楊玉東， 董 東， 閻文軍

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，銀川 750002； 3.甘肅省人民醫(yī)院麻醉手術(shù)科，蘭州 730000）

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND）是圍術(shù)期嚴(yán)重并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶、注意力、執(zhí)行功能、語言思維、知覺運(yùn)動(dòng)、社會(huì)認(rèn)知等能力下降[1-2]。PND 導(dǎo)致術(shù)后1～6 個(gè)月的病死率增加，且發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者的術(shù)后恢復(fù)質(zhì)量，使其住院時(shí)間延長(zhǎng)、醫(yī)療費(fèi)用增加，甚至可能導(dǎo)致長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[3]。研究[4-5]表明，由手術(shù)創(chuàng)傷引起的外周炎癥和全身炎性介質(zhì)的釋放會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥過程，并且這些炎性介質(zhì)水平的高低與認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度相關(guān)，尤其是在記憶和學(xué)習(xí)方面。維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）是一種RNA 解旋酶，被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，通過識(shí)別病毒與細(xì)菌的RNA 和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），導(dǎo)致核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的激活，從而發(fā)揮抗病毒和抗菌的先天免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道[6]，RIG-I/NF-κB 信號(hào)通路與神經(jīng)炎性反應(yīng)關(guān)系密切，故其過度激活可能通過導(dǎo)致腦內(nèi)促炎因子級(jí)聯(lián)式增加，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，但抑制該通路是否可以改善PND 仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討RIG-I/NF-κB 信號(hào)通路在老齡小鼠PND 中的作用及其潛在機(jī)制，為PND 提供新的分子靶點(diǎn)和治療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

50 只15 月齡雄性野生型C57BL/6J 小鼠飼養(yǎng)于南京拉姆達(dá)醫(yī)藥有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（蘇）2021-0038］，并由南京拉姆達(dá)醫(yī)藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：IACUC-20220608），所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法與操作均嚴(yán)格遵守倫理規(guī)范。經(jīng)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出無學(xué)習(xí)能力障礙的36 只小鼠，于第7 天進(jìn)行分組和造模。采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠平均分為4 組：空白組（C 組）、假手術(shù)組（Sham 組）、PND組、RIG-I-/-+PND 組，每組9 只。C 組不做任何處理，其他組在腹腔注射4%水合氯醛麻醉后切開小腿皮膚，Sham 組不做脛骨骨折處理，0.9%生理鹽水沖洗后逐層縫合傷口；PND 組、RIG-I-/-+PND 組進(jìn)行脛骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定手術(shù)處理，應(yīng)用利多卡因注射液鎮(zhèn)痛后縫合。RIG-I-/-+PND 組于術(shù)前和術(shù)后第3 天經(jīng)海馬注射RIG-I-siRNAs［通用生物（安徽）股份有限公司，中國(guó)］各1 次。注射時(shí)將siRNA 以5 nmol/20 g 的濃度溶解于RNase-free 水中，將小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀（南京卡爾文生物科技有限公司，中國(guó)），沿顱骨中線切開皮膚，暴露顱骨并消毒后，用定位儀推進(jìn)器將頭皮針插入顱骨小孔下約2 mm 處進(jìn)行注射。每只小鼠注射體積為50μL，注射時(shí)間>90 s，留針時(shí)間約30 s，注射期間保持注射管道系統(tǒng)的通暢及封閉。注射用RIG-I-siRNA 序列如下：正向引物：5’-GCCAUGCAACAUAUCUGUAAAdTdT-3’；反向引物：5’-UUUACAGAUAUGUUGCAUGGCdTdT-3’。

1.2 脛骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定手術(shù)

脛骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)用于建立PND 模型[7]。腹腔注射5%水合氯醛（博士德生物工程有限公司，中國(guó)）0.5 mL/100 g 麻醉小鼠。待小鼠翻正反射消失后，將其固定于手術(shù)臺(tái)（瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó)）上，備皮、使用碘伏消毒小鼠右下肢，鋪巾后于右側(cè)膝關(guān)節(jié)下切開約0.5 cm 皮膚，逐層分離，暴露脛骨。將0.3 mm 的髓內(nèi)固定針插入髕腱，充分固定后用手術(shù)鉗于脛骨中上1/3 處斷裂脛骨骨干，立即使用0.9%生理鹽水沖洗后再將固定針完全插入并對(duì)合。清創(chuàng)后逐層縫合傷口，手術(shù)切口周圍以0.2%利多卡因膠漿局部浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛，包扎后將小鼠置于電熱毯（三春電器有限公司，中國(guó)）上復(fù)蘇，待其蘇醒后送回動(dòng)物房正常飼養(yǎng)。手術(shù)時(shí)間約30 min，全程無菌操作，術(shù)中室溫維持在24～26 ℃，直腸溫度維持36.5～37.5 ℃。

1.3 組織樣本采集

小鼠術(shù)后第1、3、7 天Morris 水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，每組隨機(jī)取3 只小鼠麻醉后使用脊椎脫臼法處死，剝離小鼠大腦皮質(zhì)，快速分離海馬組織。將分離的海馬組織置于培養(yǎng)皿中，用1×PBS 洗滌3 次，以去除雜質(zhì)。隨后液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，分別于術(shù)前和術(shù)后進(jìn)行[9-10]。術(shù)前用于剔除學(xué)習(xí)能力異常的小鼠，術(shù)后用于評(píng)價(jià)RIG-I基因沉默對(duì)于PND 小鼠認(rèn)知能力的影響?？臻g認(rèn)知能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的4 組小鼠于術(shù)后第1、3、7 天進(jìn)行逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)測(cè)試。每次實(shí)驗(yàn)分別從4 個(gè)象限的固定點(diǎn)將小鼠面向池壁放入，記錄其找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），60 s 內(nèi)未找到平臺(tái)的潛伏期記為60 s。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤掉水下平臺(tái)，將小鼠從原平臺(tái)對(duì)角象限面向池壁放入，記錄60 s 內(nèi)其在原逃生平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間（目標(biāo)象限停留時(shí)間），以及在該時(shí)間內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)（穿越平臺(tái)次數(shù)）。實(shí)驗(yàn)期間使用路徑追蹤系統(tǒng)采集小鼠游泳軌跡（Noulds，EthoVision 14.0，荷蘭）。

1.5 ELISA 測(cè)定海馬組織炎性因子含量

-80 ℃凍存的海馬組織用無菌手術(shù)剪刀剪碎，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 加入1×PBS 液，利用玻璃勻漿器將組織制成勻漿，4 ℃、12 000 r·min-1，離心10 min，收集上清液。采用ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國(guó)）檢測(cè)術(shù)后第1、3、7 天海馬組織上清液中炎性因子白細(xì)胞介素（interleukin 1β，IL）-1β、IL-6 以及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。具體步驟按照ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）說明書進(jìn)行操作：將樣本按1∶4 稀釋后，分別加入小鼠IL-1β、IL-6 或TNF-α 捕獲抗體包被的固相抗體微孔板。結(jié)合后加入HRP 酶標(biāo)記抗體，最后用TMB 顯色。用多功能酶標(biāo)儀（M3 公司，美國(guó)）在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平。

1.6 Real-time qPCR 檢測(cè)小鼠海馬組織RIG-I基因表達(dá)水平

按TRIzol 試劑說明書（Invitrogen 公司，美國(guó)）操作步驟，提取海馬組織中總RNA?？俁NA在OD 260 nm 處測(cè)定RNA 濃度，OD 260/280 nm處檢測(cè)抽提的RNA 純度。根據(jù)試劑盒說明書，使用cDNA 第一鏈合成試劑盒（TaKaRa RR036B，日本）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和One Step TB GreenPrime－ScriptTMRT-PCR KitⅡ（SYBR Green，TaKaRa 公司，日本）進(jìn)行cDNA 片段擴(kuò)增。0.1 mL PCR 管中，依次加入如下組分混合成20 μL 反應(yīng)體系：10 μL 2×Real-time PCR Master Mix、1 μL 8 倍稀釋的cDNA 模板、2 μL 引物Mix 及7 μL 0.1% DEPC水。隨后使用熒光定量PCR 循環(huán)儀（ABI Step one plus Real time-PCR system，美國(guó)），設(shè)置95 ℃預(yù)熱5 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40 次循環(huán)。RIG-I 和GAPDH 內(nèi)參引物使用Primer 6 設(shè)計(jì)，由通用生物（安徽）股份有限公司合成，引物序列見表1。2-ΔΔCt法用于計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR 引物序列

1.7 Western blot 檢測(cè)小鼠海馬組織RIG-I 和NF-κB p65 的表達(dá)

使用全蛋白抽提試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGP250，中國(guó)）提取凍存的小鼠海馬組織中的總蛋白，具體步驟按照產(chǎn)品說明書操作。用BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGP250，中國(guó)）定量蛋白濃度。蛋白加熱變性后等體積上樣，用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠、5%濃縮膠）分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC）。NC 膜在常溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，移入4 ℃分別同抗兔RIG-I（Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)，1∶1 000）、抗兔NF-κB p65（Abcam 公司，美國(guó)，1∶1 000）或抗兔GAPDH 一抗（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)，1∶5 000）搖床振蕩孵育過夜。次日，加入對(duì)應(yīng)抗兔HRP 酶標(biāo)IgG 二抗（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)，1∶1 000）常溫孵育2 h 后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色。ChemiDoc MP Imaging System（Bio-rad 公司，美國(guó)）用于成像，Gel-Pro 32 軟件（Media Cybernetics 公司，美國(guó)）進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 9.0 軟件繪制柱狀圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIG-I 基因沉默改善老齡PND 小鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙

老齡小鼠連續(xù)5 d 進(jìn)行定位航行訓(xùn)練幫助形成空間記憶后，篩選記憶功能無障礙的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。術(shù)后第1、3、7 天分別對(duì)各組進(jìn)行Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham 組相比，術(shù)后第7 天PND 組老齡小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)（圖1A），目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短（圖1B），穿越平臺(tái)次數(shù)減少（圖1C）（P均＜0.05），表明手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致老齡小鼠術(shù)后圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙。而RIG-I-/-+PND 組與PND 組相比，逃避潛伏期縮短（圖1A）、目標(biāo)象限停留時(shí)間（圖1B）及穿越平臺(tái)次數(shù)增加（圖1C）（P 均＜0.05），該3 項(xiàng)指標(biāo)RIG-I-/-+PND 組和C 組或Sham 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。提示RIG-I 基因沉默對(duì)PND 老齡小鼠的空間記憶學(xué)習(xí)功能障礙有積極的改善作用，能使其接近于正常水平。

圖1 RIG-I 基因沉默后老齡PND 小鼠的Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 RIG-I 基因沉默對(duì)老齡PND 小鼠海馬組織中RIG-I 基因表達(dá)水平的影響

如圖2 所示，利用RT-qPCR 檢測(cè)各組小鼠海馬組織中RIG-I 基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham 組相比，第7 天PND 組中RIG-I 基因水平更高（P<0.001）。且RIG-I 基因在RIG-I-/-+PND 組表達(dá)低于PND 組，該趨勢(shì)在術(shù)后第3 天（P<0.05）和第7 天（P<0.001）的檢測(cè)中均得到了證實(shí)，說明RIG-I-siRNA 注射海馬可以成功沉默PND 小鼠海馬中高表達(dá)的RIG-I 基因。

圖2 RT-qPCR 檢測(cè)RIG-I 基因沉默后PND 小鼠海馬組織中RIG-I mRNA 表達(dá)變化

2.3 RIG-I 基因沉默對(duì)老齡PND 小鼠海馬組織RIG-I 與NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot 對(duì)RIG-I 與NF-κB p65蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第7 天，RIG-I 和NF-κB p65 蛋白水平在PND 組中的表達(dá)均高于Sham 組和對(duì)照組（圖3A 和圖3B），而RIG-I-/-+PND 組則低于PND 組（P 均<0.05），提示PND 可能與RIG-I/NF-κB 通路激活有關(guān)，而RIG-I 基因沉默對(duì)PND 小鼠的影響可能通過對(duì)該信號(hào)通路的抑制來實(shí)現(xiàn)。

圖3 Western blot 檢測(cè)RIG-I 基因沉默后PND 小鼠海馬組織中RIG-I 與NF-κB p65 蛋白水平的變化

2.4 RIG-I 基因沉默對(duì)老齡PND 小鼠海馬組織中炎性因子水平的影響

與Sham 組相比，術(shù)后第3 天起，PND 組小鼠海馬組織中IL-6（圖4A）、TNF-α（圖4B）以及IL-1β（圖4C）水平均升高（P 均<0.05），而RIGI-/-+PND 組與PND 組相比，IL-6、TNF-α 及IL-1β 炎性因子濃度均降低（P 均<0.05）。術(shù)后第7 天的檢測(cè)結(jié)果也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，PND 組小鼠炎性因子比Sham 組小鼠升高，而與PND 組比較RIG-I-/-+PND 組降低（P<0.05）。以上結(jié)果表明，海馬注射RIG-I-siRNA 能夠改善手術(shù)后海馬組織的炎性反應(yīng)。

圖4 ELISA 檢測(cè)RIG-I 基因沉默后PND 小鼠海馬組織中炎性因子水平的變化

3 討論

PND 是老齡患者在麻醉和手術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，以各種形式的認(rèn)知功能障礙為特征。盡管其發(fā)病的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，但神經(jīng)炎癥已被證明是最主要的原因之一[1]。RIG-I/NF-κB信號(hào)通路作為神經(jīng)炎癥的重要調(diào)控途徑[9]，其在PND 發(fā)生發(fā)展中的直接作用卻在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究報(bào)道了抑制RIG-I/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)PND 小鼠的認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)炎癥水平有明顯的改善作用。

PND 臨床前研究依賴于良好的動(dòng)物模型。目前PND 模型的建立雖然有多種方法可以實(shí)現(xiàn)，但沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。常用的造模方法主要包括肝部分切除術(shù)、脾切除術(shù)、腎切除術(shù)、剖腹探查術(shù)、單側(cè)頸動(dòng)脈暴露手術(shù)、LPS 誘導(dǎo)建模、單純麻醉因素建模及脛骨骨折術(shù)[10]。其中，麻醉暴露和手術(shù)引起的神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是認(rèn)知能力下降的主要原因。在通過手術(shù)方式造模的方法中，雖然特定的器官切除術(shù)和剖腹探查術(shù)都被證明可以成功誘導(dǎo)PND，但前者可能導(dǎo)致器官功能失代償[11]，后者可能導(dǎo)致腸道菌群平衡失衡[12]，從而影響PND形成機(jī)制的準(zhǔn)確判斷。而脛骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定手術(shù)既能通過形成創(chuàng)傷，增加全身壓力和釋放炎性因子，從而作用于認(rèn)知功能，又可避免對(duì)機(jī)體整體功能的損害，且術(shù)后實(shí)驗(yàn)對(duì)象生存率較高，因此在本實(shí)驗(yàn)中被采用[13]。本研究在4%水合氯醛麻醉下行脛骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)后，第7 天可發(fā)現(xiàn)小鼠PND 模型制備成功，為脛骨骨折術(shù)在PND 建模的可行性方面提供了證據(jù)。但據(jù)報(bào)道[14]，對(duì)C57BL/6 小鼠行脛骨髓內(nèi)釘置入術(shù)后，第2 天進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠活動(dòng)及參考記憶未發(fā)生改變，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有一定差異。本研究術(shù)后第1 天，水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，雖然目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但PND 小鼠術(shù)后的逃避潛伏期相比空白組延長(zhǎng)，這可能與動(dòng)物模型月齡有關(guān)。相比本實(shí)驗(yàn)使用的老齡小鼠，在過往實(shí)驗(yàn)中使用的2 月齡小鼠，PND 進(jìn)程發(fā)生了推遲，這也證明了年齡與其相關(guān)，提示在PND 建模應(yīng)用過程中需要考慮到年齡的因素。

RIG-I 是一種由DDX58 基因編碼的胞質(zhì)模式識(shí)別受體，通常被認(rèn)為是先天免疫中用于識(shí)別已感染病毒細(xì)胞的重要分子，存在于大多數(shù)細(xì)胞中，通過IFN1 的激活促進(jìn)先天免疫，幫助激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[15]。在不同的微環(huán)境中，它具有除病毒識(shí)別之外的更多功能，包括在癌癥中誘導(dǎo)免疫原性腫瘤細(xì)胞死亡和刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]，以及被證明在阿爾茨海默病患者的星形膠質(zhì)細(xì)胞中與淀粉樣蛋白前體蛋白和淀粉樣蛋白-β 的表達(dá)增加有關(guān)[17]。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管手術(shù)成功誘發(fā)了PND，但RIG-I 基因沉默的PND 小鼠的術(shù)后空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。進(jìn)一步檢測(cè)了其下游相關(guān)信號(hào)因子的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PND 的發(fā)生發(fā)展與RIG-I 和NF-κB p65 呈正相關(guān)，而RIG-I 基因的沉默一定程度上抑制了該通路的激活，且抑制了炎性因子的釋放，從而通過神經(jīng)炎癥的緩解改善神經(jīng)損傷及認(rèn)知功能。NF-κB 代表的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)節(jié)參與炎性反應(yīng)過程中的大量基因，包括NFκB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB 和c-Rel 共5 個(gè)成員，它們通過結(jié)合特定的DNA 元件和κB 增強(qiáng)子形成二聚體來介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，除了介導(dǎo)先天免疫細(xì)胞中各種促炎基因激活外，還調(diào)節(jié)炎性T 細(xì)胞的功能[18]。盡管潛在機(jī)制還未完全闡明，但RIG-I 已被多項(xiàng)研究證明可作為NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)劑，對(duì)于調(diào)節(jié)NF-κB活性和蛋白質(zhì)翻譯有重要作用[19]，本研究中，RIG-I抑制的小鼠中發(fā)現(xiàn)的p65 蛋白下調(diào)也證明了這一觀點(diǎn)。其原因是p50/p65 二聚體是RIG-I/NFκB 通路經(jīng)典途徑激活的最豐富的形式，它的介導(dǎo)作用通常由IKK 的NEMO 依賴性激活觸發(fā)，隨后IκB 蛋白的磷酸化及泛素化引起蛋白酶體降解釋放p65。p65/輸入蛋白-β 復(fù)合物通過Ran-GTP 蛋白轉(zhuǎn)移到核內(nèi)后解離成游離p65，通過結(jié)合目標(biāo)基因的特定核苷酸序列來控制轉(zhuǎn)錄程序，其蛋白表達(dá)與NF-κB 的活化程度呈正相關(guān)[20]。本研究中，小鼠通過手術(shù)造成的創(chuàng)傷和全身壓力源激活RIG-I/NF-κB 在內(nèi)的一系列促炎相關(guān)通路擴(kuò)大了炎性反應(yīng)，共同破壞血腦屏障導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)了PND，但這一結(jié)局由于RIG-I/NFκB 通路的抑制而逆轉(zhuǎn)。Kan 等[21]也報(bào)道過在NFκB 信號(hào)通路阻斷劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯可在臨床前PND 模型中改善認(rèn)知表現(xiàn)。

既往研究[22]發(fā)現(xiàn)，手術(shù)創(chuàng)傷的全身炎癥可通過損傷相關(guān)分子模式、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，進(jìn)一步誘導(dǎo)中樞神經(jīng)膠質(zhì)的激活。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活可促使它們分泌炎性細(xì)胞因子[23]。海馬CA1 區(qū)IL-1β 和TNF-α 的分泌與多種信號(hào)通路有關(guān)，例如，CCL2/CCR2 信號(hào)通路[24]，而本研究證實(shí)，RIG-I 也通過激活NF-κB 參與其中。另外有研究[25]顯示，PND大鼠模型中，NF-κB 信號(hào)通路通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致IL-6、IL-1β 和TNF-α 上調(diào)和認(rèn)知功能障礙，這也與本研究的結(jié)果一致，說明RIG-I 基因沉默可以通過下調(diào)NF-κB 而抑制這些炎性因子表達(dá)。這些細(xì)胞因子在神經(jīng)炎癥的發(fā)展過程中，導(dǎo)致突觸可塑性受損，進(jìn)一步引起認(rèn)知功能障礙，但可以通過抑制RIG-I 來改善其發(fā)生水平，從而為調(diào)控認(rèn)知功能障礙提供靶點(diǎn)。但這些炎性因子特異性很低，與其他疾病同樣有關(guān)[26]，無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)PND，所以何種細(xì)胞因子組合對(duì)于PND 預(yù)測(cè)具有更好的敏感性和特異性仍然有待探究。

綜上所述，小鼠海馬組織RIG-I 基因沉默可以通過下調(diào)老齡PND 小鼠海馬組織RIG-I 的表達(dá)和抑制下游NF-κB p65 的激活，降低IL-6、IL-1β 和TNF-α 促炎因子水平，抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)，從而改善脛骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)引起的老齡大鼠認(rèn)知功能障礙。抑制RIG-I 的表達(dá)可能為防治PND 提供新的思路和靶點(diǎn)。