鐘菲菲 李 靜 雷德卿 楊 韻 伍健芳 歐陽(yáng)麗

(長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所,湖南 長(zhǎng)沙 410008)

蓮(NelumbonuciferaGaerth.)為蓮科蓮屬多年水生草本植物,在中國(guó)南北各省均有種植,主要產(chǎn)于湖南、浙江等地,尤以湘蓮最為著名,被譽(yù)為“中國(guó)第一蓮子”[1]。蓮子富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素、糖類、鈣、磷、鐵和鉀等營(yíng)養(yǎng)成分[2],具有抑菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[3]。其藥用有效成分以生物堿和黃酮類化合物為主,其中黃酮類化合物主要包括蘆丁、金絲桃苷及槲皮素。有研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷對(duì)腎組織具有保護(hù)作用[4];蘆丁可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路緩解右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)[5];槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗炎及保護(hù)心、腦和肝臟的作用[6]。

黃酮的測(cè)定方法主要有超高效液相色譜法[7]、熒光分光光度法[8]、紫外—可見分光光度法[9]、高效液相色譜法[9]、超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[10]等。其中,高效液相色譜法對(duì)中藥材中的目標(biāo)成分及雜質(zhì)有很好的分離效果、高靈敏度、結(jié)果穩(wěn)定和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在黃酮分析檢測(cè)中的應(yīng)用較廣。李靜等[11]曾采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定分心木中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的含量,但未見采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定湘蓮中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素含量的報(bào)道。研究擬建立采用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定湘蓮中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁對(duì)照品:含量98.24%,斯坦福石油化工有限公司;

金絲桃苷對(duì)照品:含量94.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;

槲皮素對(duì)照品:含量99.1%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;

乙腈、甲醇:色譜純,美國(guó)默克公司;

磷酸、甲酸:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;

超純水:實(shí)驗(yàn)室自制;

湘蓮:采自湖南省14個(gè)地市州,采摘時(shí)間為2022年7—9月,曬干。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀:Waters alliance e2695型,帶自動(dòng)進(jìn)樣器,2996PDA檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司;

電子分析天平:METTLER XS205DU型,瑞士梅特勒—托利多公司;

純化水系統(tǒng):Millipore Milli-Q Direct 8型,美國(guó)密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),二元流動(dòng)相,流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.6%磷酸,采用梯度洗脫(洗脫程序:0 min,18% A,82% B;35 min,33% A,67%B;40 min,34% A,66% B;45 min,35% A,65% B;50 min,40% A,60% B),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm,進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備 湘蓮樣品干燥粉碎,取湘蓮干燥粉末(粒徑180～250 μm),精密稱取約50 g,置于1 000 mL錐形瓶中,加75%乙醇約500 mL,超聲(840 W,40 kHz)處理1 h,蒸發(fā)溶劑至約100 mL,離心(8 000 r/min)3 min,收集上清液,用60 mL氯仿萃取2次,收集乙醇層,蒸發(fā)溶劑至近干,加甲醇溶解并定容至1 mL,用0.2 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁25.31 mg,金絲桃苷25.83 mg,槲皮素26.55 mg,置25 mL容量瓶中,用甲醇(80%)—乙腈(20%)溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成約1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0 mL分別置100 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得到3種成分的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液,每1 mL含蘆丁、金絲桃苷及槲皮素約為2,5,10,20,50,100,200 μg。

1.3.4 高效液相色譜條件優(yōu)化

(1) 吸收波長(zhǎng):使用紫外分光光度計(jì),對(duì)蘆丁、金絲桃苷及槲皮素3種待測(cè)成分在200～400 nm范圍掃描,選擇最佳吸收波長(zhǎng)。

(2) 流動(dòng)相的優(yōu)化:采用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),PDA檢測(cè)器,最佳檢測(cè)波長(zhǎng),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm,進(jìn)樣量20 μL。比較不同流動(dòng)相:乙腈—磷酸水溶液(0.2%,0.4%,0.6%)、甲醇—磷酸水溶液(0.2%,0.4%,0.6%)對(duì)3種黃酮類物質(zhì)的分離效果。

(3) 溶劑的選擇:采用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),PDA檢測(cè)器,最佳檢測(cè)波長(zhǎng),流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm,進(jìn)樣量20 μL。比較不同溶劑配比(V甲醇∶V乙腈分別為100∶0,80∶20,60∶40,50∶50,40∶60,0∶100)對(duì)3種黃酮類物質(zhì)的分離效果。

1.3.5 湘蓮中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素提取方法的優(yōu)化

(1) 湘蓮粉末粒徑選擇:取3種不同粒徑(>355,180～250,<150 μm)的湘蓮干燥粉末,采用超聲提取(840 W,40 kHz),提取時(shí)間為1 h,蒸發(fā)溶劑至約100 mL,離心(8 000 r/min)3 min,收集上清液,最優(yōu)HPLC條件測(cè)定3種黃酮類物質(zhì)含量。

(2) 提取時(shí)間選擇:取湘蓮干燥粉末(180～250 μm),采用超聲提取(840 W,40 kHz),提取時(shí)間分別為0.5,1.0,1.5,2.0 h,分別蒸發(fā)溶劑至約100 mL,離心(8 000 r/min)3 min,收集上清液,最優(yōu)HPLC條件測(cè)定3種黃酮類物質(zhì)含量。

(3) 提取溶劑選擇:取湘蓮干燥粉末(180～250 μm),采用超聲提取(840 W,40 kHz),提取時(shí)間1 h,選擇不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇和乙醇(50%甲醇、50%乙醇、60%甲醇、60%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、90%甲醇、90%乙醇)作為溶劑提取湘蓮中3種黃酮,考察提取溶劑對(duì)湘蓮中3種黃酮類物質(zhì)定量的影響。

(4) 料液比選擇:取湘蓮干燥粉末(180～250 μm),采用超聲提取(840 W,40 kHz),提取時(shí)間1 h,提取溶劑為75%乙醇,考察料液比[1∶2,1∶5,1∶10,1∶15 (mg/mL)]對(duì)湘蓮中3種黃酮類物質(zhì)提取效果的影響。

(5) 提取方法選擇:取湘蓮干燥粉末(180～250 μm),提取時(shí)間1 h,提取溶劑為75%乙醇,料液比1∶10 (mg/mL),分別采用超聲(840 W,40 kHz)和熱回流提取湘蓮中3種黃酮類物質(zhì),考察提取方法對(duì)湘蓮中3種黃酮類物質(zhì)定量的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將儀器測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果使用Excel 2010軟件記錄、處理計(jì)算。提取色譜圖通過儀器軟件導(dǎo)出csv數(shù)據(jù)文件,使用Origin 8.5繪圖軟件重新繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜圖

如圖1所示,按1.3.1的色譜條件進(jìn)樣,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的保留時(shí)間分別為41.07,42.81,47.92 min。樣品中的目標(biāo)峰具有良好的峰型和分離度,雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)峰的含量測(cè)定沒有干擾。因此,在該色譜條件下所測(cè)得的結(jié)果可以代表蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量。

圖1 混合對(duì)照品和樣品HPLC色譜圖

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 波長(zhǎng)選擇 精密量取1.3.1項(xiàng)下供試品溶液0.1 mL,加甲醇定容至10 mL容量瓶,搖勻。取蘆丁、金絲桃苷及槲皮素對(duì)照品,加甲醇溶液(濃度適量)作對(duì)照,在紫外可見光分光光度計(jì)200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,以甲醇為空白溶劑。結(jié)果供試品和蘆丁、金絲桃苷及槲皮素對(duì)照品均在255 nm處有最大吸收,故確定其為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 溶劑選擇和優(yōu)化 如圖2所示,當(dāng)溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)>40%時(shí),槲皮素含量明顯降低;以甲醇(60%)—乙腈(40%)為溶劑時(shí),槲皮素的色譜峰拖尾嚴(yán)重;以純甲醇為溶劑時(shí),蘆丁及金絲桃苷分離度<1.5,而且蘆丁色譜峰存在前延和變形問題。綜合考慮目標(biāo)物質(zhì)峰的響應(yīng)值、拖尾因子、分離度和峰寬,最終選擇甲醇(80%)—乙腈(20%)作為溶劑溶解稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

圖2 不同溶劑的色譜圖

2.2.3 流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化 蘆丁和金絲桃苷的極性相似,但槲皮素的極性與二者相差較大,故選擇梯度洗脫。如圖3所示,當(dāng)流動(dòng)相為甲醇—0.2%磷酸水溶液和甲醇—0.4%磷酸水溶液時(shí),3種黃酮類物質(zhì)的分離效果差,可能是流動(dòng)相的酸度不夠;以甲醇—0.6%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí),3種物質(zhì)的目標(biāo)峰分離效果較好,分離度均大于1.5,且峰形較好。0.6%磷酸水溶液pH為2.3,考慮到pH≤2時(shí)會(huì)縮短色譜柱的使用壽命,因此不再選用更高酸度的磷酸水溶液作為流動(dòng)相。與甲醇相比,乙腈作為流動(dòng)相時(shí),3種黃酮類物質(zhì)的保留時(shí)間靠前,湘蓮藥材的雜質(zhì)峰可能會(huì)干擾目標(biāo)物質(zhì)的測(cè)定,綜合考慮目標(biāo)峰洗脫時(shí)間和分離效果,選擇甲醇—0.6%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。

圖3 不同流動(dòng)相的色譜圖

2.3 提取條件優(yōu)化

2.3.1 湘蓮粉末粒徑對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響 由表1可知,湘蓮粉末粒徑>355 μm或<150 μm時(shí)3種黃酮類物質(zhì)的提取率均比粒徑為180～250 μm的低,原因可能是粉末粒徑過大,與溶劑接觸的比表面積小,有效成分滲出少;粉末過細(xì),顆粒表面積大,其吸附作用強(qiáng),會(huì)影響3種目標(biāo)物質(zhì)的擴(kuò)散速度,同時(shí)雜質(zhì)提取量也會(huì)增加,干擾目標(biāo)物質(zhì)的定量。故湘蓮粉末粒徑選擇180～250 μm。

表1 粉末粒徑對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響 由表2可知,提取時(shí)間為0.5 h時(shí),3種黃酮類物質(zhì)的提取率較低;提取時(shí)間為1.0 h與提取時(shí)間為1.5 h的蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的提取率相近;提取時(shí)間為2 h時(shí),3種黃酮類物質(zhì)雖然提取率較高,但雜質(zhì)峰較多。綜合分析,提取時(shí)間選擇1.0 h。

表2 提取時(shí)間對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響

2.3.3 提取溶劑對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響 由表3可知,乙醇溶液提取效果優(yōu)于甲醇溶液,可能是乙醇與3種黃酮類物質(zhì)的極性相近。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中,75%乙醇的提取效果最佳,乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會(huì)使湘蓮粉末中的糖類物質(zhì)、脂溶性物質(zhì)大量析出,導(dǎo)致3種目標(biāo)物質(zhì)的定量受到影響;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過低時(shí),湘蓮粉末中3種目標(biāo)物的含量明顯降低。因此,提取溶劑選擇75%乙醇溶液。

表3 提取溶劑對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響

2.3.4 料液比對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響 由表4可知,隨著液料比值的增大,3種目標(biāo)物質(zhì)的提取率先增大后趨于平衡?？紤]到耗材用量、人力及時(shí)間,料液比選擇1∶10 (mg/mL)。

表4 料液比對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響

2.3.5 提取方法對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響 由表5可知,采用熱回流法時(shí)蘆丁及金絲桃苷的提取率較超聲法的低,可能是因?yàn)樘J丁及金絲桃苷受熱易分解,而且超聲法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、耗時(shí)短。因此,選擇超聲法。

表5 提取方法對(duì)3種目標(biāo)物含量的影響

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限考察

以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,蘆丁、槲皮素及金絲桃苷在質(zhì)量濃度為5～200 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。以信噪比S/N≥3確定檢出限,以信噪比S/N≥10確定定量限,如表6所示,蘆丁、金絲桃苷及槲皮素均有較低的檢出限及定量限,有較好的靈敏度。

表6 3種組分線性范圍與檢測(cè)限

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取湘蓮供試品溶液分別于0,4,8,16,24,36,48 h進(jìn)樣,各時(shí)間點(diǎn)平行2次,測(cè)定湘蓮供試品溶液中3種黃酮的平均峰面積。由表7可知,蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的 均小于2%(n=7),表明湘蓮供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定,但超過72 h,3種黃酮類物質(zhì)的峰面積明顯降低。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液,按1.3.1的色譜條件,平行進(jìn)樣6次,測(cè)定3種成分的峰面積。由表8可知,蘆丁、金絲桃苷及槲皮素峰面積的RSD均小于2%,表明該方法具有良好的精密度。

表8 精密度試驗(yàn)

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.3.2的供試品溶液制備方法平行處理6份樣品,按1.3.1的色譜條件測(cè)定。由表9可知,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.8%,1.1%,1.5%,表明該方法的重復(fù)性良好。

表9 重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的湘蓮樣品9份,每份約25 g,精密稱定,按1.3.2的方法處理之前,在9份湘蓮樣品中分別加入高、中、低3種不同濃度的蘆丁、金絲桃苷及槲皮素高、中、低混合的對(duì)照品溶液1 mL,質(zhì)量濃度分別為60,50,40 μg/mL,置振蕩器中混勻。按1.3.1的色譜條件測(cè)定,計(jì)算各對(duì)照品的平均加樣回收率和RSD值。由表10可知,蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的平均加標(biāo)回收率分別為96.6%,96.9%,97.4%,RSD值分別為1.3%,1.5%,1.5%(n=9),表明該方法的加樣回收率符合要求,對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確度影響小。

表10 回收率試驗(yàn)

2.9 耐用性試驗(yàn)

按1.3.2的方法平行處理2份樣品,更改柱溫條件(25,30,35,40 ℃)、流動(dòng)相pH值(2.0,2.5,3.0,3.5)及色譜柱(Agilent-C18柱、Waters-C18柱、Thermo-C18柱),其他條件參照1.3.1。由表11～表13可知,同一供試品在改變柱溫條件下,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的RSD分別為2.8%,2.2%,2.4%;同一供試品在改變流動(dòng)相pH值條件下,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的RSD分別為2.1%,1.8%,1.9%;同一供試品在改變色譜柱的條件下,蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的RSD分別為1.7%,0.9%,1.4%。湘蓮供試品溶液在柱溫、流動(dòng)相pH值及色譜柱條件微小變化后,3種黃酮類物質(zhì)色譜峰分離良好,對(duì)結(jié)果的測(cè)定沒有較大的影響,說(shuō)明該方法具有良好的耐用性。

表11 柱溫耐用性試驗(yàn)

表12 pH值耐用性試驗(yàn)

表13 色譜柱耐用性試驗(yàn)

2.10 重現(xiàn)性

不同的分析人員在不同的實(shí)驗(yàn)室取同一批次湘蓮樣品,各按1.3.2的方法平行處理5份樣品,按1.3.1的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。由表14可知,該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表14 重現(xiàn)性試驗(yàn)

2.11 樣品的含量測(cè)定

取20批湖南省14個(gè)地市州的湘蓮樣品粉末各50 g,先按1.3.2項(xiàng)下的樣品處理方法制備,再按照1.3.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定樣品中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素含量。由表15可知,20批湘蓮樣品中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素含量的平均值分別為1.62,1.78,2.29 mg/kg,不同產(chǎn)地和采收季節(jié)均會(huì)對(duì)湘蓮中的蘆丁、金絲桃苷及槲皮素含量有一定程度的影響。從產(chǎn)地看,湘潭的蓮子中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的含量最高,可能是因?yàn)橄嫣段挥谙娼掠?氣候濕潤(rùn),年平均氣溫為17 ℃左右,形成了湘蓮生產(chǎn)的有利地理?xiàng)l件;從采收季節(jié)看,湘潭、永州、懷化、衡陽(yáng)和婁底地區(qū)8月份采收的蓮子3種黃酮類物質(zhì)的含量均比7月份的高,可能與陽(yáng)光照射溫度有關(guān),因?yàn)槟戏降貐^(qū)8月份氣候溫度比7月份高,大部分地區(qū)的溫度在34 ℃左右,有些地區(qū)可能會(huì)超過39 ℃,甚至達(dá)到40～41 ℃,因此推測(cè)夏季三伏天的中伏和末伏期間為蓮子比較適合的采收季節(jié)。

表15 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

研究建立了高效液相色譜法測(cè)定湘蓮中蘆丁、金絲研究對(duì)湘蓮中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素3種黃酮類物質(zhì)的分析方法進(jìn)行了改進(jìn),3種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰得到了很好的分離且出峰時(shí)間適宜。湘蓮中有較多黃酮類化合物以及其他類別化合物,試驗(yàn)只對(duì)湘蓮中3種黃酮類化合物進(jìn)行了定量分析,尚未對(duì)湘蓮中其他活性成分做進(jìn)一步的分離分析,其主要活性成分有待于進(jìn)一步研究。

桃苷及槲皮素含量的方法。該法采用色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:A相為甲醇,B相為0.6%磷酸,梯度洗脫(洗脫程序:0 min,18% A,82% B;35 min,33% A,67% B;40 min,34% A,66% B;45 min,35% A,65% B;50 min,40% A,60% B),流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm;進(jìn)樣量20 μL。蘆丁、金絲桃苷及槲皮素在5～200 μg/mL(R2=0.999 9)范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系,回歸方程分別為Y=2 527X-1 136、Y=4 818.6X-3 712和Y=2 809.8X-108.4。