洪奕倫,王建豐,張 進(jìn)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿科,上海 200127)

2016年世界衛(wèi)生組織的腎臟腫瘤分類首次提出了遺傳性平滑肌瘤病及腎細(xì)胞癌綜合征(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma,HLRCC)相關(guān)性腎癌這一分類,HLRCC是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,由延胡索酸水合酶 (fumarate hydratase,FH)基因胚系突變所致[1-2],臨床特征表現(xiàn)為多發(fā)的皮膚平滑肌瘤、女性多發(fā)子宮肌瘤及早發(fā)的侵襲性腎癌[3]。由于HLRCC相關(guān)性腎癌與FH基因體系突變腎癌均具有侵襲性高、預(yù)后差等生物學(xué)行為,2022年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)腎臟腫瘤分類第五版[4]將二者統(tǒng)稱為FH缺陷型腎癌。目前對于FH缺陷型腎癌尚無有效根治手段,且對于晚期轉(zhuǎn)移患者也無統(tǒng)一治療方案。本文通過RNA-seq、RT-qPCR及免疫組化染色等實驗發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)在FH缺陷型腎癌中高表達(dá),且LDHA抑制劑[(R)-GNE-140]處理FH缺陷型腎癌細(xì)胞具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,因此我們提出了抑制LDHA是FH缺陷型腎癌潛在治療方式的假設(shè)。然而,目前尚無LDHA抑制劑及其聯(lián)合腎癌靶向藥物應(yīng)用于FH缺陷型腎癌的相關(guān)性研究,故本文將探索LDHA抑制劑及其聯(lián)合靶向藥物在FH缺陷型腎癌細(xì)胞中的作用,為FH缺陷型腎癌新的治療方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19按既往文獻(xiàn)報道方法培養(yǎng)[5]。體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸及DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。組織標(biāo)本取自上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科2016—2019年間進(jìn)行腎癌手術(shù)的患者(研究通過仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書),2例男性,4例女性,年齡19～71歲,平均年齡45歲,腎癌臨床分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)分期第8版,Ⅰ期2例,Ⅱ期1例,Ⅲ期3例,其中3例經(jīng)病理及基因檢測確診為FH缺陷型腎癌,3例為Ⅱ型乳頭狀腎癌(FH缺陷型腎癌最常見的病理類型為乳頭狀Ⅱ型),取癌組織及癌旁組織進(jìn)行檢測分析。HiScript?Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司,LDHA抗體購自美國Abcam公司;(R)-GNE-140、卡博替尼購自美國MCE公司,阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼、培唑帕尼、依維莫司購自美國Selleck公司,磺酰羅丹明B購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1FH缺陷型腎癌組織RNA-seq測序 RNA高通量測序由北京邁基諾基因科技公司(中國)進(jìn)行檢測。首先用Trizol試劑從組織中提取總RNA,并使用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀測量所得RNA的完整性和總量。使用Illumina平臺進(jìn)行RNA文庫構(gòu)建,后用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行測序,并產(chǎn)生150 bp配對末端讀數(shù)。測序片段被高通量測序儀測得,圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA 堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(reads),使用HISAT2 (v2.0.5) 將配對末端clean reads 與參照基因組比,Feature Counts(1.5.0-p3)用于計算映射到每個基因的讀數(shù),使用DESeq2 軟件(1.20.0)進(jìn)行兩個比較組合之間的差異表達(dá)分析。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測FH缺陷型腎癌組織LDHA mRNA表達(dá) 由于FH缺陷型腎癌組織樣本數(shù)量有限,取上述FH缺陷型腎癌和Ⅱ型乳頭狀腎癌組織及癌旁組織各2例,采用Trizol法研磨提取組織總RNA,HiScript? Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并以cDNA為模板采用實時熒光定量PCR試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,南京諾唯贊生物科技公司)檢測LDHA mRNA的表達(dá)水平。LDHA以β-actin作為內(nèi)參,引物均由上海派諾森生物科技公司合成,LDHA的正向引物5′-GGTTGGTGCTGTTGGCATGG-3′,反向引物5′-TGCCCCAGCCGTGATAATGA-3′;β-actin的正向引物5′-TCCTATGTGGGCGACGAG-3′,反向引物：5′-ATGGCTGGGGTGTTGAAG-3′。β-actin作為內(nèi)參對照,采用2-△△Ct方法檢測LDHA mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3FH缺陷型腎癌組織LDHA免疫組織化學(xué)染色 將1.2.2中的2例FH缺陷型腎癌組織及1例正常腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋及組織切片,經(jīng)過切片水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶消除、抗原封閉步驟后,再使用LDHA一抗和二抗孵育、DAB顯色和蘇木精復(fù)染以檢測FH缺陷型腎癌組織切片中LDHA基因的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4FH缺陷型腎癌細(xì)胞株功能實驗 使細(xì)胞處于對數(shù)期生長,消化、離心后加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)后以每孔90 μL種于96孔板中,其中UOK262細(xì)胞5 000個/孔,CL19細(xì)胞3 000個/孔,12 h后細(xì)胞完全貼壁后加入藥物。藥物包括LDHA抑制劑(R)-GNE-140,上市靶向藥物6種(阿昔替尼、卡博替尼、舒尼替尼、索拉非尼、培唑帕尼、依維莫司),藥物母液濃度為10 mmol/L,LDHA抑制劑首濃度100 μmol/L,靶向藥物首濃度為10 μmol/L(依維莫司為1 μmol/L),以2倍梯度稀釋(依維莫司為10倍梯度稀釋)藥物,6個梯度配置藥物,用排槍每孔加入10 μL不同濃度的藥物,每個濃度設(shè)置3個副孔,對照孔加入等量的生理鹽水,混勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h。

根據(jù)單藥實驗結(jié)果,選用0.5 μmol/L阿昔替尼、0.5 μmol/L索拉非尼、0.01 μmol/L依維莫司、5 μmol/L卡博替尼、10 μmol/L培唑帕尼、3 μmol/L舒尼替尼與LDHA抑制劑進(jìn)行初步聯(lián)用,LDHA抑制劑初始濃度為20 μmol/L,2倍梯度稀釋藥物設(shè)置6個梯度。進(jìn)一步根據(jù)LDHA抑制劑與靶向藥物單濃度聯(lián)合用藥結(jié)果,對LDHA抑制劑與卡博替尼、索拉非尼、培唑帕尼分別各進(jìn)行10∶1、1∶1、1∶10等比例濃度聯(lián)用,初始濃度為20 μmol/L或2 μmol/L,2倍梯度濃度稀釋藥物5個梯度配置藥物,加藥混勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h。

72 h后用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法染色：首先每孔加100 μL 4 ℃預(yù)冷10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA),4 ℃冰箱固定1 h,用去離子水洗板5遍,室溫晾干。后加SRB染液染色30 min,然后用1%冰醋酸沖洗96孔板,室溫晾干。最后每孔加100 μL非緩沖Tris-base堿液,用酶標(biāo)儀以560 nm波長,空白孔調(diào)零,檢測96孔板吸光度(A)值。計算細(xì)胞抑制率并繪制抑制率曲線。

1.2.5藥物聯(lián)合指數(shù)計算 SRB法檢測LDHA抑制劑單獨(dú)用藥及LDHA抑制劑聯(lián)合靶向藥物用藥對FH缺陷型腎癌細(xì)胞生長的抑制率,并將計算得到的存活率用聯(lián)合用藥軟件CompuSyn分析處理,計算最佳藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)。CI<1提示兩藥存在協(xié)同作用,CI>1提示兩藥存在拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 RNA-seq、RT-qPCR及免疫組化染色結(jié)果FH缺陷型腎癌組織RNA表達(dá)情況測序分析結(jié)果顯示,在FH缺陷型腎癌組織中LDHA的表達(dá)高于癌旁組織的表達(dá)(P=0.045),且顯著高于Ⅱ型乳頭狀腎癌組織(P=0.020)及其癌旁組織(P=0.041)中的表達(dá)(圖1A)。

A：RNA-seq結(jié)果顯示FH缺陷型腎癌組織中LDHA的表達(dá)顯著升高;B：RT-qPCR結(jié)果顯示FH缺陷型腎癌組織中LDHA mRNA的相對表達(dá)量顯著升高。

采用RT-qPCR對FH缺陷型腎癌組織中LDHA表達(dá)情況進(jìn)一步驗證,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,FH缺陷型腎癌組織中LDHA mRNA的相對表達(dá)量(3.42±0.24、4.92±0.39),Ⅱ型乳頭狀腎癌組織中為(0.51±0.03、0.53±0.02),FH缺陷型腎癌組織中LDHA mRNA的相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ型乳頭狀腎癌及癌旁組織(P<0.001,圖1B)。我們進(jìn)一步利用免疫組化染色對FH缺陷型腎癌組織中LDHA的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示FH缺陷型腎癌組織中LDHA染色呈強(qiáng)陽性,而正常腎臟組織呈弱陽性(圖2),進(jìn)一步證實了FH缺陷型腎癌組織中LDHA蛋白表達(dá)上調(diào)。上述RNA-seq、RT-qPCR及免疫組化染色的實驗結(jié)果均驗證了FH缺陷型腎癌組織中LDHA的高表達(dá),提示LDHA可能在FH缺陷型腎癌中發(fā)揮重要作用。

A：FH缺陷型腎癌組織-1;B：FH缺陷型腎癌組織-2;C：正常腎組織。

2.2 LDHA抑制劑及靶向藥物對FH缺陷型腎癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用我們應(yīng)用LDHA抑制劑(R)-GNE-140及腎癌上市靶向藥物處理FH缺陷型腎癌細(xì)胞。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示LDHA抑制劑(R)-GNE-140可有效抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19的增殖(圖3A),其IC50分別為49.35 μmol/L和52.44 μmol/L。而在靶向藥物組中,我們發(fā)現(xiàn)卡博替尼、索拉非尼及舒尼替尼對UOK262和CL19細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用。在CL19組中,各靶向藥物IC50分別為舒尼替尼6.37 μmol/L、卡博替尼8.26 μmol/L、索拉非尼11.28 μmol/L;而在UOK262組IC50分別為舒尼替尼6.59 μmol/L、卡博替尼7.75 μmol/L、索拉非尼1.143 μmol/L(圖3B、C)。單藥實驗的結(jié)果顯示,LDHA抑制劑及靶向藥物卡博替尼、索拉非尼及舒尼替尼對UOK262和CL19細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用。

A：LDHA抑制劑顯著抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19的增殖;B：靶向藥物對FH缺陷型腎癌細(xì)胞CL19增殖的抑制作用;C：靶向藥物對FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262增殖的抑制作用。

2.3 LDHA抑制劑分別與靶向藥物聯(lián)合用藥對FH缺陷型腎癌細(xì)胞增殖具有抑制作用在LDHA抑制劑與6種靶向藥物單濃度聯(lián)合用藥實驗中,細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示LDHA抑制劑(R)-GNE-140和靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)單濃度聯(lián)用結(jié)果提示藥物聯(lián)用能進(jìn)一步抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19的增殖。在CL19和UOK262細(xì)胞中20 μmol/L和10 μmol/L的LDHA抑制劑與3種單濃度靶向藥物聯(lián)用具有明顯的細(xì)胞抑制作用(圖4A、B)。

A：CL19細(xì)胞中20 μmol/L LDHA抑制劑(R)-GNE-140和靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)單濃度聯(lián)用顯著增強(qiáng)了細(xì)胞增殖的抑制作用;B：UOK262細(xì)胞中10 μmol/L LDHA抑制劑(R)-GNE-140和靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)單濃度聯(lián)用顯著增強(qiáng)了細(xì)胞增殖的抑制作用;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

進(jìn)一步將LDHA抑制劑與靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)等比例濃度梯度聯(lián)合用藥結(jié)果表明,CL19細(xì)胞中LDHA抑制劑與靶向藥物卡博替尼、培唑帕尼以及索拉非尼在10∶1、1∶10及10∶1的等比例濃度梯度聯(lián)用下CI<1,提示兩藥有協(xié)同作用,且CI值越小表明協(xié)同作用越強(qiáng)(圖5A～F),而兩藥在2∶20或20∶2的濃度下由于單藥的增殖抑制作用強(qiáng)出現(xiàn)拮抗作用(CI>1)。

3 討 論

FH缺陷型腎細(xì)胞癌是一種罕見的高度惡性腎細(xì)胞癌,發(fā)病率尚不明確。FH缺陷型腎細(xì)胞癌可由延胡索酸水合酶胚系或體系突變所致,其中最常見的是由胚系突變所致的一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病——HLRCC[3]。法國學(xué)者M(jìn)ULLER等[6]對全法國2004-2016年間來自114個家庭的182例HLRCC患者展開了追蹤研究,發(fā)現(xiàn)19%的患者有腎細(xì)胞癌史,且其中82%的患者在確診時即已轉(zhuǎn)移或在3年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中位生存期僅為18個月。另一項研究顯示[7],FH缺陷型腎癌患者初診時57%為T3～4期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占52%,遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移占19%,中位隨訪17.5個月(1～114個月),39%患者死亡、26%患者疾病進(jìn)展。FH缺陷型腎癌發(fā)病年齡早(據(jù)文獻(xiàn)報道最小的腎癌患者僅7歲[8]),影像學(xué)表現(xiàn)不典型及病理形態(tài)多變使得臨床診斷變得困難,且由于其侵襲性高,易早期出現(xiàn)淋巴結(jié)及骨等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,但目前缺乏有效的治療方案。因此,對于FH缺陷型腎癌,新治療靶點的探索十分重要。

Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞能量代謝的重要特征,即在氧氣含量正常的條件下,腫瘤細(xì)胞中通過糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸并產(chǎn)生三磷酸腺苷,從而滿足腫瘤細(xì)胞快速生長增殖的能量需求。LDHA是細(xì)胞糖酵解中的關(guān)鍵限速酶,是調(diào)控乳酸代謝的重要靶點。在缺氧條件下腫瘤細(xì)胞中LDH催化丙酮酸生成乳酸并產(chǎn)生氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,提升糖酵解水平,使細(xì)胞外pH值下降,產(chǎn)生的乳酸又可被腫瘤細(xì)胞攝取進(jìn)而參與供能[9-10]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)LDHA在多種腫瘤中如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、口腔鱗癌等中表達(dá)升高[11-14],且與這些惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。腫瘤中如c-Myc、HIF-1α、CREB、熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat-shock factor 1,HSF1)、叉頭蛋白 M1 (forkhead box protein M1,FOXM1)等轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)LDHA的轉(zhuǎn)錄水平[15],從而激活有氧糖酵解。乳酸能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞免疫代謝,影響細(xì)胞中干擾素(interferon,IFN)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤區(qū)域的免疫抑制[16]。乳酸的增多引起蛋白酶對細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解,通過引起血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的釋放參與血管生成,驅(qū)動腫瘤的轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散[17]。

FH缺陷型腎癌中,FH基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化的受損,導(dǎo)致細(xì)胞的假性缺氧,供能更依賴于糖酵解。延胡索酸是一種競爭性抑制脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)的腫瘤代謝物,破壞了HIF1α和HIF2α的羥基化[18],細(xì)胞內(nèi)HIF水平的升高改變了一些蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子(如GLUT1、NRF2和AMPK)的活性,HIF下游的LDHA、VEGF、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)基因激活,從而促進(jìn)腫瘤生長[19],相關(guān)研究也進(jìn)一步佐證了FH缺陷型腎癌組織中LDHA的高表達(dá)是由于延胡索酸積累引起的HIF-1α途徑激活所致[20-21]。因此,LDHA可能為FH缺陷型腎癌的潛在治療靶點。本研究通過RNA-seq、qPCR及免疫組化的結(jié)果證實了FH缺陷型腎癌組織中LDHA的高表達(dá)。為探索LDHA抑制劑和腎癌靶向藥物在體外實驗中對FH缺陷型腎癌細(xì)胞增殖的影響,我們通過單藥的實驗表明LDHA抑制劑及靶向藥物卡博替尼、索拉非尼、舒尼替尼對FH缺陷型腎癌細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。且進(jìn)一步的藥物聯(lián)用實驗表明卡博替尼、培唑帕尼及索拉非尼與LDHA抑制劑聯(lián)合用藥有協(xié)同抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞增殖作用,提示LDHA抑制劑與腎癌靶向藥物聯(lián)合用藥可能為FH缺陷型腎癌的潛在治療方案。

綜上所述,本研究證明了LDHA在FH缺陷型腎癌中呈現(xiàn)高表達(dá),LHDA抑制劑能夠抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞的增殖,且聯(lián)合靶向藥物能進(jìn)一步增加抑制作用,為FH缺陷型腎癌的治療提供新的可能性,但具體的作用機(jī)制及后續(xù)的體內(nèi)模型驗證還有待深入研究和探索。