黃秋顏 李 斌 林曉蓉 魯 森 陳忠正 張媛媛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642)

可可茶(CamelliaptilophyllaChang),又稱“南昆山毛葉茶”,是生長(zhǎng)在廣東省惠州市南昆山的珍稀茶樹[1],該茶樹不含或僅含不到0.1%的咖啡堿,可可堿含量高達(dá)3%～7%。研究證實(shí),可可茶比傳統(tǒng)茶樹[Camelliasinensis(L). O. Kuntze]具有更突出的抗氧化[2-3]、抗炎[4]、抗癌[5]等功效。進(jìn)一步理化分析發(fā)現(xiàn),可可茶不僅具有高可可堿、低咖啡堿的生物堿組成,還具有高茶多酚、高反式/低順式兒茶素、高花青素、含有多種特殊多酚等理化特性[6-7]。茶多酚是可可茶最重要的一類功能活性組分,但國(guó)內(nèi)外原以高效液相色譜結(jié)合常規(guī)茶多酚單體標(biāo)準(zhǔn)品的分析方法,難以更全面、系統(tǒng)揭示可可茶的特殊多酚組成,制約了其功能特性的廣泛研究。

超高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Ultra performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UPLC-HRMS)具有高分離效能、高靈敏度和高分辨率等優(yōu)勢(shì),能夠快速、全面展示天然多組分復(fù)雜體系的理化組成特性,已被用于分析普安茶[8]、黃金芽[9]等特色茶樹的理化組成特性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年發(fā)展起來的一種藥物功能預(yù)測(cè)手段,主要基于質(zhì)譜、核磁等技術(shù)解析的藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)信息,借助計(jì)算機(jī)和數(shù)據(jù)庫,通過對(duì)現(xiàn)有基因、靶點(diǎn)蛋白、疾病和藥物等信息的分析處理和模擬預(yù)測(cè),構(gòu)建藥物、靶點(diǎn)和疾病的關(guān)系網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而利用算法分析和預(yù)測(cè)藥物功效及活性組分、作用機(jī)制[10],目前已成功用于預(yù)測(cè)綠茶[11]、藤茶[12]、苦丁茶[13]等植物的神經(jīng)治療和抗癌等功能特性。這些技術(shù)進(jìn)展為系統(tǒng)揭示可可茶的特殊多酚組成,并在此基礎(chǔ)上快速探究其健康功效,提供了新的平臺(tái)和路徑。

基于此,研究擬以可可茶的多酚粗提物為主要研究材料,采用UPLC-HRMS技術(shù)鑒定其組成,根據(jù)各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu),采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段預(yù)測(cè)其功能活性;根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果選擇排名第三的降血糖活性,以云南大葉種綠茶多酚粗提物為對(duì)照,利用α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶初步驗(yàn)證其體外降血糖活性;通過GO功能富集和KEGG通路富集預(yù)測(cè)其降血糖作用機(jī)制,通過構(gòu)建“組分—疾病—通路”網(wǎng)絡(luò)篩選核心降血糖活性組分,并利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證各組分與兩種淀粉水解酶的結(jié)合能力,探討可可茶多酚組分的降血糖活性及作用機(jī)制,為進(jìn)一步分析可可茶的獨(dú)特理化組成、深入揭示這一珍稀茶樹資源的功能特性提供理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

可可茶:1芽2～3葉,采自廣東省惠州市龍門縣南昆山,鮮葉經(jīng)微波殺青、干燥加工成干茶;

云南大葉種綠茶:一級(jí),廣東省華海糖業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2 試劑

α-葡萄糖苷酶(酵母,比活力100 U/mg)、α-淀粉酶(豬胰腺,比活力14 U/mg)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG):上海源葉生物科技有限公司;

氯化鈉、可溶性淀粉、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

純水機(jī):Milli-Q Integral 3型,德國(guó)Merck-Millipore公司;

電子分析天平:AL204型,梅特勒托利多儀器有限公司;

冷凍干燥機(jī):Alpha 1-2 LD plus型,德國(guó)Martin Christ公司;

酶標(biāo)儀:VersaMax型,美國(guó)Molecular Devices公司;

電熱恒溫水浴鍋:HWS-24型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

冷凍高速離心機(jī):Centrifuge 5804R型,德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 兩品種綠茶多酚的提取制備 參考曠小珊等[14]的方法,以可可茶和云南大葉種綠茶為原料,采用乙醇提取、乙酸乙酯萃取制備茶多酚粗提物。

1.3.2 可可茶多酚的組成分析 以可可茶多酚粗提物為研究材料,稱取2 mg可可茶凍干粉,采用1 mL甲醇溶解,利用Agilent 654UHD Q-TOF超高壓液相色譜/四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合Agilent SB-Aq C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm),以0.1%甲酸—水(A)和0.1%甲酸—乙腈(B)為流動(dòng)相,流速0.4 mL/min,柱溫50 ℃,進(jìn)樣量3 μL。線性梯度洗脫程序?yàn)?0 min,5% B;0.5 min,5% B;18 min,40% B;20 min,90% B;20.9 min,90% B;21 min,5% B;25 min,5% B。分別采用正、負(fù)離子模式掃描,掃描范圍為70～1 000(m/z)。利用Amdis軟件處理原始數(shù)據(jù),將得到的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分別與茶葉自建數(shù)據(jù)庫、NIST、mzCloud和HMDB數(shù)據(jù)庫中的化合物進(jìn)行匹配確認(rèn)。

1.3.3 可可茶多酚的功能預(yù)測(cè) 參考肖夢(mèng)君等[15]的方法,先鑒定可可茶多酚組分的化學(xué)結(jié)構(gòu),再通過PubChem、SIWSS數(shù)據(jù)庫和Metascape平臺(tái)預(yù)測(cè)其功能活性。

1.3.4 可可茶多酚的降血糖活性預(yù)測(cè) 根據(jù)1.3.3的預(yù)測(cè)結(jié)果,以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)為關(guān)鍵詞,參考梁林盼等[16]的方法,通過GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫、OMIM孟德爾遺傳代謝數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫收集T2DM的相關(guān)靶點(diǎn),通過繪制韋恩圖篩選可可茶多酚組分的潛在降血糖靶點(diǎn),并通過STRING數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 3.8.0、Prism等軟件對(duì)潛在的降血糖靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析、GO功能富集和KEGG通路富集。同時(shí),參考王騰飛等[17]的方法,建立可可茶多酚降血糖的“組分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò),根據(jù)拓?fù)鋮?shù)、度值、介數(shù)中位數(shù)、緊密度等指標(biāo),篩選可可茶的核心降血糖多酚組分。

1.3.5 兩品種綠茶多酚的體外降血糖活性評(píng)價(jià)

(1)α-葡萄糖苷酶活性抑制率:參考Deng等[18]的方法,稍作修改。采用pH 6.8、0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)分別配制底物PNPG溶液(2.5 mmol/L)和α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL),將可可茶和云南大葉種綠茶的茶多酚粗提物用一級(jí)水溶解并稀釋配成0.25,0.50,1.00,2.00,4.00 μg/mL系列濃度的樣液,分別吸取50 μL不同濃度待測(cè)液于96孔板中,再加入50 μLα-葡萄糖苷酶溶液,于37 ℃孵育10 min,加入50 μL的PNPG溶液,37 ℃反應(yīng)30 min,再加入50 μL 0.2 mmol/L的Na2CO3終止反應(yīng),于酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定其吸光度(A1)。以阿卡波糖代替綠茶多酚作為陽性對(duì)照,以等體積PBS代替綠茶提取物作為空白對(duì)照(其吸光度記為A0),加入綠茶多酚并以等體積PBS取代α-葡萄糖苷酶溶液作為樣品空白(其吸光度記為A2)。根據(jù)式(1)計(jì)算兩品種綠茶多酚和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(1)

式中:

R——抑制率,%;

A0——以PBS代替代測(cè)樣品的吸光值;

A1——經(jīng)過待測(cè)樣品處理的吸光值;

A2——以PBS代替α-淀粉酶溶液的吸光值。

(2)α-淀粉酶活性抑制率:參照Deng等[18]的方法并略作修改。采用pH 6.8、0.1 mol/L的PBS分別配制1%淀粉溶液與α-淀粉酶溶液(2 U/mL),綠茶多酚粗提物用一級(jí)水溶解并稀釋配成不同濃度(0.125,0.250,0.500,1.000,2.000 mg/mL)的樣液,DNS試劑參考趙凱等[19]的方法配制。取5 mL試管,分別加入待測(cè)樣液300 μL和α-淀粉酶溶液400 μL,混勻后,于37 ℃孵育10 min后,加入1%可溶性淀粉溶液300 μL,37 ℃反應(yīng)15 min。最后,加入2 mL DNS試劑顯色,立即煮沸10 min終止反應(yīng),冷卻后于酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定其吸光度(A1)。以阿卡波糖為陽性對(duì)照,以PBS為空白對(duì)照(其吸光度記為A0),以等體積PBS代替α-淀粉酶溶液分析樣液作為樣品空白(其吸光度記為A2)。根據(jù)式(1)計(jì)算兩品種綠茶多酚和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的體外抑制率。

1.3.6 可可茶多酚的核心降血糖組分驗(yàn)證 參考沈荷玉等[20]的方法,采用分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合Pymol軟件分析1.3.4預(yù)測(cè)的可可茶核心降血糖多酚組分與α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的相互作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)性分析,小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05),圖表數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 9.0計(jì)算各組分對(duì)兩種淀粉水解酶的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 可可茶多酚組分鑒定

采用UPLC-HRMS技術(shù)分別在正、負(fù)離子模式下分析可可茶的多酚粗提物的組成,其總離子流圖見圖1。通過對(duì)比各數(shù)據(jù)庫中的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),共鑒定出130個(gè)組分,包括GCG、EGCG、CG、ECG、GC、EGC、C、EC等8種兒茶素單體,槲皮素、蘆丁、香豆素、楊梅素等黃酮及黃酮苷類,原花青素A1、A2、B2等花青素和花白素類,沒食子酸、咖啡酸、綠原酸等酚酸和縮酚酸類,以及傳統(tǒng)茶樹不含或含量極少的兒茶素-3,5-二沒食子酸酯和1,2,4,6-四沒食子酰葡萄糖等多酚組分。與傳統(tǒng)高效液相色譜法受限于標(biāo)準(zhǔn)品等僅能檢測(cè)8種兒茶素單體、沒食子酸等組分相比,高分辨質(zhì)譜技術(shù)從可可茶的多酚粗提物中鑒定出了更豐富的多酚組成,為進(jìn)一步挖掘可可茶及其多酚組分的功能特性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 可可茶多酚組分功能活性預(yù)測(cè)

在利用高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定可可茶多酚組分化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,研究采用基因注釋工具M(jìn)etascape對(duì)130種組分的潛在作用靶點(diǎn)做DisGeNET分析,計(jì)算靶點(diǎn)聚集在每個(gè)疾病條目中的數(shù)目和顯著性,以-logP值作熱圖分析,排名前20的疾病類型如圖2所示。其中排名前3的疾病類型為神經(jīng)性疾病、記憶障礙和糖尿病。目前,糖尿病已成為繼癌癥、心血管疾病之后的第三大類非傳染性疾病,傳統(tǒng)茶樹的提取物及其茶多酚、茶多糖等已被證實(shí)能夠有效抑制淀粉水解酶、改善機(jī)體胰島素抵抗[21],具有較強(qiáng)的降血糖活性,但目前尚未系統(tǒng)、深入探究可可茶多酚的降血糖活性。

圖2 可可茶多酚組分的疾病富集分析

2.3 可可茶多酚體外降血糖活性評(píng)價(jià)

在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)可可茶多酚的降血糖活性基礎(chǔ)上,以可可茶和云南大葉種綠茶的多酚粗提物為研究材料,比較分析兩品種綠茶多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率及IC50,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,兩種綠茶多酚對(duì)兩種淀粉水解酶的活性均有顯著抑制作用,隨其質(zhì)量濃度增大,抑制率升高,且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)于α-淀粉酶;其中,可可茶多酚對(duì)兩種淀粉水解酶活性的抑制作用顯著強(qiáng)于云南大葉種,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)4 μg/mL時(shí),其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用與陽性藥物阿卡波糖相當(dāng),當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/mL時(shí),其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性均強(qiáng)于阿卡波糖。這一結(jié)果表明,可可茶多酚比云南大葉種綠茶多酚具有更強(qiáng)的體外降血糖作用,但其核心活性組分和作用機(jī)制尚不明確。

圖3 兩種綠茶多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率及半抑制濃度IC50

2.4 可可茶多酚降血糖作用機(jī)制預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步探索可可茶多酚發(fā)揮降血糖活性的分子機(jī)制,利用GeneCards、OMIM、DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫篩選獲得4 820個(gè)T2DM的候選靶點(diǎn),采用Venny分析潛在作用靶點(diǎn)與糖尿病相關(guān)作用靶點(diǎn)的交集,獲得了367個(gè)可可茶多酚的潛在降血糖靶點(diǎn),見圖4(a)。利用String平臺(tái)生成這些靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)圖含有367個(gè)節(jié)點(diǎn)、13 758條邊,平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)有37條邊,靶點(diǎn)之間有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性,見圖4(b)。通過比較緊密度、度值和平均最短路徑,篩選出GAPDH、AKT1、TP53、ALB、IL6、TNF 6個(gè)可可茶多酚的降血糖關(guān)鍵作用靶點(diǎn)(表1)。

表1 可可茶多酚關(guān)鍵降血糖靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖4 可可茶多酚潛在降血糖靶點(diǎn)的韋恩圖及PPI網(wǎng)絡(luò)

進(jìn)一步對(duì)可可茶多酚的367個(gè)潛在降血糖靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析。GO分析共富集了3 836個(gè)條目,其中3 287個(gè)與生物過程相關(guān),190個(gè)與細(xì)胞成分相關(guān),359個(gè)與分子功能相關(guān)。根據(jù)P值<0.01,選取生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)富集結(jié)果排名前10的條目進(jìn)行可視化處理,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,可可茶多酚的降血糖靶點(diǎn)主要參與絲裂原活化蛋白激酶和氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程,存在于膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔等細(xì)胞成分,行使蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合活性、絲氨酸水解酶活性等分子功能。KEGG分析共富集了119個(gè)信號(hào)通路,主要涉及PI3K-AKT、刺激神經(jīng)組織的交互通路、癌癥的蛋白聚糖通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈硬化等途徑。其中,PI3K/AKT信號(hào)通路富集得分最高,作為經(jīng)典的胰島素信號(hào)通路,其在調(diào)節(jié)糖原合成和糖異生中起關(guān)鍵作用[22],同時(shí)也是多酚類化合物或富含多酚的植物提取物發(fā)揮降血糖功效的關(guān)鍵通路[23-25]。

圖5 可可茶多酚潛在降血糖靶點(diǎn)的GO功能富集和KEGG通路富集

上述研究結(jié)果表明:可可茶多酚可能通過作用于GAPDH、AKT1、TP53、ALB、IL6、TNF等多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮降血糖活性,涉及絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶等多種生物功能及胰島素抵抗、炎癥、癌癥等多條信號(hào)通路,具有多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

2.5 可可茶多酚核心降血糖組分預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

為進(jìn)一步篩選可可茶多酚粗提物的核心降血糖活性組分,研究將上述可可茶多酚組分、潛在降血糖靶點(diǎn)及KEGG富集分析中前20條通路導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建可可茶多酚的“組分—T2DM—通路”網(wǎng)絡(luò)圖(圖6),并以度值、平均最短路徑、介值等拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)綜合評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵程度,結(jié)果如表2所示。由表2可知:排名前10的金合歡素、草質(zhì)素、山核桃素、花青素、木犀草素、楊梅素、山萘酚、柚皮素、山藥素Ⅲ和山奈素可能是可可茶多酚的核心降血糖組分。其中,花青素、柚皮素、木犀草素、楊梅素和山柰酚等已被證實(shí)能夠減輕糖尿病小鼠中胰島B細(xì)胞的損傷,促進(jìn)肝糖原和胰島素的合成、抑制體外淀粉消化酶活性,調(diào)控機(jī)體內(nèi)的血糖水平[26-27]。

表2 可可茶多酚排名前10的降血糖活性組分的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖6 可可茶多酚的“組分—T2DM—通路”網(wǎng)絡(luò)

研究以阿卡波糖為陽性對(duì)照,將上述篩選的10種多酚組分與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶進(jìn)行分子對(duì)接,以驗(yàn)證10種多酚組分的降血糖活性,結(jié)果如圖7所示。10種可可茶核心降血糖多酚組分與α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的對(duì)接結(jié)合能均小于-21 kJ/mol,說明各組分與兩種淀粉水解酶具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。進(jìn)而,利用PyMol軟件對(duì)山核桃素、花青素、楊梅素等8組對(duì)接結(jié)合能較低的分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化(圖8),發(fā)現(xiàn)8種多酚組分均能通過氫鍵與兩種淀粉水解酶分子中不同位置的氨基酸殘基結(jié)合。這些結(jié)果提示,山核桃素、花青素、楊梅素等10種多酚組分,可能是可可茶多酚中發(fā)揮降血糖活性的核心組分。

圖7 可可茶核心降血糖多酚組分與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能

圖8 可可茶核心降血糖多酚組分與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶分子對(duì)接可視化圖

3 結(jié)論

研究利用UPLC-HRMS技術(shù),從可可茶多酚粗提物中鑒定出130種組分;采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合體外α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)可可茶比云南大葉種綠茶多酚具有更強(qiáng)的降血糖活性;經(jīng)GO功能富集和KEGG通路富集,預(yù)測(cè)其通過GAPDH、AKT1、TP53、ALB、IL6、TNF 6個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和PI3K-AKT1等主要信號(hào)通路發(fā)揮降血糖活性;通過構(gòu)建“組分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)、結(jié)合各組分與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的分子對(duì)接模擬,篩選出山核桃素、花青素等10種核心降血糖組分。研究結(jié)果表明,可可茶多酚粗提物通過多組分、多靶點(diǎn)、多通路共同發(fā)揮降血糖功效,這為未來進(jìn)一步利用細(xì)胞、動(dòng)物等模型靶向深入研究可可茶的降血糖活性及作用機(jī)制提供了相關(guān)的研究路線。