2 次，加入含1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解液，在冰上孵育5 min。隨后4 ℃下10 000 r·min-1離心4 min。使用SDS-PAGE 凝膠電泳在聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上測定蛋白濃度。室溫下，在搖床上使用含5% 牛血清蛋白的Tris 鹽緩沖液+TBST 緩沖液封閉1 h。棄液，以GAPDH 為內(nèi)參，加入鼠一抗SOCS1，轉(zhuǎn)膜后4 ℃冰箱中放置12 h。隨后用TBST 沖洗，加入山羊抗鼠IgG 二抗，在4 ℃培養(yǎng)箱中孵育約5 h。PVDF 與化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)60 s，曝光后，采用Image J 軟件分析蛋白相對表達(dá)量。SOCS1 蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量=目標(biāo)帶灰度值/內(nèi)參照帶灰度值。

1.3.5 DC表面抗原檢測 將含DC的培養(yǎng)液與CD4-APC、CD11c-FITC、CD86-PE 分別加入Falcon管，2 500 r·min-1離心15 s，標(biāo)記DC 后避光孵育15 min，隨后添加100 μL 生理鹽水，2 500 r·min-1離心90 s，將沉淀細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管，在流式細(xì)胞儀中檢測，記錄結(jié)果。

1.3.6 DC 上清液中細(xì)胞因子水平 4 000 r·min-1離心15 min 后收集DC 上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法，按照對應(yīng)的細(xì)胞因子試劑盒說明書操作，將其標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，調(diào)零，標(biāo)準(zhǔn)品為X 軸，吸光度為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算測定IL-12、IFN-α 和TNF-γ 水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察DC

經(jīng)裂解液處理后，DC 呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，多為圓形，失去樹突狀外觀，細(xì)胞膜光滑且清晰，少數(shù)為星形，周圍存在長短不等的突起，仍呈現(xiàn)梭形，見圖1。

圖1 光鏡下觀察DC（×40）

2.2 DC 表面抗原分析

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC 表面抗原情況。其中含CD3+的細(xì)胞約占94%，提示分離DC 表面抗原的T 細(xì)胞純度較高。進(jìn)一步分析，CD3+CD4+細(xì)胞約占36%，而CD3+CD8+細(xì)胞約占52%。CD1a+和CD83+分別為DC 特異性和成熟的細(xì)胞標(biāo)記物，CD1a+細(xì)胞約占93%，CD1a+CD83+細(xì)胞約占85%。

2.3 DC 中miR-618 表達(dá)情況比較

在DC 誘導(dǎo)第0、1、3、5、7 天后進(jìn)行miR-618表達(dá)水平比較，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)0、1、3 d 時miR-618 表達(dá)水平無明顯變化，但經(jīng)多種抗原刺激后，在第5、7 天miR-618 表達(dá)水平均比第0 天降低（P 均＜0.05），見圖2。

圖2 DC 中miR-618 表達(dá)情況

2.4 miR-618 靶向沉默SOCS1 表達(dá)

雙熒光素酶系統(tǒng)表明，miR-618 與SOCS1 表達(dá)存在靶向調(diào)控（P＜0.05），見圖3A。miR-618 過表達(dá)后，SOCS1 蛋白表達(dá)低于mimic NC 組（P＜0.05），見圖3B、圖3C。

圖3 miR-618 靶向沉默SOCS1 表達(dá)情況

2.5 沉默SOCS1 促進(jìn)DC 活化

成熟DC 表面抗原CD4、CD11c、CD86、HLADR 的表達(dá)水平的結(jié)果表明，與各對照組相比，miR-618 mimic 組和shRNA-SOCS1 組CD11c、HLA-DR 和CD86 的陽性細(xì)胞均增多（P 均＜0.05），CD4 陽性細(xì)胞無明顯變化（P＞0.05）。miR-618 mimic+sh-SOCS1 組CD11c、HLA-DR、CD86的陽性細(xì)胞數(shù)均增多（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 沉默SOCS1 促進(jìn)DC 表面抗原表達(dá)

2.6 沉默SOCS1 促進(jìn)DC 中細(xì)胞因子分泌

與各對照組相比，miR-618 mimic 組和shRNASOCS1 組TNF-γ、IL-12 和IFN-α 表達(dá)水平均上升（P 均＜0.05），miR-618 mimic+sh-SOCS1 組上述因子均增加（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 沉默SOCS1 促進(jìn)DC 中細(xì)胞因子分泌

3 討論

SOCS1 是SOCS 家族的原型分子，作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)的一部分，通過直接抑制酪氨酸激酶和激活的細(xì)胞因子受體的信號級聯(lián)來下調(diào)細(xì)胞因子信號，減弱細(xì)胞因子啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]，SOCS1還通過直接和間接機(jī)制下調(diào)Toll 樣受體（Tolllike receptor，TLR）信號[7]，多種人類癌癥中檢測到腫瘤細(xì)胞中SOCS1 的異常表達(dá)，這與細(xì)胞因子受體和TLR 信號的失調(diào)有關(guān)。對腫瘤細(xì)胞中SOCS1 功能的研究揭示了其在致癌中的重要作用[8]。DC 是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，是調(diào)節(jié)和維持對腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的核心[9]。作為抗原的來源，全蛋白、腫瘤細(xì)胞裂解物（TCL）、HLA 限制性肽、RNA 或雜交細(xì)胞可以通過DC 呈遞給T 淋巴細(xì)胞[10]。有研究[11-12]闡述了TL 脈沖自體DC 免疫治療黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、兒童實體瘤和卵巢癌。miRNA 參與了DC 的分化，與腫瘤的免疫調(diào)控有關(guān)，將miRNA 作為靶點進(jìn)而增強(qiáng)DC 的免疫功能。本研究結(jié)果顯示，miR-618 在DC 誘導(dǎo)期間表達(dá)下調(diào)。

細(xì)胞因子與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，將生物信息傳遞給靶細(xì)胞，與之相關(guān)的信號通路控制和調(diào)節(jié)基本的生物學(xué)過程，包括造血、炎癥、免疫和腫瘤的發(fā)展[13-14]。SOCS1 可能在調(diào)節(jié)腫瘤生長和增殖中發(fā)揮作用[15]。對SOCS1 缺陷小鼠的研究證實了SOCS1 在調(diào)節(jié)CD8+T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用[16]。在胸腺中，SOCS1 可防止陽性選擇失敗的胸腺細(xì)胞存活和擴(kuò)張，確保陰性選擇，并防止其向CD8 譜系的不當(dāng)發(fā)育傾斜。SOCS1 不僅能控制T 細(xì)胞刺激性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還能降低CD8+T 細(xì)胞對協(xié)同細(xì)胞因子刺激和抗原非特異性激活的敏感性。由于CD8+T 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子刺激增加了其對低親和力T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）的敏感性，SOCS1 可能通過抑制由炎性細(xì)胞因子驅(qū)動的異常T 細(xì)胞活化來促進(jìn)外周T 細(xì)胞耐受[17]。Rossato 等[18]發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性硬化漿細(xì)胞樣DC 中miR-618 的表達(dá)較健康對照組低，其可能是對免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要靶點。本研究證實，SOCS1 功能的發(fā)揮受靶向miRNA 的調(diào)控，而沉默SOCS1 在肝細(xì)胞癌免疫調(diào)節(jié)中具有重要價值。SOCS1 還可通過調(diào)節(jié)DC 的產(chǎn)生、成熟、抗原呈遞、共刺激信號和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)其對T 細(xì)胞的激活作用[19]。SOCS1 對T 細(xì)胞、T 調(diào)節(jié)細(xì)胞和DC 的上述調(diào)控機(jī)制可共同協(xié)助免疫耐受并預(yù)防自身免疫發(fā)生。另外，在DC或CD8+T 細(xì)胞中沉默SOCS1 能有效地刺激抗腫瘤免疫。SOCS1 還可通過調(diào)節(jié)致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在癌細(xì)胞中起抑癌作用[20]，它可以被細(xì)胞信號因子調(diào)節(jié)，SOCS1的啟動子包含STAT 結(jié)合區(qū)，STAT 結(jié)合區(qū)域可以被STAT 信號因子調(diào)節(jié)[20]。促紅細(xì)胞生成素（EPO）刺激下調(diào)EPO 應(yīng)答細(xì)胞系中GFI1B 的表達(dá)，從而激活SOCS1。SOCS1 也可由其他細(xì)胞因子誘導(dǎo)，如IL-6、IL-4、IL-12、IL-13、TNF-γ、IFN-α/β 等。事實上，細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號丟失可能導(dǎo)致效應(yīng)器功能受損和耐受誘導(dǎo)。其他幾種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-17 和IL-21 也有助于細(xì)胞增殖、分化、獲得不同的效應(yīng)器功能、防止衰竭和記憶細(xì)胞的產(chǎn)生[21]。本研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-618 或沉默SOCS1 能夠促進(jìn)DC 中TNF-γ、IL-6 和IFN-α 等細(xì)胞因子的表達(dá)。

綜上所述，沉默SOCS1 可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌患者DC 活化，提高其免疫調(diào)控能力。