汪香涵 ，徐俊，費文龍 ，尤啟冬 *，郭小可 **

（1.中國藥科大學 江蘇省藥物分子設計與成藥性優(yōu)化重點實驗室，江蘇 南京，211198；2.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京，211198）

表觀遺傳學主要針對在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，對基因表達的可遺傳變化進行探究，主要涉及的機制包括DNA修飾、組蛋白修飾和RNA編輯修飾等[1]。RNA的動態(tài)修飾對生命體的多種生理過程具有至關重要的作用，如細胞周期調(diào)控、細胞增殖分化等。真核生物的RNA修飾位點主要包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）以及N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）等。其中m6A是信使RNA（message RNA，mRNA）修飾中最常見、最保守，同時也是目前RNA修飾研究的熱點之一[2]。哺乳動物細胞中的m6A修飾具有可逆性，其修飾過程如圖1所示。m6A的識別由m6A閱讀蛋白完成，而其甲基化修飾和去甲基化修飾則是由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和m6A去甲基化酶參與調(diào)控。

圖1 m6A的動態(tài)修飾Figure 1 Dynamic modification of m6A

2012年以前，由于缺乏具體的檢測手段，m6A在生物體內(nèi)的分布和作用并未明確。2012年，Dominissini等[3]發(fā)明了基于m6A的RNA甲基化免疫沉淀測序方法（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq），從此逐漸揭開了m6A的神秘面紗。m6A甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶復合體催化。甲基轉(zhuǎn)移酶復合體是由若干RNA甲基轉(zhuǎn)移蛋白組合而成，分別是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）結(jié)合蛋白——甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase-like protein 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14（methyltransferase-like protein 14，METTL14）和WT1-相關蛋白（WT1-associated protein，WTAP）[4]。其中METTL3起到催化作用，其內(nèi)源SAM結(jié)合口袋可將SAM上的甲基轉(zhuǎn)移至腺苷形成腺苷半胱氨酸；而METTL14的作用是穩(wěn)定甲基轉(zhuǎn)移酶復合體并識別特異性RNA作為催化底物；WTAP沒有催化作用，但它可招募METTL3和METTL14進入細胞核內(nèi)。當腺苷被甲基化后，這種化學修飾則被閱讀蛋白識別，影響后續(xù)RNA的剪切、轉(zhuǎn)錄以及降解。m6A閱讀蛋白主要包含YT521-B同源結(jié)構(gòu)域（YT521-B homology domain，YTH domain）的YTH家族蛋白以及其他潛在可與m6A結(jié)合的蛋白。它們已經(jīng)被證實可以通過募集不同的復合物靶向m6A修飾位點來參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。

2011年，Jia等[5]首次發(fā)現(xiàn)了FTO可催化核內(nèi)mRNA的去甲基化，2年后發(fā)現(xiàn)同蛋白家族的ALKBH5也是mRNA去甲基化酶[6]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，另一同源蛋白ALKBH3對tRNA上的m6A也有去甲基化活性[7]，它們均屬于Alkb同源蛋白家族。Alkb同源蛋白在哺乳動物中存在9種亞型，分別是ALKBH1 ～ ALKBH8和FTO（ALKBH9）。其中ALKBH2和ALKBH3是核DNA修復酶[8]；ALKBH3同時還是tRNA的去甲基化酶，作用位點為tRNA上的m1A、m3C和m6A[7]；而ALKBH5和FTO則是mRNA去甲基化酶。ALKBH8是tRNA修飾蛋白酶，可將tRNA中的5-羧甲基尿苷（5-carboxymethyluridine，cm5U）甲基化成5-甲氧羰基甲基尿苷（5-methoxycarbonylmethyluridine，mcm5U）[9]。隨后羥基化成（S）-5-甲氧羰基羥甲基尿苷[(S)-5-methoxycarbonylhydroxymethyluridine，S-mchm5U][10]。ALKBH1的生物學功能眾說紛紜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的包括DNA、tRNA、mRNA和組蛋白的去甲基化作用[11]。最近還發(fā)現(xiàn)其對堿基未正確配對的雙鏈DNA上的m6A有著較高的催化活性[12]。ALKBH4與肌動蛋白的去甲基化有關[13]。最近發(fā)現(xiàn)它還具有修復DNA m6A的功能[14]。ALKBH7是一種線粒體蛋白，與細胞的程序化凋亡有關[15]。而ALKBH6的相關生物學作用機制研究鮮有報道，尚需深入探究。

2012年，Chen等[16]報道了首個FTO小分子抑制劑——大黃酸；隨后又發(fā)現(xiàn)了FTO的選擇性抑制劑甲氯滅酸[17]；后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到的活性更好的小分子抑制劑FB-23，為FTO的生物學機制研究提供幫助[18]。近年來，已經(jīng)有多項研究證明m6A的異常豐度與許多惡性腫瘤有著密切的關系，如乳腺癌、肺癌、胃癌以及急性髓系白血病等[19-20]。因此m6A被許多學者認為是潛在的腫瘤治療靶點，對腫瘤的治療有著重要的理論依據(jù)和應用價值。本文針對m6A去甲基化酶從相關癌癥和小分子抑制劑研究進展等方面進行綜述，為相關領域藥物的進一步研發(fā)提供參考。

1 m6A去甲基化酶

1.1 m6A去甲基化酶FTO

最初FTO是作為肥胖相關蛋白被人們關注，與成人早發(fā)性肥胖和重度肥胖有關。隨著RNA表觀遺傳學研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)m6A參與到RNA的生理活動中，并且FTO能對m6A進行去甲基化修飾，在多種腫瘤調(diào)控中發(fā)揮重要作用。FTO屬于Fe2+和α-酮戊二酸（2-oxoglutaric acid，2-OG）依賴的加氧酶，能夠?qū)6A中的N-甲基氧化成羥甲基，形成N6-羥甲基腺嘌呤（N6-hydroxymethyladenosine，hm6A），羥甲基不穩(wěn)定，自發(fā)脫水失去1分子甲醛，得到腺嘌呤結(jié)構(gòu)（見圖2）。FTO發(fā)揮作用依賴2-OG和Fe2+，其中的關鍵氨基酸殘基His307、His231和Asp233參與金屬離子螯合，Glu234參與m6A底物識別過程，Try108參與RNA堿基識別[21]（見圖3）。

圖2 m6A的去甲基化過程Figure 2 Demethylation of m6A

圖3 m6A與FTO共晶復合物（PDB ID: 5ZMD）Figure 3 Cocrystal structure of FTO in complex with m6A（PDB ID: 5ZMD）

除了m6A外，F(xiàn)TO還有許多作用底物，如單鏈DNA中的N3-甲基胸腺嘧啶（N3-methylthymidine，m3T）和RNA中的N3-甲基尿嘧啶（N3-methyluridine，m3U）[22]。FTO的催化底物與定位分布密切相關，F(xiàn)TO不僅存在于細胞核中，在某些情況下也存在于細胞質(zhì)中。在細胞核中FTO作用底物為多聚腺苷酸（polyA）RNA中的m6A、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）中的N6，2'-O-二甲基腺苷（N6，2'-O-dimethyladenosine，m6Am）、tRNA中的m1A；而在細胞質(zhì)中則是polyA RNA中的m6A和m6Am、tRNA中的m1A[23]。最近，有研究指出FTO的最佳催化底物并非m6A，而是m6Am[24]。在FTO敲除的細胞中，m6A的總量變化不明顯，而m6Am明顯增加，這提示RNA上其他類型的甲基化修飾可能是FTO的主要作用底物。

隨著FTO相關的表觀遺傳學研究深入，越來越多的證據(jù)表明FTO與腫瘤的產(chǎn)生與增殖分化有著密切關系。在某些惡性腫瘤中，F(xiàn)TO呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，可能影響腫瘤的增殖與分化，如急性髓細胞白血病[25]、乳腺癌[26]、肝癌[27]、黑色素瘤[28]、胰腺癌[29]、膀胱癌[30]和胃癌[31]等。2017年，Li等[25]報道了FTO作為m6A去甲基化酶在急性髓細胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）中的病理功能。FTO在AML的某些亞型，如攜帶MLL1基因異位混合細胞系白血病（mixed lineage Leukemia，MLL）中高度表達。研究表明，F(xiàn)TO作為m6A去甲基化酶，通過調(diào)控錨蛋白重復序列-細胞信號抑制因子盒蛋白家族2（ankyrin repeat and SOCS box containing 2，ASB2）和維甲酸受體α（retinoic acid receptor alpha，RARA） mRNA上m6A的豐度，抑制全反式維甲酸（all-trans-retinoicacid，ATRA）誘導的AML細胞分化并促使白血病的發(fā)生（見圖4）。2018年Su等[32]發(fā)現(xiàn)化合物2R-羥基戊二酸（R-2-hydroxyglutarate，R-2HG）能抑制FTO蛋白的活性，使m6A的豐度增加，骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物（myeloma viral oncogene homolog，MYC）和CCAAT增強子結(jié)合蛋白基因（CCAAT enhancerbinding protein alpha，CEBPA）mRNA穩(wěn)定性下降，從而導致白血病細胞生長抑制、細胞周期阻滯和凋亡。2022年Zhou等[33]發(fā)現(xiàn)在T細胞急性淋巴細胞白血?。═-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）中，F(xiàn)TO升高可逆地降低了干擾素調(diào)節(jié)因子 8（interferon regulatory factor 8，IRF8）的m6A修飾，通過改變mRNA穩(wěn)定性來降低IRF8表達，F(xiàn)TO抑制劑FB23-2有效降低了IRF8的表達并延長了T-ALL小鼠的存活期。因此，針對FTO靶點開發(fā)小分子抑制劑在未來是一種可行的AML治療策略。

Niu等[34]在2019年研究發(fā)現(xiàn)FTO與乳腺癌有高度相關性，超過70%乳腺癌組織FTO過度表達；且與正常乳腺癌腫瘤組織相比，那些FTO高表達的組織細胞中的m6A甲基化水平降低。之后他們驗證了FTO是通過增加促凋亡因子B淋巴細胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）去甲基化水平，誘導其降解，從而促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。RNA-Seq分析確定BNIP3是FTO介導的m6A修飾的下游靶點，在FTO敲低的MDA-MB-231和MCF-7細胞系中均可觀察到BNIP3顯著上調(diào)，說明FTO可以作為乳腺癌的潛在治療靶標。此外，Xu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2)陽性乳腺癌細胞和組織高表達；且FTO異常表達量與腫瘤大小、細胞核分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等顯著相關。Kaplan-Meier曲線繪制總生存期與無病生存期表明，高FTO表達導致預后不良以及腫瘤的復發(fā)風險增加。在SKBR3和MDA-MB-453細胞中，F(xiàn)TO通過miR-181b-3p通路加速腫瘤細胞的遷移和侵蝕。最新研究發(fā)現(xiàn)，衰老中性粒細胞衍生的外泌體piRNA-17560增強了乳腺癌細胞中FTO的表達，F(xiàn)TO的上調(diào)通過降低m6A甲基化進一步加強ZEB6轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和表達，導致腫瘤細胞的化學耐藥性和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[35]。

除此之外，F(xiàn)TO還與肝癌的發(fā)生有關。多項實驗證明了FTO可促進肝癌細胞的體外增殖和轉(zhuǎn)移，如Ye等[27]利用siRNA敲低人肝癌細胞系HepG2的FTO基因后，檢測到m6A的水平顯著上升；CCK-8細胞增殖實驗表明下調(diào)FTO表達能抑制肝癌細胞的增殖；細胞劃痕實驗表明，F(xiàn)TO能促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲；而在肝內(nèi)膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）中，F(xiàn)TO表現(xiàn)出抑癌作用。Rong等[36]發(fā)現(xiàn)FTO可能通過降低致癌基因（TEAD2和CMTM4）表達和促進抑癌基因（HAO2、NR5A2、CCL19、TCF21、NTRK2和SCML4）表達來抑制ICC的發(fā)生。肺腺癌中FTO下調(diào)會增加YTHDF1與MYCmRNA的結(jié)合，促進MYCmRNA翻譯，進而促進腫瘤細胞糖酵解、增殖和腫瘤發(fā)生[37]。

在胰腺癌（pancreatic cancer，PC）中，F(xiàn)TO表達水平高于正常胰腺導管上皮細胞，F(xiàn)TO損失導致EMT性狀逆轉(zhuǎn)、腫瘤形成受損，并降低癌癥干細胞標志物的表達[38]。此外，F(xiàn)TO還可以通過降低m6A-YTHDF1介導的TFPI-1 mRNA的穩(wěn)定性來促進胰腺癌的發(fā)展[39]。在口腔鱗片狀細胞系中敲低FTO表達，導致編碼真核翻譯起始因子γ1基因（eIF4G1）下調(diào)，同時增強自噬通量和抑制腫瘤發(fā)生[40]。FTO還能通過FTO/miR-576/CDK6通路在膀胱癌中表現(xiàn)出致癌作用，并可能成為膀胱癌的潛在診斷或預后生物標志物[30]。

1.2 m6A去甲基化酶ALKBH5

2013年，Zheng等[6]發(fā)現(xiàn)了另一種m6A去甲基化酶ALKBH5，并發(fā)現(xiàn)它與生殖細胞的形成相關，在小鼠睪丸中檢測到高濃度的ALKBH5表達。敲除小鼠ALKBH5基因后檢測到小鼠的精子異常，產(chǎn)生的精子數(shù)量減少，小鼠生育能力受損。與FTO相比，ALKBH5對m6A具有更高的特異性。FTO的作用底物較為寬泛，對m6A、m3T、m3U都能進行去甲基化修飾；而目前發(fā)現(xiàn)ALKBH5只對m6A有催化活性[22]。FTO對雙鏈DNA、單鏈DNA和單鏈RNA在體外都有催化活性，而ALKBH5只特異性催化單鏈DNA和單鏈RNA。分析其原因可能是ALKBH5蛋白的氨基酸殘基Cys-230和Cys-267之間形成了二硫鍵，從而阻礙了雙鏈DNA進入ALKBH5的催化結(jié)合位點（見圖5）[41]。

圖5 ALKBH5 Cys-230與Cys-267之間二硫鍵示意圖Figure 5 Diagram of the disulfide bond between ALKBH5 Cys-230 and Cys-267

ALKBH5與FTO一樣，通過催化m6A去甲基化，調(diào)控m6A影響后續(xù)生理過程，如RNA剪切、翻譯和降解。ALKBH5的異常表達與許多腫瘤發(fā)生相關，如膠質(zhì)母細胞瘤[42]、乳腺癌[43]、急性髓細胞白血病[44]、肝癌[45]、卵巢癌[46]和非小細胞肺癌[47]等。

2016年，Zhang等[43]報道ALKBH5在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用。當乳腺癌細胞暴露在缺氧環(huán)境下時會產(chǎn)生缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor 1 alpha subunit，HIF-1α）和HIF-2α；而ALKBH5是HIF-1α的直接靶標，從而介導了ALKBH5的過量表達[48]。ALKBH5發(fā)揮m6A去甲基化作用，將NANOG基因的3'-UTR上的m6A殘基去甲基化，mRNA的穩(wěn)定性增加，從而引起NANOG高表達。導致乳腺癌細胞在缺氧腫瘤微環(huán)境中的富集，促進了體內(nèi)腫瘤的形成。2017年Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細胞瘤干細胞中ALKBH5高表達，沉默ALKBH5基因能抑制腫瘤的增殖。ALKBH5的異常表達能通過調(diào)控FOXM1來增強膠質(zhì)母細胞瘤的自我更新，并導致腫瘤的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄因子FOXM1與膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的增殖、自我更新等密切相關。

2020年，Shen等[49]研究揭示了ALKBH5可能在AML中發(fā)揮促癌作用。他們分析了TCGA以及其他若干AML數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ALKBH5下調(diào)在AML中非常罕見。接下來的一系列機制功能研究揭示了ALKBH5通過調(diào)控穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄相關酸性卷曲蛋白3基因（transforming acidic coiled-coil-containing protein 3，TACC3）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA，導致TACC3表達增加（見圖6）；且TACC3在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤的發(fā)生和白血病干細胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用。2020年，Wang等[44]發(fā)現(xiàn)ALKBH5是AML腫瘤發(fā)生的一個關鍵調(diào)控因子，白血病干細胞染色質(zhì)的改變通過KDM4C-ALKBH5-AXL信號通路誘導AML發(fā)生。ALKBH5的表達是受染色質(zhì)狀態(tài)改變的調(diào)控，KDM4C能通過增加MYC和PolⅡ的染色質(zhì)開放性來調(diào)控ALKBH5的表達。2023年，Li等[50]發(fā)現(xiàn)肌苷三磷酸酶（inosine triphosphatase，ITPA）是ALKBH5的重要功能靶標。在機制上，ALKBH5使ITPA mRNA去甲基化并增加其mRNA穩(wěn)定性，從而增強ITPA表達。此外，轉(zhuǎn)錄因子TCF15在白血病干細胞/起始細胞（leukemia stem/initiating cells，LSC/LIC）中特異性表達，負責ALKBH5在t（8; 21）AML中的表達失調(diào)。

圖6 ALKBH5促進AML的發(fā)生[49]Figure 6 ALKBH5 promotes tumorigenesis in acute myeloid leukemia

Zhu等[46]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過miR-7和Bcl-2通路抑制上皮性卵巢癌的自噬。他們發(fā)現(xiàn)與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中的ALKBH5表達量增加。機制研究證明，ALKBH5可以激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）信號通路，調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移以及自噬。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌中，ALKBH5過表達還逆轉(zhuǎn)了ITGB1 mRNA中的m6A修飾，并抑制了YTHDF2蛋白介導的m6A依賴性ITGB1 mRNA降解，導致ITGB1表達增加以及黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和Src原癌基因蛋白的磷酸化，從而增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[51]。

除了上述促癌情況外，ALKBH5還在多種腫瘤疾病中發(fā)揮抑癌作用。如Chen等[45]發(fā)現(xiàn)ALKBH5在肝癌中表達下調(diào)[45]；體外實驗證明，ALKBH5能在體外抑制肝癌細胞的增殖和侵蝕能力。含LY6/PLAUR結(jié)構(gòu)域1（LY6/PLAUR domain containing 1，LYPD1）為可能的下游靶點，利用MeRIP-qPCR實驗檢測發(fā)現(xiàn)敲除ALKBH5可以使LYPD1的3'-UTR m6A水平上升，而ALKBH5表達上調(diào)可導致該位點m6A水平下降。2023年，Wang等[52]發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過以m6A依賴性方式下調(diào)孕激素和脂聯(lián)素分子受體4（progestin and adipoQ receptor family member 4，PAQR4）表達來抑制肝癌細胞生長，從而抑制PI3K/AKT通路的激活。Guo等[53]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5可以通過m6A-YTHDF2依賴性方式轉(zhuǎn)錄激活周期晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器1基因（period circadian regulators 1，PER1）來抑制胰腺癌的發(fā)展。Zhang等[54]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中，DDIT4-AS1被確定為ALKBH5的下游靶標之一，ALKBH5介導的m6A修飾導致DDIT4-AS1過表達，DDIT-AS1通過破壞DDIT4的穩(wěn)定性和激活mTOR途徑來增加癌癥干性并抑制對吉西他濱的化學敏感性。在結(jié)直腸癌中，ALKBH5下調(diào)與結(jié)直腸癌患者預后不良密切相關，敲低ALKBH5增強了體外LOVO細胞的增殖、遷移和侵襲，ALKBH5通過降低PHF20 mRNA甲基化來抑制結(jié)直腸癌進展。ALKBH5介導的PHF20 mRNA的m6A修飾可以作為干預和治療結(jié)直腸癌的有效策略[55]。

1.3 DNA修復蛋白ALKBH3

2005年Konishi等[56]在前列腺中分離得到一種高表達的蛋白，最初被命名為前列腺癌抗原-1（prostate cancer antigen-1，PCA-1）。隨后的研究發(fā)現(xiàn)它是Alkb的同源蛋白，故稱為ALKBH3[57]。ALKBH3是一種DNA修復蛋白，可以通過氧化脫烷基對烷基化損傷的DNA進行修復，對單鏈DNA和單鏈RNA有著高選擇性，能去甲基化m1A和m3C。近期研究還發(fā)現(xiàn)其對tRNA具有去甲基化作用[7]。ALKBH3在多種惡性腫瘤中存在高表達，如非小細胞肺癌[58]、胰腺癌[59]和前列腺癌[56]等，并且與腫瘤的不良預后顯著相關。因此ALKBH3可能是某些腫瘤治療的潛在靶點。

Koike等[57]探究了ALKBH3與前列腺癌的相關性，并發(fā)現(xiàn)前列腺癌中ALKBH3高表達，但在良性前列腺增生和正常前列腺上皮細胞中正常表達。通過siRNA轉(zhuǎn)染實驗敲低非激素依賴的前列腺癌細胞株中的ALKBH3，抑制了細胞的生長以及誘導細胞凋亡。實體瘤小鼠實驗也證明，抑制ALKBH3能顯著抑制腫瘤的生長，推測是通過PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)；但具體的RNA去甲基化與AKT活性之間的關系尚不明確。針對ALKBH3開發(fā)抑制劑可能是治療去勢耐藥前列腺癌（castrate resistant prostate cancer，CRPC）的有效方法。2012年，Yamato等[59]發(fā)現(xiàn)ALKBH3與胰腺癌發(fā)生有關。在大多數(shù)人類胰腺癌組織中ALKBH3高表達，在非癌組織中未見表達。利用siRNA轉(zhuǎn)染敲低胰腺癌細胞系PANC-1和MIAPaCa-2上的ALKBH3基因，觀測到細胞凋亡和抗血管生成。隨后，他們又研究了ALKBH3與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的關系，推測VEGF與胰腺癌的發(fā)生密切相關。結(jié)果顯示隨著細胞內(nèi)ALKBH3的下調(diào)，VEGF的表達顯著降低，提示ALKBH3與血管生成相關，可能是VEGF的上游通路。

2011年，Tasaki等[58]通過siRNA轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)或體外抑制ALKBH3的表達均能誘導非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）的衰老并抑制其生長。他們還發(fā)現(xiàn)，隨著ALKBH3被敲低，p21和p27的水平也下降，推測抑制ALKBH3可以下調(diào)p21和p27的表達，從而抑制腫瘤生長。p21和p27均是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族中的重要成員，既與腫瘤抑制作用密切相關，又能通過抑制周期素依賴激酶（cyclindependent kinases，CDKs）復合物活性，協(xié)調(diào)細胞周期、DNA復制與修復之間的關系。此外，2017年Kogaki等[60]發(fā)現(xiàn)ALKBH3與TP53基因有關。在NSCLC中，降低ALKBH3蛋白的表達會導致細胞周期阻滯或者凋亡，這取決于TP53基因的狀態(tài)。攜帶野生型TP53基因的NSCLC細胞阻滯停在G2/M期；而攜帶突變TP53基因的NSCLC細胞則發(fā)生細胞凋亡。

除了前列腺癌、胰腺癌和非小細胞肺癌外，有研究指出ALKBH3能通過去甲基化調(diào)控巨噬細胞集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）mRNA中的m1A，延長了CSF-1的半衰期，調(diào)控卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生[61]。然而也有相關報道，ALKBH3在乳腺癌中表達量不高，并且檢測到大多數(shù)ALKBH3的啟動子CpG區(qū)域發(fā)生甲基化修飾，導致ALKBH3表達降低，DNA m3C烷基化損傷積累[62]。有研究表明乳腺癌的發(fā)生與DNA修復能力缺陷相關，而ALKBH3正是一種DNA修復蛋白，因此ALKBH3下調(diào)可能與乳腺癌發(fā)生有關。

2 m6A去甲基化酶小分子抑制劑

2.1 FTO小分子抑制劑

FTO作為m6A的去甲基化酶，發(fā)揮RNA去甲基化作用需要Fe2+和2-OG輔助。因此其小分子抑制劑主要分為3種類型：金屬離子螯合抑制劑、2-OG類似物和m6A競爭性抑制劑。前2類抑制劑選擇性不強，開發(fā)價值有限。本節(jié)主要針對m6A競爭性抑制劑進行綜述。

2.1.1 大黃酸Chen等[16]在2012年報道了首個FTO小分子抑制劑。他們通過高通量虛擬篩選以及后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物大黃酸（1）（見圖7）。隨后利用等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）、蛋白熱漂移實驗以及CD圓二色譜等方法驗證了大黃酸與FTO蛋白結(jié)合能力，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測得大黃酸對FTO具有一定的抑制作用，IC50為30 μmol · L-1。為進一步驗證大黃酸對FTO的結(jié)合模式，他們測試了大黃酸在不同金屬離子濃度條件下對FTO的抑制活性。因其活性不受金屬離子濃度的影響，故推測大黃酸是m6A的底物競爭性抑制劑。隨后測試了大黃酸在細胞水平上對FTO的抑制能力，在BE（2）-C細胞中給藥24 h后監(jiān)測到明顯的m6A水平上升，證明大黃酸可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的m6A水平。

圖7 化合物FB23-2（4）的優(yōu)化過程Figure 7 Structural optimization of FB23-2（Compound 4）

2.1.2 甲氯滅酸及其衍生物Huang等[17]繼而在2015年報道了一種FTO的選擇性小分子抑制劑。通過高通量熒光偏振篩選方法，得到對FTO與ALKBH5具有選擇性的抑制劑——甲氯滅酸（meclofenamic acid，MA，2）。通過DNA PAGE實驗驗證了MA在酶水平上對FTO有抑制活性（IC50為30 μmol · L-1），而對ALKBH5沒有活性。進一步利用MA與FTO晶體復合物的信息確定了FTO核酸識別序列（nucleotied recognition lid，NRL）中的一段loop區(qū)與MA有疏水相互作用（見圖8）；而ALKBH5中缺少這段loop區(qū)，闡明了MA對FTO的選擇性抑制原因。隨后2019年該課題組基于對MA進行的一系列結(jié)構(gòu)改造，得到了活性更好的化合物FB23（3，IC50為60 nmol · L-1）（見圖7和8）[18]。盡管FB23的靶標活性很高，但由于其理化性質(zhì)不佳導致細胞活性較差（在NB4細胞系中抑制活性為44.8 μmol · L-1，在MONOMAC6中抑制活性為23.6 μmol · L-1），為改善FB23的溶解性和透膜性，將FB23的羧基用羥胺縮合封閉得到了化合物FB23-2（4），F(xiàn)B23-2在NB4和MONOMAC6細胞系的抗細胞增殖活性得到了很大提升，分別為0.8和1.5 μmol · L-1。FB23-2在體外可以顯著地抑制AML細胞增殖，促進細胞分化與凋亡，而對敲除FTO的AML細胞未顯示出明顯的抗增殖活性。進一步的研究驗證了FB23-2是通過抑制m6A去甲基化酶FTO的活性，導致AML細胞中m6A水平上升，并抑制了下游通路MYC和CEBPA基因的表達。

圖8 MA及FB23與FTO結(jié)合模式Figure 8 Combination mode of MA or FB23 with FTO

2.1.3 CS1和CS2Su等[63]在2020年也報道了2個FTO小分子抑制劑，其在細胞上對FTO的抑制活性優(yōu)于FB23-2，達到了納摩爾水平。通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選策略以及后續(xù)細胞抗增殖實驗和熒光偏振實驗，從NCI DTP數(shù)據(jù)庫中篩到2個在酶靶標水平對FTO有抑制活性的小分子CS1（5）和CS2（6）。CS1是一種含有蒽環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，從20世紀80年代開始便被作為多種癌癥的臨床藥物使用。CS2是一種二氫乳清酸脫氫酶抑制劑，能阻斷嘧啶的生物合成。通過FTO蛋白與化合物的核磁共振分析（nuclear magnetic resonance，NMR）觀察到劑量依賴的信號衰減，證明了CS1、CS2確實能與FTO蛋白結(jié)合。隨后的細胞抗增殖實驗表明，在FTO高表達的AML細胞系中該化合物表現(xiàn)出很好的抑制活性，而在FTO低表達的AML細胞中活性變?nèi)?。對FTO高表達的細胞株進行FTO基因的敲除后，細胞對CS1和CS2的敏感度降低，這說明CS1和CS2對細胞的抑制與FTO的表達有關，間接說明了化合物通過抑制FTO來調(diào)控m6A水平。之后的小鼠AML動物模型實驗也證明CS2可以改善白血病狀況，提高小鼠的整體存活率。

2.1.4 18077和18097Xie等[64]于2022年報道了2種FTO小分子抑制劑。通過虛擬篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了化合物18077（7）和18097（8）可以選擇性地抑制FTO的去甲基化酶活性。18097通過結(jié)合到FTO的活性部位，從而抑制細胞周期過程和癌癥細胞的遷移和侵襲。此外，18097對人乳腺癌細胞的表觀轉(zhuǎn)錄組進行了重新編程，尤其是與P53通路相關的基因，18097增加了細胞因子信號傳導抑制因子1基因（SOCS1）的mRNA水平，其募集IGF2BP1以增加SOCS1的mRNA穩(wěn)定性，隨后激活P53信號通路。此外，18097通過下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）和C/EBPβ來抑制細胞脂肪生成。動物研究證實，18097可以顯著抑制乳腺癌細胞的體內(nèi)生長和肺部定植。

2.1.5 其他抑制劑除了上述抑制劑外，還有一些課題組報道了部分FTO小分子抑制劑。如Toh等[22]在2015年報道的系列化合物，其活性最好的化合物9對FTO的酶抑制活性為0.81 μmol · L-1。

He等[65]發(fā)現(xiàn)化合物N-CDPCB（10），酶活性IC50為4.95 μmol · L-1。2016年發(fā)現(xiàn)CHTB（11），通過蛋白-晶體復合物信息發(fā)現(xiàn)其與N-CDPCB的結(jié)合模式類似，IC50為39.24 μmol · L-1。2018年報道的根赤殼菌素（Radicicol，12），IC50為16.04 μmol · L-1，并通過ITC手段確證其可與蛋白在體外結(jié)合[66]。2019年探究了一類苯并咪唑類化合物2位氯取代對FTO活性的影響，該類化合物13的IC50為24.65 μmol · L-1[67]。同年發(fā)現(xiàn)了一種咔唑類天然產(chǎn)物Clausine E（14），IC50為27.8 μmol · L-1[68]。2019年該課題組通過老藥新用方法，發(fā)現(xiàn)萘莫司他苯磺酸鹽（15），IC50為13.77 μmol · L-1[69]。

Wang等[70]發(fā)現(xiàn)熒光素衍生物FL1（16）（FTO IC50= 6.55 μmol · L-1）和FL2（17）（FTO IC50= 1.72 μmol · L-1）作為雙功能分子，可以同時抑制和標記FTO蛋白，選擇性抑制細胞內(nèi)外的FTO去甲基化。通過晶體學闡明該熒光抑制劑的構(gòu)效關系，并為FTO去甲基化抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供方向。此外，該策略還實現(xiàn)了FTO的下游生化分析，如活細胞中FTO蛋白的可視化和FTO富集。該熒光抑制劑可作為潛在的工具分子以研究FTO在m6A介導的表觀遺傳過程中發(fā)揮的作用。

2019年，Peng等[71]通過虛擬篩選和分子對接等手段篩選已上市藥物數(shù)據(jù)庫，得到FTO抑制劑恩他卡朋（Entacapone，18），IC50為3.5 μmol · L-1。通過對該化合物的構(gòu)效關系研究得到活性化合物19，其IC50為0.7 μmol · L-1。借助蛋白-化合物晶體復合物明確了恩他卡朋與FTO的結(jié)合模式。

McMurray等[72]在2015年報道了IOX3（20），是一種脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain protein，PHD2）抑制劑；但之后的研究表明它對多種2-OG加氧酶例如FTO、PHD2都有抑制活性，能非共價競爭結(jié)合催化位點，其對FTO的IC50為2.76 μmol · L-1。

2.2 ALKBH3小分子抑制劑

2014年，Nakao等[73]報道了一系列ALKBH3抑制劑。他們通過虛擬篩選市售化合物庫中的17 000個小分子，得到苗頭化合物21，后續(xù)的結(jié)構(gòu)經(jīng)優(yōu)化得到一系列苯并咪唑類化合物。其中HUHS015（22）為活性最好的化合物，在體外實驗和小鼠移植瘤模型中均有良好的抑制率。為了提高溶解度，該課題組研究了HUHS015不同種類的鹽，并最終采用鈉鹽（23）開展后續(xù)藥代動力學實驗[74]。遺憾的是，HUHS015在大鼠體內(nèi)不穩(wěn)定，容易被肝代謝失活。用大鼠肝均漿在15℃處理HUHS015 10 min后僅剩42%，37℃條件下完全被代謝[75]。為改善化合物溶解度以及易被肝代謝的特點，他們進行了新一輪結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終得到化合物HUHS119（24）。經(jīng)口給藥后能在血清中保持一定濃度，并且在酶水平（IC50= 2.9 μmol · L-1）和細胞水平（10 μmol · L-1時抑制率為81%）上有著較好抑制活性（見圖9）。

圖9 化合物HUHS119（24）的優(yōu)化過程Figure 9 Structural optimization of HUHS119（Compound 24）

2018年Das等[76]利用動態(tài)組合化學的手段篩選得到苗頭化合物，將其中相對不穩(wěn)定的羰基酰腙基團結(jié)構(gòu)替換成相對穩(wěn)定的羰基磺酰胺結(jié)構(gòu)，得到一系列ALKBH3和FTO的選擇性抑制劑。利用蛋白熱漂移實驗和HPLC驗證化合物對ALKBH蛋白家族的結(jié)合活性及酶水平活性，發(fā)現(xiàn)了ALKBH3選擇性抑制劑化合物25和FTO選擇性抑制劑化合物26。利用分子對接軟件分析，發(fā)現(xiàn)可能是由于化合物26的4-三氟甲基苯基的空間構(gòu)象原因，與Tyr143產(chǎn)生位阻，無法伸入ALKBH3結(jié)合口袋。但這無法解釋化合物25對ALKBH3的選擇性，還需要后續(xù)共晶復合物研究輔助分析。同年，Nigam等[77]報道了一系列二氫茚酮類衍生物，對ALKBH3有著中等抑制活性。后續(xù)利用ITC結(jié)合實驗、HPLC酶活實驗等驗證了化合物27對蛋白的靶標活性，并進行了細胞抗增殖實驗。在非小細胞肺癌細胞系A549中測得EC50約為18.7 μmol · L-1，還需進行后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造優(yōu)化工作。

2.3 ALKBH5小分子抑制劑

同樣作為m6A的RNA去甲基化酶，對FTO的同源蛋白ALKBH5的小分子抑制劑相關研究相對較少，還處于起步階段。目前已經(jīng)報道的幾種抑制劑多數(shù)屬于泛抑制劑，包括N-草酰乙二酰甘氨酸（N-oxalylglycine，NOG）和2，4-吡啶二羧酸（pyridine 2，4-dicarboxylate，2，4-PDCA）等；或是在其他同源蛋白抑制劑研究中發(fā)現(xiàn)的非選擇性抑制劑，這些泛抑制劑普遍對ALKBH5抑制活性較低。如Chen等[16]在2012年報道的首個FTO小分子抑制劑大黃酸，測試其對FTO同源蛋白的抑制活性，發(fā)現(xiàn)大黃酸對ALKBH2、ALKBH3[78]和ALKBH5都有微弱的活性。Das等[76]在2018年報道的FTO和ALKBH3選擇性抑制劑中，也有若干化合物對ALKBH5有微弱活性。最近有研究報道了基于熒光共振轉(zhuǎn)移法篩選得到對FTO抑制的天然產(chǎn)物[79]。其中一些天然產(chǎn)物對ALKBH5也有泛抑制作用，如大黃素、茜素紅、白花丹素等。

前述化合物IOX3（16）是首個報道的可與ALKBH5產(chǎn)生共價作用的抑制劑[21]，通過共晶衍射手段，IOX3能特異性地與ALKBH5結(jié)構(gòu)域中的Cys200以二硫鍵形式結(jié)合。IOX3最初作為PHD抑制劑被開發(fā)；但之后的研究發(fā)現(xiàn)其對2-OG加氧酶，如FTO、PHD2等均存在抑制活性，能非共價競爭結(jié)合于催化位點，對于ALKBH5而言則是通過芳香親核取代反應共價結(jié)合在氨基酸殘基Cys200上（見圖10）。

圖10 IOX3與ALKBH5結(jié)合模式Figure 10 Combination mode of IOX3 with ALKBH5

Malacrida等[80]報道了ALKBH5抑制劑MV1035（28）。他們通過SPILLO-PBSS軟件反向篩選MV1035可能作用的靶點，并通過斑點印記實驗、細胞抗增殖實驗進行驗證。在U87-MG細胞系中MV1035的IC50為（2.48±0.65）μmol · L-1；但該研究并未進行靶標層面的結(jié)合實驗，只有斑點印記實驗輔助進行了定性驗證。除此之外，Li等[81]也報道了一個ALKBH5抑制劑ALK-04，并進行了小鼠體內(nèi)抗腫瘤實驗，但其結(jié)構(gòu)并未公開。

Selberg等[82]報道了2種ALKBH5抑制劑（化合物29和30），它們可以在低微摩爾范圍內(nèi)抑制3種白血病細胞系HL-60、CCRF-CEM和K562的增殖。Takahashi 等[83]發(fā)現(xiàn)新的小分子抑制劑Ena15（31）和Ena21（32），能夠抑制ALKBH5的去甲基化活性，而對FTO沒有抑制活性，并測試了化合物對人多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）細胞抗增殖活性。

2022年，F(xiàn)ang等[84]報道了一類新的含有1-芳基-1H-吡唑骨架的ALKBH5抑制劑。通過基于熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）的篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關系分析，獲得了活性最佳的化合物20m（33）（FP IC50= 21 nmol · L-1）。相對于FTO以及其他ALKB亞家族成員，化合物20m對ALKBH5表現(xiàn)出高選擇性。細胞熱位移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）表明，20m可以有效穩(wěn)定HepG2細胞中的ALKBH5。斑點印跡分析表明，20m可以提高細胞中的m6A水平。

3 結(jié)語與展望

作為中心法則的關鍵中間環(huán)節(jié)，RNA將DNA與蛋白質(zhì)緊密聯(lián)系。RNA的修飾與后續(xù)翻譯、RNA降解等過程關系密切。目前，RNA修飾已經(jīng)成為表觀遺傳學研究的熱門領域。細胞內(nèi)的RNA中存在著100多種不同的化學修飾，其中甲基化修飾包括m6A、m5C、m1A 等。而最常見最保守的RNA甲基化修飾是m6A，近幾年有大量研究揭示了m6A與包括腫瘤、病毒感染等疾病的相關性。

哺乳動物細胞中的m6A修飾具有可逆性。m6A可被m6A閱讀蛋白識別，其甲基化和去甲基化過程分別由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和m6A去甲基化酶參與調(diào)控。m6A的甲基化動態(tài)修飾在多種腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用。靶向m6A去甲基化酶設計小分子抑制劑來調(diào)控m6A動態(tài)過程已經(jīng)成為一種潛在的治療癌癥的新策略。目前基于FTO的相關腫瘤通路、小分子抑制劑研究的較多，已有高活性和高選擇性的小分子抑制劑報道，如Huang等[17-18]報道的MA、FB23和FB23-2，Su等[63]報道的CS1和CS2等。針對ALKBH5，目前的小分子抑制劑的研究尚處于起步階段，還有待進行更多、更深入的生物學和化學研究。ALKBH3最近也逐漸受到人們的關注，小分子抑制劑的報道呈上升趨勢，但后續(xù)化學生物學相關研究依然較少，并且尚未有更多的文章證據(jù)表明ALKBH3針對RNA上m6A位點的修飾。目前報道的m6A去甲基化酶小分子抑制劑大多為2-OG的類似物，如IOX3、大黃酸等。這些化合物的主要問題是選擇性不高，對其他2-OG依賴的酶也有抑制作用。針對底物m6A結(jié)合區(qū)域設計選擇性小分子抑制劑是未來的發(fā)展趨勢之一，如FB-23針對FTO和ALKBH5的一段疏水loop區(qū)實現(xiàn)對FTO蛋白的選擇性抑制。開發(fā)更多結(jié)構(gòu)類型的FTO選擇性抑制劑以及對FTO抑制后的生物學效應研究依然是后續(xù)研發(fā)的重點。而如何針對ALKBH家族亞型的細微差異實現(xiàn)ALKBH5、ALKBH3等蛋白之間的選擇性將是其他m6A去甲基化酶小分子抑制劑研發(fā)的重點和難點。

作為目前RNA修飾研究熱點領域，大量研究發(fā)現(xiàn)m6A與腫瘤等疾病的相關性[25-28]；但依然有很多問題待研究解決。如導致腫瘤疾病的具體分子機制，m6A修飾的下游信號通路以及相關RNA如何做到特定的甲基化修飾等。針對m6A去甲基化酶報道的小分子抑制劑有望成為關鍵的工具分子，幫助研究人員進一步闡明m6A的相關生物學機制。希望在國內(nèi)外研究者的推動下，未來可以針對特定腫瘤，開發(fā)出安全有效的m6A去甲基化酶抑制劑來調(diào)控m6A水平，進而干擾腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，推動腫瘤疾病的治療。