沈旭峰，施愛軍，張雪松，王扣群

1.如東縣中醫(yī)院檢驗科，江蘇如東 226400；2.如東縣中醫(yī)院內(nèi)科，江蘇如東 226400

近些年，隨著廣譜抗菌藥物的長期大量使用，細(xì)菌耐藥性增強，耐碳青霉烯類藥物腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem resistant enterobacteriaceae, CRE）檢出率也在不斷提高。此類細(xì)菌所致感染性疾病具有一定復(fù)雜性，治療難度較大，已經(jīng)成為臨床抗感染治療的棘手問題[1]。腸桿菌科細(xì)菌耐碳青霉烯類藥物的機制復(fù)雜，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是主要機制，該物質(zhì)能夠明顯水解碳青霉烯類抗生素的beta-內(nèi)酰胺酶，從而使細(xì)菌耐藥[2]。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是檢測碳青霉烯酶耐藥基因的金標(biāo)準(zhǔn)，不過此法技術(shù)條件要求嚴(yán)苛，而且操作繁瑣，檢測成本高、效率低，同時也會受檢測基因數(shù)量、引物突變、樣本污染等原因而出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況，限制了基層醫(yī)院常規(guī)實驗室開展[3]。Carba NP 試驗與改良碳青霉烯類失活法（modified carbapenem inactivation method, mCIM）試驗是近年應(yīng)用于臨床的兩種碳青霉烯酶檢測方法，本文以2021 年3 月—2022 年6 月如東縣中醫(yī)院檢驗室分離出的60 株腸桿菌科細(xì)菌為例，探究兩種方法的檢測效能，以期尋找適合基層醫(yī)院開展的碳青霉烯酶檢測方法，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院臨床分離的60 株CRE，標(biāo)本來源：痰液標(biāo)準(zhǔn)31 株，尿液標(biāo)本12 株，胸腹水標(biāo)本9 株，血液標(biāo)準(zhǔn)6 株，傷口拭子標(biāo)本2 株。細(xì)菌種類：肺炎克雷伯菌39 株，大腸埃希菌11 株，產(chǎn)氣腸桿菌10 株。其中30 株耐碳青霉烯。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①本院收治患者住院期間臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，標(biāo)本類型與具體菌種不限；②耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌的折點判定參照CLSI2017 年標(biāo)準(zhǔn)[4]，即美羅培南和亞胺培南至少一種最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）≥4 μg/mL。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)分離的菌株；②檢測數(shù)據(jù)資料不全。

1.3 方法

1.3.1 Carba NP 試驗方法 每例菌株準(zhǔn)備兩個EP試管，分別標(biāo)記試驗管A 及對照管B。在每支EP 試管中加入100 μl 的細(xì)菌蛋白抽提液，然后用10 μl接種環(huán)從血平板上挑取受試菌株（菌株已復(fù)蘇），分別加入裝有提取液的EP 管中，進(jìn)行充分振蕩混勻后，將100 μl A 液（0.05%酚紅與0.1 mmol/L ZnSO4的混合檢測液）、100 μl B 液（A 液中加入6 mg/mL 亞胺培南西司他丁鈉）分別加入上述EP 管中，完成后在37℃溫度條件下進(jìn)行孵化培育2 h，期間每隔0.5 h 對其顏色變化進(jìn)行觀察記錄一次。

1.3.2 mCIM 試驗方法 用10 μl 接種環(huán)從血培養(yǎng)基取1 滿環(huán)待測菌株將其置于含有400 μl 蒸餾水的EP 試管中，振蕩器混勻后，放入10 μg 美羅培南藥敏試紙片1 張，在37℃溫度條件下進(jìn)行培育至少2 h 后，孵育臨近結(jié)束時用0.9%氯化鈉溶液制備0.5 MCF 的大腸埃希菌（ATCC 25922）菌懸液，均勻涂布于M-H 平板，取出美羅培南藥敏試紙片，將其貼在涂布大腸埃希菌質(zhì)控菌株的M-H 平板上，繼續(xù)放置37℃條件下培養(yǎng)6 h 后進(jìn)行結(jié)果觀察分析。

1.3.3 碳青霉烯酶耐藥基因PCR 檢測方法 嚴(yán)格按照有關(guān)試劑盒說明書要求操作，提取細(xì)菌DNA 后，采用PCR 擴增試驗進(jìn)行碳青霉烯酶常見基因類型檢測，包括blaKPC、blaIMP、blaNDM-1、blaVIM。PCR 擴增由本院PCR 實驗室ABI-7500 儀器進(jìn)行，產(chǎn)物測序委托上海生工生物工程公司檢測，測序結(jié)果提交BLAST 程序進(jìn)行比對，確定耐藥基因的基因型。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計Carba NP 試驗和mCIM 試驗對細(xì)菌碳青霉烯酶的檢出情況。以碳青霉烯酶耐藥基因PCR 檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計算Carba NP 試驗與mCIM 試驗檢測碳青霉烯酶的臨床效能（靈敏度、特異度）。

實驗過程及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照CLSIM100-525文件推薦方法，實驗同時設(shè)置陰陽性質(zhì)控對照和空白對照。Carba NP 試驗判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：B 相對于A 顏色由紅色變化成橙或黃色后，表示結(jié)果為陽性，顏色無變化，為陰性，出現(xiàn)其他顏色為無效。mCIM 試驗判定標(biāo)準(zhǔn)[6]：按照實驗操作說明，對產(chǎn)碳青霉細(xì)菌菌株試驗結(jié)果顯示美羅培南藥敏試紙片周圍不存在抑制圈，即表示實驗結(jié)果為陽性，反之則為陰性。mCIM 試驗/Carba NP 試驗與金標(biāo)準(zhǔn)診斷均為陽性—真陽性，與金標(biāo)準(zhǔn)診斷均為陰性—真陰性，試驗陽性但金標(biāo)準(zhǔn)陰性—假陽性，試驗陰性但金標(biāo)準(zhǔn)陽性—假陰性[7]。靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%。特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用例（n）和率（%）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

基于金標(biāo)準(zhǔn)，Carba NP 試驗檢測腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為90.00%（27/30）、93.33%（28/30），見表1。mCIM 試驗檢測腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為93.33%（28/30）、100.00%（30/30），見表2。兩種試驗方法的靈敏度與特異度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 Carba NP 試驗與金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果比較(n)

表2 mCIM 試驗與金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果比較(n)

3 討論

編碼碳青霉烯酶的基因位于可移動的遺傳原件上，可以通過質(zhì)粒等傳遞給其他敏感細(xì)菌，導(dǎo)致耐藥基因傳播，造成CRE 流行甚至爆發(fā)。因此，檢測腸桿菌科細(xì)菌的碳青霉烯酶十分必要，可以為抗感染治療及減少耐藥菌傳播提供重要依據(jù)。

Carba NP 試驗是由Pa-trice Nordmann 領(lǐng)導(dǎo)的團隊于2012 年提出的碳青霉烯酶檢測新方法，后于2015 年被美國CLSI 抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)操作文件（M100-S25）引入，推薦用于感染控制和流行病學(xué)研究[8]。此法采用比色法原理，適用于腸桿菌科、不動菌屬和假單胞菌屬碳青霉烯酶的表型檢測，可以對細(xì)菌細(xì)胞裂解形成的蛋白抽提液和亞胺培南進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)碳青霉烯酶對碳青霉烯類藥物的水解作用使其開環(huán)后產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH 值降低，促使檢驗液中的酚紅出現(xiàn)變色反應(yīng)，進(jìn)而通過觀察顏色變化來判斷試驗菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶[9-10]。此法不僅可以區(qū)分沒有碳青霉烯酶活性的碳青霉烯酶易感菌，同時也可以區(qū)分產(chǎn)碳青霉烯酶機制與產(chǎn)生超廣譜β 內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶過表達(dá)引起細(xì)胞外膜通透性缺陷等機制介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥[11]。此法操作簡單，檢測快速，可重復(fù)性好，檢測費用低，適宜在基層醫(yī)院的普通實驗室開展，而且檢測的敏感性與特異性高，可以實現(xiàn)碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的快速篩查[12]。本研究中，基于PCR 檢測金標(biāo)準(zhǔn)，Carba NP 試驗檢測腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為90.00%和93.33%。有研究顯示[13]，Carba NP 試驗檢測的靈敏度與特異度分別為92.5%和92.7%，同PCR 結(jié)果一致性良好，與本文報道結(jié)論相符。不過，Carba NP 試驗結(jié)果受黏液性菌株影響，也會出現(xiàn)假陰性，影響檢測準(zhǔn)確率[14]。

mCIM 試驗是在碳青霉烯類失活法（carbapenem inactivation method, CIM）實驗基礎(chǔ)上改良的碳青霉烯酶檢測新方法，于2017 年被CLSI 推薦用于腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶的表型確認(rèn)試驗[15]。此法將傳統(tǒng)CIM 試驗中的生理鹽水改為緩釋劑三乙醇胺緩沖鹽水溶液，同時將孵育時間延長至4 h，更利于細(xì)菌生長、酶的產(chǎn)生以及beta-內(nèi)酰胺酶水解，同時可以增強金屬酶檢測敏感性[16]。有研究指出，mCIM 試驗可以在8 h 內(nèi)檢測革蘭陰性桿菌的碳青霉烯酶，對KPC、NDM、IMP、β-內(nèi)酰胺酶等碳青霉烯酶的檢測靈敏度與特異度均很強，與PCR 檢測一致性高[17]。本研究中，基于金標(biāo)準(zhǔn)，mCIM 試驗檢測腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的靈敏度與特異度分別為93.33%和100.00%，與文獻(xiàn)報道m(xù)CIM 試驗檢測靈敏度（95.0%）與特異度（98.0%）相符[18]，檢測效能與Carba NP 試驗基本相當(dāng)。不僅如此，mCIM 試驗結(jié)果不會受細(xì)菌產(chǎn)生黏液的影響。有研究顯示，Carba NP 試驗中黏液性菌株可表現(xiàn)為弱陽性的橙色，即假陰性，而經(jīng)mCIM 試驗均呈陰性，說明mCIM 試驗在篩查黏液性腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶中更具技術(shù)優(yōu)勢。此外，mCIM 試驗也不受菌齡和藥敏紙片的影響，試驗使用常規(guī)藥敏紙片即可，操作簡單、成本低廉，而且結(jié)果直觀明確，適用于基層醫(yī)院微生物實驗室常規(guī)開展。不過，銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等其他耐碳青霉烯細(xì)菌日益增多，mCIM 試驗在這些細(xì)菌表型檢測中的效能與價值如何，尚需更多的試驗驗證，有待今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，Carba NP 試驗與mCIM 試驗均是檢測腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶有效可行的方法，值得臨床應(yīng)用推廣。