許珂宇 夏利偉 邢克宇 程云輝,2 許 宙

(1. 長沙理工大學食品與生物工程學院,湖南 長沙 410114;2. 齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院,山東 濟南 250353)

微生物蛋白酶是食品工業(yè)中的主要酶類之一,占整個酶類市場的65%[1-3]。然而,微生物生產蛋白酶仍存在許多問題,如菌種培育操作復雜、環(huán)境要求嚴格、純化過程繁瑣、生產成本高昂等。此外,在貯藏和應用過程中,pH值和溫度條件更是嚴重限制了微生物蛋白酶在工業(yè)中的發(fā)展[4]。由于納米酶不具有蛋白質結構,所以各種環(huán)境因素(如pH值和溫度)對納米酶的催化活性中心造成的破壞性較小。因此,納米酶具有高選擇性[5]、穩(wěn)定性和潛在可回收性[6-7],可以降低食品工業(yè)中酶催化的經濟成本[8]。

蛋白水解酶納米酶是一種具有蛋白水解酶活性的納米酶,已在寡肽和蛋白質水解過程中顯示出高選擇性[9-10]。然而,這些蛋白水解酶納米酶的活性相對較低,嚴重阻礙了蛋白水解酶納米酶的實際應用。

金屬有機框架(MOFs)是一種新興的多孔納米材料[11-12],是由金屬離子或金屬團簇和多種有機配體通過配位構建的[13-14]。因此,通過改變金屬團簇和有機配體類型,MOFs的結構和性能(如納米級孔隙率、高表面積、良好的熱穩(wěn)定性和均勻的空腔結構)可以被調整。目前,Zr-MOFs作為催化劑已被用于肽鍵的水解[15-17]。然而,大多數Zr-MOFs中金屬離子與有機配體完全配位,這種微觀結構阻礙了Zr-MOFs對肽的吸附,嚴重影響了Zr-MOFs的催化性能。有研究[18-19]表明,MOFs的催化性能可以通過改變缺陷而被提高,而不同的缺陷可以通過調整配位不飽和金屬位點(CUSs)來實現(xiàn)。最常見的CUSs調控方法是在MOFs合成過程中使用不同的有機配體[20]。

研究擬通過簡便的水熱法制備3種具有不同配位不飽和位點的Zr-MOFs納米酶(12-配位Zr-MOF、6-配位Zr-MOF和4-配位Zr-MOF),利用掃描電子顯微鏡(SEM)、動態(tài)光散射(DLS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和X射線衍射(XRD)來表征Zr-MOF納米酶的特征。以雙甘肽(Gly-Gly)水解率為指標,評估3種Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性,并于食品工業(yè)中3種常見的蛋白質(大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白)中驗證Zr-MOFs納米酶的實際應用能力,以期為食品工業(yè)中蛋白水解提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

四氯化鋯(ZrCl4)、八水合二氯氧化鋯(ZrOCl28H2O)、對苯二甲酸(BDC)、均苯三甲酸(H3BTC)、[1,1′:4′,1″]三聯(lián)苯-3,3″,5,5″-四甲酸(TPTC):北京百靈威科技有限公司;

大豆分離蛋白、酪蛋白、魚糜蛋白、N,N-二乙基甲酰胺(DEF)、苯異硫氰酸酯(PITC):上海麥克林科技有限公司;

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水乙醇、溴化鉀、甲醇、甲酸、乙腈、三乙胺、正己烷、醋酸:分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

管式爐:GSL-1600X型,鄭州博科儀器公司;

電子分析天平:FA2004N型,上海精密科學儀器有限公司;

數顯恒溫磁力攪拌器:85-2型,天津市泰斯特儀器有限公司;

臺式高速離心機:TG16-WS型,湖南湘儀離心機儀器有限公司;

電熱恒溫鼓風干燥箱:DHG-9246A型,上海精宏實驗設備有限公司;

高效液相色譜:E2695型,美國沃特世公司;

激光粒度儀:Zetasizer nano型,英國Malvern公司;

掃描電子顯微鏡:JEOLJEM-2100型,日本電子株式會社;

傅立葉紅外光譜儀:Nicolet6700型,美國Thermo Nicolet公司;

X-射線衍射儀:smartlab9型,日本理學公司。

1.2 方法

1.2.1 Zr-MOFs納米酶的合成

(1) 12-配位Zr-MOF的制備:將60.6 mg ZrCl4和0.423 g BDC溶于15 mL DMF和0.447 mL冰醋酸混合溶液中,置于聚四氟乙烯內膽(20 mL)中,120 ℃加熱24 h。冷卻,8 017×g離心15 min。將得到的產物分別用DMF和甲醇洗滌3次,后續(xù)試驗前,于室溫下真空活化12-配位Zr-MOF[14]。

(2) 6-配位Zr-MOF的制備:將40.3 mg ZrOCl2·8H2O和26.2 mg H3BTC溶于5 mL DMF和5 mL甲酸混合溶液中,置于聚四氟乙烯內膽(20 mL)中,130 ℃加熱48 h。冷卻,12 333×g離心10 min。將得到的產物用DMF和乙醇分別洗滌3次,并于150 ℃活化20 h后進行后續(xù)試驗[21]。

(3) 4-配位Zr-MOF的制備:將42.8 mg ZrOCl2·8H2O溶于4 mL DEF和2.5 mL甲酸混合溶液中,置于聚四氟乙烯內膽(20 mL)中,80 ℃加熱1 h,冷卻,加入13.6 mg TPTC和200 μL去離子水,超聲處理20 min,于130 ℃加熱48 h,14 800×g離心10 min,用DMF和丙酮洗滌3次,并于80 ℃真空干燥[22]。

1.2.2 Zr-MOFs納米酶的表征 使用Malvern Zetasizer Nano-ZS測量Zr-MOFs的DLS,通過SEM觀察Zr-MOFs的形貌,使用FTIR分析Zr-MOFs的化學結構,通過XRD獲取Zr-MOFs的晶體結構信息,并通過高效液相色譜法(HPLC)測定Gly-Gly和Gly含量。

1.2.3 Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性分析

(1) 雙甘肽的水解:將2.0 μmol Zr-MOFs和50 μL Gly-Gly溶液(40 mmol/L)加入到950 μL 超純水中,60 ℃攪拌。Gly-Gly被Zr-MOFs水解后,混合物于14 800×g離心20 min以去除Zr-MOFs[23],通過HPLC檢測水解產物,并通過Gly產率計算Zr-MOF水解Gly-Gly的催化速率。

(2) 蛋白水解酶活性測定:以雙甘肽(Gly-Gly)水解率為指標,評估Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性。將200 μL樣品溶液、100 μL三乙胺乙腈溶液和100 μL PITC乙腈溶液混合,室溫放置1 h,向混合物中加入400 μL正己烷,室溫靜置10 min,過濾,濾液用800 μL超純水稀釋。流動相A為0.1 mol/L乙酸—乙酸鈉緩沖溶液(pH 6.5);流動相B為乙腈;洗脫流速1.0 mL/min;檢測波長254 nm;柱溫40 ℃;上樣量10 μL。梯度洗脫條件:0～7 min,100% A,7～15 min,85% A、15～18 min,100% A。

(3) Zr-MOFs納米酶(6-配位Zr-MOF)的異質性:將2.0 μmol 6-配位Zr-MOFs和50 μL Gly-Gly溶液(40 mmol/L)加入到950 μL水中,于60 ℃孵育催化3 h,離心去除6-配位Zr-MOF,并使剩余溶液進一步反應。

(4) Zr-MOFs納米酶(6-配位Zr-MOF)的可重復使用性:采用溶劑洗滌法進行再生[23]。150 ℃真空條件下,將6-配位Zr-MOF活化24 h,繼續(xù)用于催化反應。

(5) Zr-MOFs納米酶(6-配位Zr-MOF)對3種蛋白質的水解:將大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白分別與6-配位Zr-MOF于60 ℃孵育。于不同的時間間隔內,采用SDS-PAGE分析3種蛋白質的分子量和水解產物。分離的條帶用Kemas Brilliant Blue R-250染色。

1.2.4 數據分析 每組數據3次重復,利用Origin 2017軟件處理數據與作圖。

2 結果與分析

2.1 Zr-MOFs納米酶的表征

在聚四氟乙烯內膽中,使用不同的有機羧酸作為連接劑,與Zr團簇配位連接,分別合成了3種Zr-MOFs納米酶,即12/6/4-配位的Zr-MOFs納米酶(圖1)。

圖1 不同配位數的Zr-MOFs結構示意圖

由圖2和圖3可知,12-配位Zr-MOF納米酶是一種具有光滑表面的規(guī)則球體,直徑為100 nm;6-配位Zr-MOF納米酶是一種規(guī)則的八面體納米材料,直徑為2 μm;4-配位Zr-MOF納米酶呈圓形,直徑為150 nm,與文獻[24-25]的結果一致。因此,3種Zr-MOFs被成功合成。

圖2 不同配位數的Zr-MOFs的水合粒徑

圖3 不同配位數的Zr-MOFs的SEM圖像

圖4 不同配位數的Zr-MOFs的FTIR圖像

圖5 不同配位數的Zr-MOFs的XRD圖像

2.2 Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性

由圖6(a)可知,6-配位Zr-MOF和4-配位Zr-MOF納米酶的蛋白水解酶活性明顯高于12-配位Zr-MOF的,6-配位Zr-MOF對雙甘肽的水解率達52%,而4-配位Zr-MOF和12-配位Zr-MOF的水解率分別為6.15%,45.8%。天然蛋白酶通過Zn2+裂解肽鏈而水解雙甘肽[31-32]。因此,Zr-MOF的活性中心被認為是CUSs。CUSs模擬了Zn2+在天然鋅金屬蛋白酶中的作用,更多的CUSs將有助于提高Zr-MOF納米酶的水解性能。然而,4-配位Zr-MOF納米酶的催化活性低于6-配位Zr-MOF納米酶的,是因為4-配位Zr-MOF納米酶的小孔尺寸阻礙了雙甘肽與CUSs的結合[22,33]。綜上,6-配位Zr-MOF納米酶對雙甘肽的催化活性最高。

圖6 Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性

6-配位Zr-MOF納米酶水解雙甘肽的一階反應速率常數為2.64×10-5s-1,在沒有Zr-MOF納米酶存在的情況下,雙甘肽的水解恒定速率為7.4×10-9s-1[34],表明使用6-配位Zr-MOF納米酶時,雙甘肽的水解反應速率增加了2.63×103倍,說明6-配位Zr-MOF對雙甘肽具有較好的水解性能。

由圖6(b)可知,當從水解體系中去除6-配位Zr-MOF納米酶后,雙甘肽的水解率幾乎不變,表明雙甘肽不再被水解。該測試異質性的熱過濾試驗表明,在雙甘肽水解體系中具有催化活性的是6-配位Zr-MOF納米酶。

由圖6(c)可知,以6-配位Zr-MOF納米酶含量為橫坐標,一階反應速率常數為縱坐標繪制曲線,并由偽Michaelis-Menten模型[式(1)]進行擬合。6-配位Zr-MOF納米酶對雙甘肽的水解反應符合Michaelis方程。當6-配位Zr-MOF納米酶含量為4.0 μmol時,水解雙甘肽的速率常數達到最大為7.4×10-9s-1,說明使用4.0 μmol 6-配位Zr-MOF可以實現(xiàn)良好的水解效果。

(1)

式中:

kobs——一階反應速率常數;

kmax——最大反應速率常數;

[MOF]——MOF催化劑的濃度,mol/L;

KM——米氏常數。

由圖6(d)可知,在重復使用5次后,Gly-Gly的轉化率未明顯下降,說明6-配位Zr-MOF的水解活性未受到較大影響,表明6-配位Zr-MOF具有較高的穩(wěn)定性,在實際應用中具有較大的重復利用潛力。

2.3 Zr-MOF納米酶水解蛋白質

由圖7可知,隨著水解時間的延長,3種蛋白的條帶逐漸變淺,表明Zr-MOF納米酶可以同時水解3種蛋白質,展現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性。Zr-MOF納米酶對大豆蛋白和魚糜蛋白顯示出較高的催化活性,對酪蛋白的催化活性較低。如圖7(a)所示,水解過程中沒有低分子量(<14.4 kDa)的條帶,可能是由于Zr-MOF納米酶將大豆蛋白的長肽水解為短肽。由于短鏈多肽容易從SDS-PAGE凝膠中漏出,所以無法被觀察到。由圖7(b)可知,隨著水解時間的延長,大豆蛋白的長肽條帶逐漸變淺,短肽條帶逐漸變深,說明Zr-MOF納米酶對魚糜蛋白具有較好的水解效果。由圖7(c)可知,酪蛋白的長肽條帶逐漸變淺,短肽條帶逐漸變深,但變化不明顯,表明Zr-MOF納米酶可以催化大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白水解,展現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性,且對大豆蛋白和魚糜蛋白顯示出較高的催化活性。

圖7 6-配位Zr-MOF水解3種蛋白質的SDS-PAGE圖

3 結論

通過調節(jié)鋯基金屬有機框架的配位不飽和金屬位點制備了3種具有不同蛋白水解酶活性的納米酶,證明了一種可以調節(jié)鋯基金屬有機框架納米酶的蛋白水解酶活性的方法。以雙甘肽水解率為指標,評估了具有不同配位不飽和金屬位點的鋯基金屬有機框架納米酶的蛋白水解酶活性,其中6-配位的鋯基金屬有機框架納米酶對雙甘肽的蛋白水解酶活性最高,對雙甘肽的水解率達52%,證實了鋯基金屬有機框架的蛋白酶活性可以通過調整配位不飽和金屬位點而被提高,同時具有良好的異質性和可重復利用性。此外,鋯基金屬有機框架納米酶可以分別水解3種常見的蛋白質(大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白),展現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性,表明鋯基金屬有機框架作為蛋白水解酶納米酶具有較好的實際應用潛力。研究中蛋白催化水解溫度較高,后續(xù)需進一步研究鋯基金屬有機框架納米酶結構對催化溫度的影響機理,以期降低鋯基金屬有機框架納米酶高效水解蛋白時的溫度。