黃菲，王志杰，盧帥，陳亞東，陸濤

（中國藥科大學理學院 江蘇 南京 211198）

1 概述

1.1 背景介紹

組蛋白的翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）是一種重要的表觀遺傳學修飾，參與細胞生命活動和疾病的發(fā)生發(fā)展進程。組蛋白PTMs目前已經(jīng)報道出12種方式[1]，包括組蛋白末端賴氨酸殘基的乙?；⒓谆?、泛素化、磷酸化和磺?；取Ｆ駷橹?，已在4個核心組蛋白（H2A、H2B、H3和H4）的N末端尾部和30個組蛋白變體中鑒定出130個修飾位點[2]。PTMs修飾會改變?nèi)旧|(zhì)的開閉程度，從而影響后續(xù)轉(zhuǎn)錄和基因表達過程。組蛋白賴氨酸的乙?；墙M蛋白翻譯后修飾的重要方式之一[3]，賴氨酸乙?；谌祟惣毎械念l繁發(fā)生表明賴氨酸乙?；诩毎盘杺鲗ЬW(wǎng)絡(luò)中起著重要作用[4]。目前已有多個靶向組蛋白乙?；^程的藥物上市或在研，如靶向組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）的藥物伏立諾他和貝利司他均已獲批上市，分別用于治療皮膚T細胞淋巴癌和多發(fā)性骨髓瘤[5]。

溴結(jié)構(gòu)域蛋白（bromodomain-containing proteins，BCPs）可以特異地識別并結(jié)合組蛋白乙?；馁嚢彼?。目前已經(jīng)在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了61種BCPs，根據(jù)結(jié)構(gòu)序列的相似性可分為8個BCPs家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同又可分為溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域家族（bromodomain and extra-terminal domain，BET）以及非溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域家族（non bromodomain and extra-terminal domain，non-BET）。其中，BET家族包括溴結(jié)構(gòu)域蛋白2、溴結(jié)構(gòu)域蛋白3、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4和溴結(jié)構(gòu)域蛋白T。正常情況下，位于細胞核內(nèi)的BET蛋白能識別組蛋白H3和組蛋白H4中的乙?；嚢彼幔心嫁D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物到染色質(zhì)，參與以DNA為中心的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中不同基因的表達[6]。BRD2、BRD3和BRD4在多種組織中表達，而具有高度組織特異性溴結(jié)構(gòu)域蛋白T僅在粗線精母細胞、二倍體精母細胞和圓形精母細胞中表達[7]。作為BET家族成員之一，BRD4的功能已被發(fā)現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是與腫瘤的靶向治療密切相關(guān)[8]。

1.2 BRD4的結(jié)構(gòu)與功能

BRD4最初被命名為有絲分裂染色體相關(guān)蛋白（mitotic chromosomal-associated protein， MCAP），也被稱為Fshrg4或Hunk1。BRD4蛋白有3種不同長度的異構(gòu)體：1種長異構(gòu)體（1 362個殘基）和2種短異構(gòu)體（分別為722和796個殘基）[9]。在結(jié)構(gòu)上，BRD4蛋白包括2個高度保守（氨基酸序列同源性高達95%）的N端溴結(jié)構(gòu)域（BD1和BD2）、1個超末端結(jié)構(gòu)域（extra-terminal，ET）和1個C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）；BD1和BD2能識別并結(jié)合乙?；嚢彼釟埢珽T結(jié)構(gòu)域與輔因子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。BRD4的溴結(jié)構(gòu)域分別由4個反向平行的α螺旋（αZ、αA、αB、αC）和連接螺旋的環(huán)狀結(jié)構(gòu)ZA loop和BC loop區(qū)域組成，ZA loop、BC loop 和αZ共同組成了WPF區(qū)域，αZ和αA組成了ZA channel區(qū)域，這些疏水間區(qū)域的相互作用形成了1個疏水性口袋，即乙?；嚢彼岬慕Y(jié)合口袋[10]。BRD4 BD1與組蛋白H4K8Ac12Ac的共晶復合物結(jié)構(gòu)顯示（見圖1）：乙?；嚢彼嵛挥谥行牡氖杷诖校c天冬酰胺Asn140形成關(guān)鍵氫鍵，而乙酰羰基的氧原子通過水分子與酪氨酸Tyr97產(chǎn)生氫鍵作用，同時乙酰化賴氨酸還與WPF區(qū)域和ZA channel區(qū)域產(chǎn)生疏水作用和靜電相互作用。BRD4抑制劑能夠通過競爭乙酰化賴氨酸與BRD4蛋白的結(jié)合位點來抑制BRD4蛋白的功能。

圖1 BRD4 BD1與組蛋白H4K8Ac12Ac的共晶復合物（PDB ID：3UW9）Figure 1 Cocrystal structure of BRD4 BD1 with H4K8Ac12Ac （PDB ID：3UW9）

BRD4能夠招募正性轉(zhuǎn)錄延長因子復合物（positive transcription elongation factor，P-TEFb），而該復合物在真核生物RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNA PolⅡ）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用[11]，其功能失調(diào)?？蓪е露喾N人類疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明BRD4的功能紊亂與人類多種疾病如炎癥、癌癥、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染等密切相關(guān)[7-8]。因此，BET被認為是治療各種人類疾病的潛在靶點，已成為BCPs中最具藥物敏感性的蛋白質(zhì)家族[12-13]。BRD4包括2個串聯(lián)的溴結(jié)構(gòu)域BD1和BD2，二者具有高度同源性，在結(jié)合位點的氨基酸序列同源性高達95%[14]。盡管BD1和BD2在底物結(jié)合位點的序列高度相似（見圖2）[15]，但它們能在H3和H4組蛋白尾部特異性識別不同的乙酰化底物[16]。據(jù)報道，BD2對乙酰化底物有更廣泛的作用，而BD1僅能識別H4組蛋白尾部的乙?；孜颷17]。因此，鑒于2個溴結(jié)構(gòu)域的不同作用，設(shè)計選擇性作用于不同溴結(jié)構(gòu)域的BRD4抑制劑，既可用于探究BD1和BD2在疾病表型中的重要意義，也可推動BRD4抑制劑的藥物研究。

圖2 BRD4 蛋白結(jié)構(gòu)和BRD4 BD1與BRD4 BD2氨基酸序列對比Figure 2 BRD4 protein structure and conserved sequences of BRD4 BD1 and BRD4 BD2

2 BRD4抑制劑臨床研究進展

盡管目前已有多個BRD4抑制劑進入臨床研究（見表1），但進展緩慢，至今尚無藥物上市。多項研究表明頭暈、惡心和嘔吐等不良反應(yīng)嚴重影響了BRD4抑制劑的臨床進展，甚至導致臨床試驗終止。而缺乏對BRD4蛋白BD1和BD2結(jié)構(gòu)域的選擇性可能是其中的原因之一[15]。選擇性靶向BRD4 BD1或BRD4 BD2的抑制劑已成為目前研究的熱點。本文綜述了目前已經(jīng)報道的選擇性BRD4蛋白抑制劑，按照對不同結(jié)構(gòu)域的選擇性作用區(qū)分，包括選擇性BRD4 BD1抑制劑和選擇性BRD4 BD2抑制劑。

表1 進入臨床研究的BRD4抑制劑Table 1 BRD4 inhibitors under clinical trials

2.1 BRD4 BD1選擇性抑制劑

Raux等[18]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)，BRD4 BD1選擇性抑制劑化合物1能夠準確地結(jié)合到ZA channel中，與Asn140形成氫鍵，并通過水分子介導與Tyr97形成氫鍵，此外還與蛋白結(jié)合口袋底部保守的水分子網(wǎng)絡(luò)連接起來?；衔?對BRD4 BD1的IC50達到微摩爾級別（IC50= 5 μmol · L-1），較BET家族其他成員的選擇性高10倍?；衔?能劑量依賴地降低Jurkat T細胞活力，并且能下調(diào)原癌基因c-Myc的水平。

Rodriguez等[19]通過虛擬篩選得到的化合物2，是一種具有重氮苯結(jié)構(gòu)的BRD4 BD1選擇性抑制劑，其對BRD4 BD1的Ki為30 ～ 50 nmol · L-1，選擇性是BRD4 BD2的10倍。隨后發(fā)現(xiàn)的化合物3是一種具有環(huán)丙烯結(jié)構(gòu)的BRD4 BD1選擇性抑制劑，對BRD4 BD1的Ki為77 nmol · L-1，較BRD4 BD2的選擇性超過9倍。從化合物4與CBP蛋白結(jié)合的作用機制出發(fā)，他們又發(fā)現(xiàn)了一種四氫吡啶吲哚結(jié)構(gòu)的化合物5（olinone）[14]，該化合物對BRD4 BD1的Kd為3.4 μmol · L-1，對BRD4 BD2的選擇性超過100倍，對BRD2、BRD3、BRD4的BD1均具有一定的選擇性。化合物5與BRD4 BD1蛋白晶體復合物結(jié)構(gòu)表明，Olinone 中乙?；聂驶跖cBRD4 BD1的Asn140酰胺鍵的氮原子形成氫鍵，三雜環(huán)結(jié)構(gòu)與BD1乙酰賴氨酸的結(jié)合口袋處的Asp144形成了氫鍵，而在BD2蛋白中該位置是His437殘基，該位點在BET家族中并不是保守的，這也解釋了olinone對BET家族中的其他BD1蛋白產(chǎn)生選擇性的原因。Olinone能夠促進少突膠質(zhì)細胞祖細胞分化，而非選擇性抑制劑則會抑制少突膠質(zhì)細胞祖細胞分化，BRD4 BD1選擇性抑制劑或許能成為未來治療脫髓鞘疾病的一種新策略。

中南大學湘雅醫(yī)學院的研究者通過對BRD4 BD1和BRD4 BD2結(jié)合口袋處的疊合共晶結(jié)構(gòu)分析[20]，發(fā)現(xiàn)二者主要的結(jié)構(gòu)差異在于BC loop中的Asp144（BD1）和His437（BD2）；BRD4 BD2口袋空腔比BRD4 BD1口袋的空腔窄，因此在非選擇性BRD4抑制劑JQ1的基礎(chǔ)上在BD2區(qū)域插入與His437形成位阻的結(jié)構(gòu)基團，以達到對BD1的選擇性抑制，最終得到了化合物6[20]?；衔?對BRD4 BD1的IC50為0.56 μmol · L-1，而對BRD4 BD2的IC50大于100 μmol · L-1，化合物6與BRD4 BD1和BRD4 BD2的疊合共晶結(jié)構(gòu)表明，叔丁基的引入使得化合物6與His437（BD2）產(chǎn)生碰撞而無法與蛋白口袋結(jié)合，這是對BD2活性差的原因?；衔?與BRD4 BD1的共晶結(jié)構(gòu)顯示，化合物6的3，5-二甲基異惡唑在乙?；嚢彼峥诖幣cAsn140結(jié)合形成氫鍵，WPF區(qū)域3，4-二氯取代基的引入使3，4-二氯苯基的平面趨于垂直于嘧啶酮的平面，嘧啶酮可能與Trp81產(chǎn)生了π-π堆積作用。化合物6對肺成纖維細胞系（HLF-1）、腎成纖維細胞系（NRK-49F）和肝成纖維細胞系（LX2）的IC50為4.2 ～ 19.6 μmol · L-1。I型膠原是細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的主要成分，也是控制纖維化過程的關(guān)鍵因素，化合物6能劑量依賴性地抑制Ⅰ型膠原的表達，并且在相同濃度的10 μmol · L-1下，化合物6比（+）-JQ1更有效，而RVX-208對Ⅰ型膠原的表達沒有抑制作用，說明BRD4 BD1在纖維化過程中起主導作用，選擇性抑制BRD4 BD1比同時抑制BRD4 BD1和BRD4 BD2具有更強的抗纖維化活性?；衔?可以作為一種新的先導化合物，進一步開發(fā)針對器官纖維化或癌癥的有效選擇性BRD4 BD1抑制劑。

美國德克薩斯大學研究者發(fā)現(xiàn)的化合物7（ZL0513）和化合物8（ZL0516）[21]是根據(jù)RVX-208和RVX-OH與BRD4 BD1在WPF區(qū)域的不同結(jié)合模式，基于配體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計與骨架躍遷策略，設(shè)計出的具有香豆素母核結(jié)構(gòu)的系列化合物，化合物ZL0513對BRD4 BD1的IC50為67 nmol · L-1；ZL0516對BRD4 BD1的IC50為84 nmol · L-1，對BRD4 BD2的選擇性大于10倍（BRD4 BD2 IC50=718 nmol · L-1），且對BET家族其他成員也具有較高的選擇性[21]，化合物8能準確地結(jié)合到乙?；嚢彼峥诖校ㄒ妶D3），結(jié)構(gòu)中手性碳上的羥基通過一個水分子介導與BRD4 BD1特有的Asn93形成氫鍵，羰基與Asn140相互作用，香豆素母核中的一個甲氧基通過水分子介導與Tyr97形成氫鍵，同時被包裹在乙?；嚢彼峥诖?，另一個甲氧基則延伸到WPF區(qū)中。ZL0516可用于治療慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），ZL0516具有良好的成藥性，其生物利用度（F）大于35%，水溶性和和代謝穩(wěn)定性較好，對心臟的毒性和肝藥酶CYP450的抑制較弱，有望作為先導化合物繼續(xù)優(yōu)化，推向進一步臨床研究。該團隊研發(fā)的化合物9（ZL0590）[22]以一個在此之前從未報道過的結(jié)合方式選擇性作用于BRD4 BD1蛋白，蛋白晶體復合物結(jié)構(gòu)顯示，ZL0590與αB和αC螺旋上的非乙?；嚢彼峥诖稽c結(jié)合，作用于BRD4 BD1上特異的氨基酸殘基，嗎啉環(huán)的堿性胺部分可被質(zhì)子化，并與Glu151的羧酸部分形成鹽橋，磺酰胺與Gly143的主鏈酰胺形成氫鍵，磺酰胺中的另一個氧原子與水分子形成氫鍵，從而介導與Asp144主鏈羰基的相互作用，尿素連接部位通過2個水分子與Tyr137的主鏈羰基和Glu154的側(cè)鏈羧酸基團相互作用?；衔颶L0590對BRD4 BD1的IC50為90 nmol · L-1，對BRD4 BD2的選擇性大于10倍（BRD4 BD2 IC50= 1 093 nmol · L-1），體外代謝實驗表明，ZL0590的生物利用度較為良好（F = 24%），半衰期達到3.7 h，藥時曲線下面積為602 ng · h · mL-1，最大濃度為86.9 ng · mL-1,水溶性為3 500 μg · mL-1。體內(nèi)藥效實驗表明，ZL0590能夠有效抑制poly（I:C）誘導的小鼠肺組織中性粒細胞炎癥，降低炎癥因子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等的表達，用于治療COPD。該化合物這一新穎結(jié)合蛋白模式的發(fā)現(xiàn)，將為今后闡明BRD4選擇性抑制劑的復雜機制和BRD4蛋白功能奠定重要基礎(chǔ)。

圖3 化合物8與BRD4 BD1蛋白共晶結(jié)合模式圖（PDB ID：6UWU)Figure 3 Cocrystal structure of compound 8 with BRD4 BD1 (PDB ID: 6UWU)

鄭州大學藥學院的研究者們發(fā)現(xiàn)，具有茶堿母核的一系列化合物能夠選擇性抑制BRD4 BD1蛋白，經(jīng)過一系列基于片段的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到化合物10（BRD4 BD1 IC50= 2.51 μmol · L-1），對BRD4 BD2的選擇性大于20倍[23]。分子對接模型顯示該系列化合物都能和BD1蛋白結(jié)合口袋的Asn140產(chǎn)生氫鍵相互作用，化合物10產(chǎn)生最佳選擇性的原因可能是N-7位置的苯基與BRD4 BD1蛋白的Trp81氨基酸殘基形成T形π-π堆積相互作用，同時與BRD4 BD1蛋白中的大體積氨基酸殘基Ile146形成緊密π-π相互作用，而BRD4 BD2蛋白中該位置則是體積稍小的Val439。

2020年明尼蘇達大學的研究者從自己前期設(shè)計的具有微摩爾活性的泛BD1抑制劑11出發(fā)，該化合物同時對絲裂原活化蛋白激酶p38α（mitagenactivated protein kinase p38α，MAP p38α）也有一定的抑制作用（Kd= 0.47 nmol · L-1），基于結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物12，其對BRD4 BD1的IC50為0.13 μmol · L-1，對BET其他家族成員選擇性為9 ～ 33倍[24]。2022年Cui等[25]從化合物12（UMN627）對BRD4 BD1產(chǎn)生選擇性的機制出發(fā)，UMN627具有對BRD4 BD1獨特選擇性的原因之一是化合物在與BD1蛋白結(jié)合位點占據(jù)了3個水分子的位置。在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到了化合物13?；衔?3對BRD4 BD1的IC50為92 nmol · L-1，對BRD4 BD1的Kd為18 nmol · L-1，對BRD4 BD1的選擇性相對于BRD2 BD1和BRD4 BD2都大于500倍。蛋白共晶結(jié)構(gòu)顯示（見圖4），化合物13結(jié)構(gòu)中的咪唑環(huán)與BRD4 BD1的Asn140形成氫鍵，三氟甲基苯基取代了BRD4 BD1蛋白結(jié)構(gòu)中的3個水分子，二甲基乙氨基通過水分子與Asn140和Asp144形成氫鍵，這是化合物13產(chǎn)生特異選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?；衔?3能夠影響白血病細胞MM.1S內(nèi)BRD4蛋白的表達，但在低濃度下未觀察到對原癌基因c-Myc的抑制，而非選擇性抑制劑在低濃度下則會產(chǎn)生對原癌基因c-Myc的抑制?；衔?3能夠降低非小細胞肺癌細胞系中的細胞因子IL-8的水平，并能在人肝竇內(nèi)皮細胞中抑制炎癥導致的趨化因子表達。

圖4 化合物13與BRD4 BD1蛋白共晶結(jié)合模式圖（PDB ID：6WGX)Figure 4 Cocrystal structure of 13 with BRD4 BD1 （PDB ID：6WGX)

Cui等[26]在設(shè)計出UMN627之后，在化合物14的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，根據(jù)ABBV-744的構(gòu)效關(guān)系，改變?nèi)颦h(huán)上的芳基，可以增強對BD1的選擇性，發(fā)現(xiàn)了化合物15（DW34），DW34對BET家族的BD1有選擇性，對BETs BD1的Kd為12 ～ 22 nmol · L-1，對BD2的選擇性大于16倍（對BRD2 BD2、BRD3 BD2、BRDT BD2的Kd為200 ～ 310 nmol · L-1），而對BRD4 BD2的Kd為67 nmol · L-1。晶體結(jié)構(gòu)表明DW34結(jié)構(gòu)的二甲基乙氨基與BD1中特有的Asp144通過一個水分子介導形成了氫鍵（見圖5），GSK778也產(chǎn)生了類似的氫鍵作用，DW34對BRD4 BD2有選擇性的原因至今尚不明確。此外，DW34能顯著抑制原癌基因c-Myc的表達，EC50＜100 nmol · L-1，同時能夠抑制白血病細胞MM.1S的生長和下調(diào)炎癥細胞因子IL-8水平。

圖5 化合物15與BRD4 BD1蛋白共晶結(jié)合模式圖Figure 5 Cocrystal structure of compound 15 with BRD4 BD1

化合物16（GSK778）[27]是葛蘭素史克公司根據(jù)I-BET151的結(jié)構(gòu)研發(fā)的泛BD1選擇性抑制劑（IC50= 40 nmol · L-1），對BD2的選擇性大于130倍，化合物16與BRD4 BD1共晶結(jié)構(gòu)表明其產(chǎn)生選擇性的基礎(chǔ)是結(jié)構(gòu)中的四氫吡咯環(huán)與BD1蛋白中特有的Asp144通過水分子介導形成的氫鍵，Asp144側(cè)鏈受到Lys141氫鍵的限制，而在BD2蛋白中該位置是氨基酸殘基His433和Pro430。一些細胞實驗表明GSK778與非選擇性BET抑制劑I-BET151的作用相似，能夠抑制人白血病細胞K562增殖，誘導細胞周期阻滯和凋亡，能降低急性髓細胞白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）細胞的克隆形成能力。在GSK778的基礎(chǔ)上進一步進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到的化合物17（GSK789），其具有更高的BD1選擇性（BRD4 BD1 IC50= 20 nmol · L-1），對BRD4 BD2的選擇性達到1 500倍（BRD4 BD2 IC50= 30 μmol · L-1）。與GSK778產(chǎn)生選擇性的基礎(chǔ)類似，其與BD1蛋白中的Asp144通過水分子介導形成氫鍵，同時結(jié)構(gòu)中的呋喃環(huán)與ZA channel中的Trp81、Phe82和Leu92側(cè)鏈形成緊密的疏水作用，GSK789在一系列癌細胞系中顯示出強大的抗增殖作用，具有一系列抗增殖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和組織重塑活性。但GSK789在大鼠和小鼠肝細胞中的清除率較高，因此沒有進行體內(nèi)代謝研究。

筆者所在課題組在前期基于片段的篩選得到苯并[cd]吲哚-2-（1H）-酮類化合物18，進一步對其與BRD4 BD1蛋白不同的結(jié)合區(qū)進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物19（LT052）[28]，其對BRD4 BD1的IC50為87.7 nmol · L-1，對BRD4 BD2的選擇性為138倍（BRD4 BD2 IC50= 12.1 μmol · L-1）?；衔?9與BRD4 BD1的晶體復合物顯示，該化合物結(jié)構(gòu)中的甲基咪唑環(huán)與BD2蛋白中的His437殘基產(chǎn)生了空間位阻，阻礙了其與BD2蛋白的結(jié)合，從而增加了對BD1的選擇性。在體外評估實驗中，LT052能夠減少小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7中NO的產(chǎn)生，而BD2抑制劑RVX-208抑制NO產(chǎn)生的效果不如LT052，同時LT052能夠下調(diào)核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路的信號傳導，且效果優(yōu)于（+）-JQ1。體外肝微粒體實驗研究表明化合物19在大鼠、小鼠、猴子和人肝微粒體中的半衰期為9.4 ～ 14.8 min，清除率較高，為93.517 ～146.685 μL · min-1· mg-1，LT052能通過抑制BRD4影響NF-κB/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）信號通路，抑制氧自由基清除劑尿酸鈉（monosodium urate，MSU）誘導的巨噬細胞THP-1細胞炎癥級聯(lián)反應(yīng)和細胞焦亡。在大鼠動物模型中，LT052通過調(diào)節(jié)該信號通路抑制大鼠滑膜組織中巨噬細胞的焦磷酸化，從而實現(xiàn)急性痛風性關(guān)節(jié)炎的治療。

2.2 BRD4 BD2選擇性抑制劑

化合物20（GSK046）[29]是葛蘭素史克公司通過高通量篩選得到的BD2選擇性抑制劑。GSK046與BRD4 BD2的共晶結(jié)構(gòu)顯示（見圖6），GSK046結(jié)構(gòu)中的芐基和環(huán)己酰胺與BRD4 BD2蛋白中的Pro430和His433形成廣泛的疏水作用力，而在BD1蛋白中這些位置被Asp144和Lys141取代，這是其產(chǎn)生選擇性的基礎(chǔ)。為了改善成藥性，并保留GSK046對BD2的特異選擇性，設(shè)計合成了化合物21（GSK620），GSK620在膠原誘導的大鼠關(guān)節(jié)炎模型中能夠劑量依賴地降低免疫球蛋白IgG1水平，顯著減少關(guān)節(jié)腫脹、滑膜炎、軟骨損傷、血管翳和骨吸收等癥狀，在咪喹莫特（imiquimod，IMQ）誘導的銀屑病小鼠模型中減少紅斑和斑塊形成和表皮增生方面的效果優(yōu)于近期美國FDA批準的治療銀屑病的阿普司特，并顯著降低了與疾病相關(guān)的促炎癥基因IL-17A、IL-17F和IL-22的表達，在非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）小鼠模型中，與對照組相比，GSK620治療組小鼠的脂肪變性、小葉炎癥和肝細胞氣球化減少，能夠減少肝活檢中促炎癥和促纖維化基因的表達。

圖6 化合物GSK046與BRD4 BD1/BRD4 BD2的蛋白共晶疊合圖（PDB ID：6SWQ, 6SWP)Figure 6 Cocrystal structure of compound 20 with BRD4 BD1/BRD4 BD2 (PDB ID: 6SWQ,6SWP)

在泛BRD4抑制劑22（ABBV-075）的基礎(chǔ)上，研究人員基于結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略得到的選擇性BD2抑制劑23（ABBV-744），其對BRD4 BD1的IC50為27.5 nmol · L-1，對BRD4 BD2的IC50為20.7 μmol · L-1?；衔顰BBV-744目前已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗階段[30]，用于治療前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤。在ABBV-744分別與BRD4 BD2和BRD4 BD1的晶體復合物結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，ABBV-744維持了ABBV-075所有重要的相互作用。ABBV-744的乙酰胺部分通過將酰胺埋在由BD2的His433、Tyr386和Pro430殘基形成的通道中，ABBV-744的2，6-二甲基苯醚利用Ile162（BD1）和Val435（BD2）的細微體積大小差異，芳基甲基埋入WPF口袋的剛性底部，BD2中較小的Val435殘基可以適應(yīng)這種甲基相互作用，而對于BD1蛋白，這種芳基甲基與體積較大Ile162殘基的相互作用迫使抑制劑稍微偏離Ile部分，這是對BD2產(chǎn)生選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。ABBV-744在前列腺癌細胞LNCaP小鼠異種移植模型中，在最高耐受劑量的1/12時，ABBV-744能夠產(chǎn)生顯著的抗腫瘤活性。而小鼠毒性研究中，ABBV-075經(jīng)口給藥劑量為3 mg · kg-1（LNCaP小鼠異種移植模型中有效暴露量的3倍），導致血小板減少59%，杯狀細胞丟失。相比之下，30 mg · kg-1的ABBV-744（有效暴露量的25倍）導致血小板減少僅20%，并且60 mg · kg-1（有效暴露量的47倍）不會導致杯狀細胞丟失或其他腸道缺陷。同樣，2.5 mg · kg-1的ABBV-075導致睪丸中的生殖細胞變性，而25 mg · kg-1劑量下的ABBV-744未觀察到睪丸中的變化。這些療效和耐受性結(jié)果共同表明，選擇性靶向BD2可以在某些癌癥環(huán)境中誘導抗腫瘤活性，同時緩解非選擇性BET抑制劑的關(guān)鍵耐受性問題。代謝實驗研究表明，ABBV-744主要由CYP3A4代謝，在小鼠和狗體內(nèi)的清除率較低，而在大鼠和猴子體內(nèi)的清除率適中，t1/2為2.0 ～ 4.4 h，口服生物利用度為7% ～77%，具有較好的成藥性。

南京中醫(yī)藥大學的研究者從中藥材金合歡屬植物大葉相思和堅葉相思樹干中提取得到的3，4，7，8-四羥基黃酮天然產(chǎn)物化合物24[31]，與其他已經(jīng)報道的BRD4抑制劑相比，這是BRD4選擇性抑制劑中一個新穎的化學骨架?；衔?4能夠選擇性抑制BRD4 BD2蛋白（BRD4 BD2 IC50= 204 nmol · L-1），其對BRD4 BD1的選擇性大于100倍（BRD4 BD1 IC50= 17.9 μmol · L-1）?；衔?4與BRD4 BD1和BRD4 BD2的2個共晶結(jié)構(gòu)都在相似的位置形成了3個氫鍵。在BRD4 BD2中，化合物24與Asn433和Tyr390附近的水分子形成2個氫鍵作用力，與Pro375的主鏈羰基形成第3個氫鍵；而在BRD4 BD1中，化合物24則分別和Asn140、Tyr97和Pro82形成氫鍵。3個氫鍵將化合物24的香豆素母核牢牢地固定在乙?；嚢彼峤Y(jié)合口袋中，此外，疏水殘基Val87、I146和Ile94（BRD4 BD1）或Val380、Val439和Lys387（BRD4 BD2）與化合物24形成強烈的疏水相互作用，在與BD2的共晶結(jié)構(gòu)中，化合物24的苯基的電子云密度比與BD1的電子云密度更低，顯示了更強的相互作用和更穩(wěn)固的空間構(gòu)象，化合物24與BD2結(jié)構(gòu)中的Asn433附近的水分子形成了1個氫鍵，同時可能與His437形成疏水相互作用；而在BD1該位置中對應(yīng)的殘基是氨基酸殘基Asp144，其側(cè)鏈距離化合物24太遠，無法形成有效的相互作用?；衔?4與非選擇性BRD4抑制劑RVX-208的母核結(jié)構(gòu)相似，但共晶復合物結(jié)構(gòu)顯示兩者的結(jié)合模式截然不同。體內(nèi)外藥效實驗表明，化合物24能夠在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平顯著降低原癌基因c-Myc的表達；在小鼠異種移植MV4-11腫瘤模型中，在50 mg · kg-1劑量下，腫瘤的大小明顯小于陰性對照組，在100 mg · kg-1劑量下，腫瘤的大小與50 mg · kg-1的（+）-JQ1治療組相當，且毒性較低。該化合物作為一個新穎的化學骨架，能夠作為一個良好的先導化合物來開展BRD4 BD2選擇性抑制劑的研究。

RVX-208（25）[32]是泛BD2抑制劑，目前處于Ⅲ期臨床試驗，用于治療與動脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病，AlphaScreen方法測定其對BRD4 BD1的IC50為87 μmol · L-1，而對BRD4 BD2的IC50為0.510 μmol · L-1，選擇性為170倍，對于BRD3的BD2和BD1，Kd分別為195和4 μmol · L-1。RVX-208與BRD2 BD2蛋白的共晶結(jié)構(gòu)表明RVX-208結(jié)構(gòu)上的喹唑啉酮環(huán)系統(tǒng)的羰基氧和1個氮原子充當乙酰賴氨酸模擬部分，與保守的天冬氨酸Asn140形成氫鍵，同時通過1個水分子與Tyr97形成氫鍵，RVX-208占據(jù)單個乙酰賴氨酸使用的整個通道，羥基乙醚部分從乙酰賴氨酸結(jié)合袋中伸出，BRD2中的BD2獨特殘基His433翻轉(zhuǎn)到乙酰賴氨酸結(jié)合位點，與RVX-208的苯環(huán)結(jié)合，與BRD4 BD2結(jié)構(gòu)域有更緊密的親和力，與BRD2 BD2蛋白表面接觸面積較少。然而，RVX-208與BRD4 BD1特有的殘基幾乎沒有直接相互作用，僅僅形成了與Gln85的水介導氫鍵，這解釋了RVX-208對BD2產(chǎn)生選擇性的原因。

3 結(jié)語與展望

目前，泛BRD4抑制劑由于不良反應(yīng)等問題在臨床研究中進展緩慢，開發(fā)選擇性BRD4抑制劑成為科研上亟待攻克的難題。而新一代的高選擇性BRD4 BD1或BD2抑制劑因其具有較好的安全性等優(yōu)勢，取代泛BRD4抑制劑成為開發(fā)選擇性BRD4抑制劑的趨勢。本文綜述了近年來報道過的對BRD4蛋白的BD1選擇性抑制劑和BD2選擇性抑制劑，產(chǎn)生選擇性的基礎(chǔ)在于化合物分子在不同的溴結(jié)構(gòu)域上與其獨有的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用，對BRD4 BD1產(chǎn)生選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)包括BD1結(jié)合口袋處的Asp144和產(chǎn)生堆積作用力的Asn93等關(guān)鍵氨基酸殘基，對BRD4 BD2產(chǎn)生選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)包括BD2結(jié)合口袋附近的Pro430、His433、Pro375和Tyr97等關(guān)鍵氨基酸殘基。同時天然產(chǎn)物分子化合物24特殊的骨架能產(chǎn)生對BRD4 BD2良好的選擇性，這為今后研究出高選擇性的BRD4 BD2抑制劑提供了思路，從天然產(chǎn)物中開發(fā)高選擇性BET抑制劑不失為一種良好的策略。目前已經(jīng)報道過的大部分選擇性抑制劑均是作用于乙酰賴氨酸的結(jié)合口袋處，通過競爭乙?；嚢彼醽硪种艬RD4蛋白的表達，而化合物ZL0590則作用于非乙?；嚢彼釁^(qū)域，以一種獨特的方式作用在BRD4蛋白內(nèi)部，同時能夠與BD1和BD2產(chǎn)生不同的作用，這打破了研究者的思路，即開發(fā)BRD4抑制劑不一定必須作用于乙?；嚢彼峤Y(jié)合口袋，這也開啟了今后開發(fā)選擇性BET抑制劑新的大門。

選擇性BD1或BD2抑制劑已表現(xiàn)出毒性低、特異性強的優(yōu)點。脫髓鞘疾病目前無有效根治措施，主要采取對癥和支持療法，BRD4 BD1選擇性抑制劑olinone能夠促進少突膠質(zhì)細胞祖細胞分化，或許這是未來脫髓鞘疾病的一種較有前景的治療方法。BRD4 BD1選擇性抑制劑RVX-208具有獨特的抗纖維化活性，今后可能在治療纖維化疾病中能發(fā)揮重要作用。多種BRD4 BD1選擇性抑制劑還在炎癥反應(yīng)中具有良好的治療優(yōu)勢，能夠下調(diào)多種炎癥因子水平，具有治療關(guān)節(jié)炎和COPD等炎癥因子導致疾病的潛力。BRD4 BD2選擇性抑制劑GSK620對銀屑病和非脂肪性肝炎具有良好的效果，BRD4 BD2選擇性抑制劑ABV-744則對前列腺癌有較好的作用。根據(jù)已經(jīng)報道的選擇性抑制劑，均表現(xiàn)出對多種腫瘤特異性強且耐受性高的效果，未來繼續(xù)開發(fā)具有選擇性的BRD4 BD1或BD2抑制劑或許能為許多尚未攻克的疾病如癌癥提供治療思路，解決人類在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的難題。