謝金龍

(濰坊市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,山東濰坊 261000)

不孕不育癥嚴(yán)重影響著人類的生殖健康[1],發(fā)病率高達(dá)15%～20%,其中男性因素占到50%[2]。無(wú)精子癥是男性不育的嚴(yán)重類型,分為梗阻性無(wú)精子癥(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性無(wú)精子癥(nonobstructive azoospermia,NOA)2大類,其中OA約占40%、NOA約占60%。NOA主要是由精子發(fā)生或者成熟障礙引起,其病因復(fù)雜,包括隱睪、腮腺炎引起的睪丸炎后遺癥等繼發(fā)性睪丸損傷、Klinefelter綜合征、Y染色體微缺失、基因突變等。目前缺乏使患者恢復(fù)生精功能的治療策略,有研究行術(shù)前激素治療[3]、改善睪丸生精微環(huán)境[4]、干細(xì)胞療法[5]等策略,希望找到精子結(jié)合卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)獲得遺傳學(xué)子代。本文就非梗阻性無(wú)精子癥的遺傳學(xué)病因及治療研究進(jìn)展予以綜述。

1 遺傳學(xué)病因

1.1 NOA與基因突變NOA常與基因突變有關(guān),目前有超過(guò)2 000個(gè)基因已被證明與人類精子發(fā)生有關(guān)[6]?？截悢?shù)變異(copy number variation,CNV)和單核苷酸多態(tài)性也是男性不育的危險(xiǎn)因素,但是很少有研究提供功能和生物學(xué)證據(jù)來(lái)驗(yàn)證這些變異為致病基因[7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,TEX11和TEX15在NOA不育男性中發(fā)生突變,導(dǎo)致減數(shù)分裂停止[8-9]。WU[10]、YANG等[11]報(bào)道TDRD9、FOXP3導(dǎo)致精原干細(xì)胞的凋亡,TEX11、SYCE1、PAK1、ADGRG2、TEX14、KASH5導(dǎo)致減數(shù)分裂阻滯,SOHLH1、ZMYND15、DMC1、PABPC1、WT1、CFAP65、RNF212等導(dǎo)致NOA。

1.2 NOA與DNA甲基化MCSWIGGIN等[12]研究表明DNA甲基化異?？赡軐?dǎo)致男性不育。雄性生殖細(xì)胞的DNA甲基化從有絲分裂和減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞開(kāi)始,減數(shù)分裂粗線期階段完成[13]。精子中異常的DNA甲基化可能導(dǎo)致男性不育并將其遺傳給后代,而后代在以后的生活中可能更容易患上疾病。吸煙對(duì)DNA甲基化也有很大的影響,它通過(guò)改變MAPK8IP和TKR基因區(qū)域的CpG甲基化模式,導(dǎo)致精子數(shù)量減少、活力下降和精子形態(tài)缺陷[14]。生殖相關(guān)基因Nme2、Trim27、ICR、H19、SNRPN、Sort和Pebp1的低甲基化對(duì)小鼠精子發(fā)生和精子活力產(chǎn)生了負(fù)面影響[15]。SOX30啟動(dòng)子處的DNA高甲基化有助于其在NOA中的表達(dá)沉默,SOX30水平的降低與NOA疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。SOX30在小鼠體內(nèi)的缺失會(huì)損害生精細(xì)胞和阻滯精子發(fā)生,導(dǎo)致雄性不育,但是SOX30不影響卵巢發(fā)育和女性生育能力[16]。

1.3 NOA與染色體異常和Y染色體微缺失

1.3.1染色體異常 遺傳疾病是無(wú)精子癥的主要原因之一,包括染色體異常、單基因疾病、多基因疾病、表觀遺傳疾病等[17]。Klinefelter綜合征是NOA中最常見(jiàn)的染色體異常疾病,而少精子癥在常染色體結(jié)構(gòu)缺陷男性中更為常見(jiàn)[18]。Klinefelter綜合征是導(dǎo)致不育癥的主要原因之一,典型表現(xiàn)為小睪丸、性腺功能減退和認(rèn)知障礙。Klinefelter綜合征與心血管異常、自身免疫性疾病、代謝紊亂、認(rèn)知或精神健康問(wèn)題相關(guān),也可能增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[19]。

2 NOA患者的治療策略

2.1 激素優(yōu)化治療內(nèi)源性睪酮(intratesticular testosterone,ITT)水平低下、睪酮與雌二醇比例異?？赡芘cNOA的病理生理學(xué)有關(guān)[25],因此以改善精子發(fā)生的激素生精微環(huán)境為目的的治療可能有益。王澍弘等[26]報(bào)道38例NOA患者應(yīng)用來(lái)曲唑治療后有1例患者精液中發(fā)現(xiàn)了精子,37例患者的Johnsen評(píng)分較前改善。LAURSEN等[27]報(bào)道了8例NOA患者,給予每周2次人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)治療,結(jié)果提示促性腺激素治療后改善了生精功能,4例患者睪丸中找到了精子。在一項(xiàng)非隨機(jī)多中心研究中,442例男性NOA患者接受了取精手術(shù),激素優(yōu)化治療組的精子獲取率(57%)優(yōu)于未行激素優(yōu)化治療組(34%)[28]。盡管文獻(xiàn)表明激素優(yōu)化治療可能對(duì)NOA患者有益,但現(xiàn)有證據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量不足以推薦激素優(yōu)化治療作為標(biāo)準(zhǔn)臨床治療方案。

睪酮是精子發(fā)生過(guò)程中的必需激素,它通過(guò)對(duì)miRNA的調(diào)節(jié)有助于維持支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的緊密連接。睪酮的缺失會(huì)導(dǎo)致血睪屏障的破壞,發(fā)育中的精子生殖細(xì)胞從支持細(xì)胞過(guò)早脫離,并阻止成熟精子從支持細(xì)胞釋放以及生殖細(xì)胞被吞噬[29]。血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和睪酮都是促進(jìn)精子完全發(fā)生所必需并且兩種激素對(duì)精子發(fā)生有協(xié)同作用,FSH調(diào)節(jié)睪丸功能并刺激支持細(xì)胞產(chǎn)生雄激素結(jié)合球蛋白,這有助于維持較高的ITT濃度[30]。

2.1.1血清激素水平與精子獲取的關(guān)系 LI等[31]研究表明術(shù)前FSH水平并不能良好預(yù)測(cè)NOA患者顯微取精手術(shù)獲精率。在行顯微取精的患者中,血清FSH水平較高(>15 mU/mL)和FSH水平較低的NOA患者有更高的獲精率。NOA患者中,基礎(chǔ)血清FSH水平與精子發(fā)生和精子獲取率無(wú)關(guān)[32],因此其預(yù)測(cè)NOA患者對(duì)激素治療的反應(yīng)性欠佳。CAROPPO等[3]通過(guò)研究進(jìn)行分析,指出睪酮水平正常比睪酮水平低下的克氏征患者有更高的精子獲取率。同樣國(guó)內(nèi)安庚教授團(tuán)隊(duì)[33]一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究分析,針對(duì)395例NOA患者給予顯微取精術(shù)前HCG/HCG加高純度尿FSH治療3個(gè)月,結(jié)果顯示術(shù)前促性腺激素治療組和非促性腺激素治療組獲精率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(31.2%vs.19.5%),使用傾向性評(píng)分加權(quán)-逆處理概率加權(quán)法(inverse probability of treatment weighting,IPTW)進(jìn)行多變量邏輯回歸模型分析顯示術(shù)前促性腺激素治療與獲精率之間存在相關(guān)性(OR1.59;95%CI：1.02～2.52;P=0.042)。因此,血清FSH水平高或非常高不應(yīng)阻止使用外源性FSH刺激精子發(fā)生。

2.1.2睪丸顯微取精術(shù)(microdissection testicular sperm extraction,MD-TESE)術(shù)前接受激素治療 研究發(fā)現(xiàn)外源性促性腺激素對(duì)恢復(fù)無(wú)精子癥伴促性腺功能減退的男性的精子發(fā)生有效。盡管部分NOA患者存在較高的FSH和LH水平,依然術(shù)前進(jìn)行激素治療來(lái)改善精子發(fā)生的睪丸微環(huán)境,使得Leydig細(xì)胞對(duì)高劑量HCG刺激產(chǎn)生的睪酮產(chǎn)生反應(yīng)[34]。同時(shí)由于睪酮和抑制素B對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的負(fù)反饋減弱導(dǎo)致促性腺激素脈沖頻率和幅度的改變來(lái)保持激素應(yīng)答,因而可以使用外源性促性腺激素或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑來(lái)改變內(nèi)源性促性腺激素分泌改善生精環(huán)境,促進(jìn)精子生成。有研究表明,與單純HCG刺激相比,FSH加HCG刺激支持細(xì)胞雄激素受體(androgen receptor,AR)表達(dá)增加[35]。在REIFSNYDER等[36]的研究中,接受激素治療(n=307)和不接受激素治療(n=41)的睪酮水平低下的NOA患者獲精率沒(méi)有差異;而在HUSSEIN等[28]的研究中,接受激素治療的男性的獲精率(61.7%,306/496)明顯高于未接受激素治療的男性(33.6%,39/116),10.9%(54/496)的患者在治療后精液中發(fā)現(xiàn)了精子。

現(xiàn)有研究的結(jié)果雖然表明有希望改善NOA患者獲精率,但不足以推薦每個(gè)NOA患者行激素治療[37]。正如美國(guó)泌尿外科學(xué)會(huì)(American Association of Urology,AUA)/美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)(American Society of Reproductive Medicine,ASRM)關(guān)于男性不育的診斷和管理指南,NOA患者應(yīng)該在手術(shù)干預(yù)前被告知有限的藥理學(xué)的數(shù)據(jù)[38-39]。

2.1.3激素優(yōu)化治療未來(lái)需求及方向 NOA患者的管理在很大程度上是基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。由于過(guò)去20年的文獻(xiàn)提供的證據(jù),大約50%的NOA患者可能成功地獲得他們的睪丸精子,與其他可用的手術(shù)技術(shù)相比,顯微取精在獲精率方面提供了更好的結(jié)果[40]。對(duì)睪酮水平正常與低下患者的獲精率的研究表明,在顯微取精治療前,睪酮水平低下的NOA患者行激素優(yōu)化治療,可能改善獲精率。ITT在睪丸內(nèi)的濃度比血液循環(huán)中的濃度高100～1 000倍,但目前在人和動(dòng)物身上維持精子發(fā)生的合適ITT濃度尚不明確。為了提高我們?cè)谶@一領(lǐng)域的知識(shí),識(shí)別能夠可靠預(yù)測(cè)ITT水平并用于治療后ITT水平監(jiān)測(cè)的血清生物標(biāo)志物可能會(huì)有所幫助。因此,血清17-OHP和INSL3水平在一定程度上與ITT水平相關(guān),這可能為新的研究方向提供思路。

在NOA患者中,FSH對(duì)于促進(jìn)精原細(xì)胞增殖至關(guān)重要[41]。盡管許多研究都對(duì)FSH治療男性少精子癥的可行性進(jìn)行了研究,但是很少有研究試圖評(píng)估單獨(dú)使用FSH提高NOA患者獲精率的效果。事實(shí)上,FSH可能獨(dú)立于睪酮維持精子產(chǎn)生,這一發(fā)現(xiàn)在激活FSHR突變的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠中發(fā)現(xiàn),這可能促使進(jìn)一步研究高劑量FSH治療男性NOA。

激素治療是否有助于提高NOA患者的生殖潛能,研究時(shí)設(shè)計(jì)大樣本量、嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)指標(biāo)至關(guān)重要。目前證據(jù)不足以支持NOA患者術(shù)前不加選擇地使用激素治療。

2.2 生精微環(huán)境改善治療NOA深入研究生理狀態(tài)下生精微環(huán)境的建立和成熟過(guò)程,是理解NOA患者發(fā)病原因和病程的重要理論基礎(chǔ)。ZHAO等[42]發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞的成熟是生精微環(huán)境功能形成過(guò)程中的關(guān)鍵事件。未成熟的支持細(xì)胞處于以氧化磷酸化為主的活躍代謝狀態(tài),成熟的支持細(xì)胞主要通過(guò)糖酵解途徑進(jìn)行低水平的能量代謝。該團(tuán)隊(duì)以正常發(fā)育圖譜作為標(biāo)尺,通過(guò)對(duì)比3類最常見(jiàn)的NOA(克氏綜合征、Y染色體微缺失和特發(fā)性NOA)睪丸組織單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)特發(fā)性NOA支持細(xì)胞表現(xiàn)為發(fā)育過(guò)程的譜系退化;而同樣缺乏生殖細(xì)胞的Y染色體微缺失和克氏綜合征患者,其支持細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡、異常免疫反應(yīng)和激素代謝紊亂等病理性變化。該團(tuán)隊(duì)分析發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活是幼稚型支持細(xì)胞和特發(fā)性NOA支持細(xì)胞共有的典型特征,提示其在調(diào)控支持細(xì)胞成熟中的重要作用。雖然Wnt/β-catenin通路在所有患者中都被激活,但Wnt/βcatenin通路的負(fù)調(diào)控因子HOPX在Stage_a支持細(xì)胞中不表達(dá),而在Stage_c細(xì)胞中高表達(dá)。HOPX被認(rèn)為是通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞成熟的。通過(guò)抑制Wnt信號(hào)的抑制劑處理細(xì)胞,成功地促進(jìn)了支持細(xì)胞的部分成熟,其可以維持精原性干細(xì)胞的增殖,提示其支持、營(yíng)養(yǎng)生殖細(xì)胞功能的改善[43]。

在NOA患者中,支持細(xì)胞具有明顯不成熟和異質(zhì)性。生殖細(xì)胞本身也會(huì)影響微環(huán)境中的細(xì)胞,恢復(fù)成熟的微環(huán)境可能激活局部的生精灶。

2.3 干細(xì)胞治療NOA干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞。根據(jù)來(lái)源可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)及成體干細(xì)胞(adult stem cells,ASCs)。ESCs指早期胚胎中的全能干細(xì)胞,ASCs指組織中可定向分化為特異組織的干細(xì)胞,如精原干細(xì)胞(spermatogonia stem cells,SSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 等。

ZHOU等[44]報(bào)道了來(lái)自小鼠ESCs在體外誘導(dǎo)成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(primordial germ cell like cells,PGCLCs),PGCLCs與KITW/KITW-V小鼠出生早期睪丸細(xì)胞共培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)了體外完整的減數(shù)分裂產(chǎn)生,獲得單倍體精子樣細(xì)胞,ICSI后產(chǎn)生可育的后代。人成纖維細(xì)胞來(lái)源的重編程hiPS在BMP4、BMP8等細(xì)胞因子誘導(dǎo)下可以形成PGCLCs、減數(shù)分裂前的生殖細(xì)胞、減數(shù)分裂細(xì)胞、單倍體配子樣細(xì)胞,但尚未能形成成熟精子并產(chǎn)生胚胎。但倫理問(wèn)題、成瘤性及免疫排斥反應(yīng)制約了ESCs 的臨床應(yīng)用。

人SSCs和支持細(xì)胞在體外共培養(yǎng)產(chǎn)生圓形精子,注射到人卵子可受精并形成囊胚,但胚胎并不能夠達(dá)到桑葚胚階段,且伴有染色體異常。目前,人SSCs體外增殖培養(yǎng)雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn),但是培養(yǎng)難度大,長(zhǎng)期培養(yǎng)SSCs會(huì)發(fā)生表型改變,且尚未實(shí)現(xiàn)人SSCs 體外誘導(dǎo)分化形成精子,距離臨床應(yīng)用也有距離[45]。SLCs是一類睪丸間質(zhì)細(xì)胞,可分泌睪酮影響睪丸微環(huán)境,可增殖并定向分化為間質(zhì)細(xì)胞。ZANG等[46]通過(guò)移植CD51+、Nestin+的SLCs能夠使小鼠雄激素水平升高,通過(guò)調(diào)節(jié)睪丸生精微環(huán)境改善生精功能,恢復(fù)生育力。

3 總結(jié)與展望

隨著arrays-CGH、GWAS、WGS、NGS等新型高通量方法的快速發(fā)展,越來(lái)越多的潛在致病基因和與不育癥相關(guān)的新基因被發(fā)現(xiàn),為明確NOA的遺傳學(xué)病因提供了參考依據(jù),從而為尋求NOA治療靶點(diǎn)提供研究思路。NOA患者雖然經(jīng)過(guò)激素治療、干細(xì)胞療法、改善生精微環(huán)境、睪丸顯微取精等手段,約50%患者可以獲取到精子通過(guò)ICSI獲取子代,滿足患者的生育需求,但是仍有很大比例的NOA患者無(wú)法獲得精子,只能通過(guò)供精來(lái)生育子代,帶來(lái)了許多倫理與社會(huì)問(wèn)題。因此未來(lái)仍需要通過(guò)大樣本、高質(zhì)量的研究來(lái)評(píng)估改善生精功能,明確預(yù)測(cè)指標(biāo)、如何提高獲精率將是下一步工作的重點(diǎn)。