王 瑩 黃鄭雋 翁少煌

1 福建省立醫(yī)院,福建省福州市 350000; 2 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

碳量子點(diǎn)(CDs)是利用碳納米管、碳纖維等大尺寸材料或葡萄糖、檸檬酸等小分子物質(zhì)為碳源合成的一種粒徑在10nm之間的新型碳基納米材料[1]。近年來,因碳量子點(diǎn)獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu)性質(zhì),在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了較為廣泛的關(guān)注[2-3]。由于其優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì),如可調(diào)的光致發(fā)光、相對(duì)較高的生物相容性、較低的細(xì)胞毒性以及優(yōu)異的化學(xué)惰性,碳量子點(diǎn)在分析檢測(cè)、活體成像、診療劑應(yīng)用等諸多醫(yī)用領(lǐng)域逐漸展示應(yīng)用價(jià)值[4-5]。同時(shí),碳量子點(diǎn)逐漸廣泛的生物體系應(yīng)用也引起人們對(duì)碳量子點(diǎn)生物安全性的注意。

部分研究發(fā)現(xiàn),具有促細(xì)胞生長(zhǎng)活性的碳量子點(diǎn)可影響環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡[6],而且一些高濃度的特定來源碳量子點(diǎn)具有誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷等生物毒性[7-8]。隨著碳量子點(diǎn)的廣泛應(yīng)用,由于碳量子點(diǎn)的良好水溶性和環(huán)境循環(huán),不可避免地發(fā)生部分碳量子點(diǎn)通過生物富集進(jìn)入生物體內(nèi),從而引發(fā)機(jī)體損傷的風(fēng)險(xiǎn)。因此,不僅需要開展體外細(xì)胞安全性評(píng)價(jià),更需要進(jìn)行體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)的綜合工作。目前已有的關(guān)于碳量子點(diǎn)的安全性評(píng)價(jià)存在暴露途徑較單一、評(píng)價(jià)內(nèi)容不全面、不系統(tǒng)等問題。全面系統(tǒng)地評(píng)估碳量子點(diǎn)的生物體內(nèi)安全性、深入理解材料與生物系統(tǒng)之間的相互作用是決定碳量子點(diǎn)能否實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的前提和基礎(chǔ)。因此,本實(shí)驗(yàn)采取兩種不同的給藥途徑開展碳量子點(diǎn)的體內(nèi)安全性評(píng)估,為N-CDs的廣泛、深入應(yīng)用提供初步的免疫安全性評(píng)價(jià)。希望能夠通過系統(tǒng)地分析碳量子點(diǎn)對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)重要指標(biāo)的影響,認(rèn)識(shí)對(duì)免疫系統(tǒng)的可能毒理影響,對(duì)于進(jìn)一步開展其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物 無水檸檬酸、多乙烯多胺購(gòu)買自阿拉丁試劑有限公司;谷胱甘肽購(gòu)買自Sigma-Aldrich 公司;丙酮購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)的檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司。體重為180～200g的SPF級(jí)健康SD大鼠64只,雌雄各半,由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(閩)2012-0001。

1.2 碳量子點(diǎn)混懸液的制備 氮摻雜碳量子點(diǎn)(N-CDs)的制備方法如下:將含有2.0g檸檬酸(Citric acid,CA)和0.6g谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的混合物置于油浴鍋中,加熱至140℃并保持此溫度直至混合物完全熔化,此時(shí)混合物的熔融液體顏色為棕褐色。然后將10ml多乙烯多胺加入熔融混合物中,同時(shí)升溫至200℃并繼續(xù)反應(yīng)1h。將所制備的混合熔融物冷卻至室溫,加入丙酮溶解產(chǎn)物。6 000r/min離心10min以獲得沉淀物,并將沉淀物溶解在超純水中。最后,用分子量為2 000kDa的透析袋透析純化72h。

以生理鹽水作分散溶劑,將20mg/ml的N-CDs混懸液稀釋成不同濃度,配置低(2.5mg/ml)、中(5.0mg/ml)、高(10.0mg/ml)三個(gè)劑量組,備用。

1.3 大鼠給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按體重隨機(jī)分為8組,即仿口服組(空白對(duì)照組、N-CDs低、中、高劑量組),尾靜脈注射法組(空白對(duì)照組、N-CDs低、中、高劑量組),每組8只。

大鼠喂飼普通飼料,自由攝食和飲水,每周稱重,按體重調(diào)整給藥量。仿口服組中,以灌胃方式給藥,給藥量為10ml/kg,即低劑量組(25mg/kg),中劑量組(50mg/kg)、高劑量組(100mg/kg);尾靜脈注射組中以尾靜脈注射方式給藥,低劑量組(5mg/kg)、中劑量組(10mg/kg)、高劑量組(20mg/kg)?？瞻讓?duì)照組按體重分別給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。每日染毒1次,連續(xù)染毒8周。

1.4 動(dòng)物樣品采集 末次給藥24h后,對(duì)大鼠進(jìn)行頸部采血2ml,將血液用低溫高速離心機(jī)以5 000r/min離心10min,取血清,置于-80℃冰箱中冷凍保存,備用。取脾、胸腺臟器稱重,記錄,并稱取脾臟約0.3g、胸腺約0.2g,放入研磨機(jī)中以60Hz的頻率研磨45～60s,制備勻漿,以4 000g離心力離心5min,取上清,放入-80℃冰箱中,待測(cè)。

1.5 整體免疫相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)大鼠外周血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-1(IL-1),與胸腺、脾組織中的谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)進(jìn)行檢測(cè)。TNF-α、IFN-γ和IL-1用于考察碳量子點(diǎn)對(duì)大鼠外周血細(xì)胞因子的影響;GSH、MDA、SOD的含量變化用于考察碳量子點(diǎn)對(duì)于胸腺和脾臟的氧化損傷作用。

2 結(jié)果

2.1 N-CDs灌胃對(duì)大鼠免疫安全性評(píng)價(jià)

2.1.1 N-CDs灌胃對(duì)大鼠體重的影響。由表1可見,與空白對(duì)照組相比,N-CDs不同劑量染毒組的大鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。與適應(yīng)期比較,染毒2周后大鼠體重與適應(yīng)期大鼠的體重明顯增加(P<0.05);而染毒3周后大鼠體重進(jìn)一步增加,體重與適應(yīng)期大鼠的體重有顯著性差異(P<0.01)。

表1 N-CDs灌胃對(duì)大鼠體重的影響

2.1.2 N-CDs灌胃對(duì)大鼠脾、胸腺臟器系數(shù)的影響。由表2可見,N-CDs低、中、高的灌胃劑量分組大鼠的脾、胸腺兩個(gè)主要免疫器官的臟器系數(shù)較空白對(duì)照組均未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 N-CDs灌胃對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

2.1.3 N-CDs灌胃對(duì)大鼠脾臟氧化損傷的影響。由表3可見,相較于空白對(duì)照組,N-CDs高劑量組使大鼠脾臟的GSH濃度顯著下降(P<0.05)。在中劑量下,大鼠脾臟MDA的濃度明顯降低(P<0.05),且N-CDs高劑量組下降更為顯著(P<0.01)。N-CDs不同劑量染毒組大鼠脾臟的SOD濃度與空白對(duì)照組相比,均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 N-CDs灌胃對(duì)大鼠脾臟氧化損傷的影響

2.1.4 N-CDs灌胃對(duì)大鼠胸腺氧化損傷的影響。由表4可見,相較于空白對(duì)照組,N-CDs各劑量染毒組雖造成GSH、SOD和MDA等指標(biāo)一定程度降低,但N-CDs各劑量染毒組與空白對(duì)照組的氧化損傷指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05),均未對(duì)大鼠胸腺造成氧化損傷。

表4 N-CDs灌胃對(duì)大鼠胸腺氧化損傷的影響

2.1.5 N-CDs灌胃對(duì)大鼠外周血細(xì)胞因子的影響。由表5可見,在本研究所設(shè)的染毒周期和劑量條件下,N-CDs對(duì)大鼠的外周血清細(xì)胞因子IL-1、IFN-γ、TNF-α濃度均未造成顯著性改變(P>0.05)。

表5 N-CDs灌胃對(duì)大鼠外周血清細(xì)胞因子的影響

2.2 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠免疫安全性評(píng)價(jià)

2.2.1 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠體重的影響。由表6可見,各染毒組的大鼠體重與空白對(duì)照組比較仍未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05),不同分組之間的體重未見顯著性差異且大鼠體重在染毒期間逐漸增長(zhǎng)。

表6 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠體重的影響

2.2.2 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠胸腺、脾臟器系數(shù)的影響。由表7可見,相較于空白對(duì)照組,N-CDs低、中、高劑量組大鼠胸腺的臟器系數(shù)均明顯下降(P<0.01),而大鼠脾臟的臟器系數(shù)明顯增大(P<0.01和P<0.05)。

表7 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠脾、胸腺臟器系數(shù)的影響

2.2.3 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠胸腺氧化損傷的影響。由表8可見,與空白對(duì)照組相比,各劑量組胸腺的GSH和MDA含量均未出現(xiàn)明顯改變;然而,胸腺SOD活力隨N-CDs尾靜脈注劑量的增大而顯示出梯度降低,且與空白對(duì)照組均具有顯著性差異。

表8 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠胸腺氧化損傷的影響

2.2.4 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠脾臟氧化損傷的影響。由表9可見,各劑量組脾臟GSH和SOD含量相較于空白對(duì)照組均無顯著性差異;而脾臟中、高劑量組的MDA含量相比于空白對(duì)照組呈顯著性降低(P<0.01和P<0.05)。

表9 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠脾臟氧化損傷的影響

2.2.5 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠外周血細(xì)胞因子的影響。由表10可見,各劑量組的TNF-α、IFN-γ和IL-1含量較空白對(duì)照組的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表10 N-CDs尾靜脈注射對(duì)大鼠外周血細(xì)胞因子的影響

3 討論

N-CDs同其他納米材料一樣,具有獨(dú)特的量子尺寸效應(yīng)及理化性質(zhì),且極易進(jìn)入機(jī)體內(nèi),引起一系列生物反應(yīng)。截至目前,國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有研究主要關(guān)注于其細(xì)胞毒性方面,對(duì)免疫毒性的研究和闡述較少,且研究結(jié)果存在較大爭(zhēng)議:部分研究表明碳納米材料沒有明顯的毒性作用,而另外的一些研究表明碳納米材料具有明顯的細(xì)胞毒性。由于N-CDs的毒性還受環(huán)境、人為處理、暴露途徑等因素的影響,如果僅采取單個(gè)給藥途徑的實(shí)驗(yàn)結(jié)論來評(píng)價(jià)N-CDs免疫毒性的話會(huì)存在評(píng)價(jià)不全面、不系統(tǒng)的問題。因此,本次實(shí)驗(yàn)通過灌胃、尾靜脈注射的方式進(jìn)一步、系統(tǒng)地考察N-CDs的免疫安全性。

在本次實(shí)驗(yàn)中,分別用灌胃和尾靜脈注射方式對(duì)大鼠進(jìn)行N-CDs染毒后,各染毒組的大鼠體重相對(duì)空白組無明顯差異,且在染毒2周后體重仍明顯增長(zhǎng),說明在本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置劑量下大鼠體重未顯示出N-CDs的毒性作用。

大量研究表明,通過觀察胸腺是否萎縮可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的狀態(tài),脾淋巴濾泡的萎縮或脾臟重量的減輕則說明機(jī)體的體液免疫功能降低。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),利用灌胃方式染毒N-CDs的大鼠各個(gè)劑量組脾、胸腺的臟器系數(shù)幾乎與空白對(duì)照組一致,說明N-CDs仿口服對(duì)大鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能無明顯作用。采用尾靜脈注射方式染毒的大鼠各個(gè)劑量組脾臟和胸腺的臟器系數(shù)較空白對(duì)照組均發(fā)生了明顯改變,胸腺系數(shù)下降,脾臟系數(shù)增大。說明胸腺開始出現(xiàn)了明顯的萎縮或退行性改變,而脾臟的增生肥大可能是機(jī)體的免疫系統(tǒng)所作出相應(yīng)的代償性改變。

免疫細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA、GSH和SOD,參與機(jī)體的新陳代謝和免疫系統(tǒng)的調(diào)控過程,如遇到針對(duì)免疫系統(tǒng)的毒性攻擊,MDA、GSH和SOD會(huì)顯示出相應(yīng)的異常改變。通過檢測(cè)MDA含量可反映染毒大鼠的脾、胸腺臟器的脂質(zhì)過氧化程度,GSH和SOD二者的含量則可作為細(xì)胞抗氧化水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),灌胃方式給藥的大鼠脾臟的組織勻漿中,N-CDs高劑量組的GSH濃度顯著降低,表示在N-CDs給藥濃度為10.0mg/ml時(shí),大鼠細(xì)胞發(fā)生氧化反應(yīng),處于應(yīng)激狀態(tài),對(duì)自由基的清除能力下降,然而染毒組的SOD濃度與空白對(duì)照組相比無明顯差異,N-CDs中、高劑量組的MDA濃度顯著下降,又說明機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度減小。在灌胃方式給藥的大鼠胸腺的組織勻漿中,N-CDs染毒組均無明顯差異,說明N-CDs未對(duì)大鼠的胸腺造成明顯的氧化性或者其他損傷。

在對(duì)大鼠行尾靜脈注射N-CDs后,胸腺的SOD值和脾臟的MDA值均出現(xiàn)了明顯下調(diào),表明胸腺所發(fā)生的萎縮或退行性改變使得機(jī)體清除自由基的能力明顯下降,說明靜脈注射N-CDs可以引起局部免疫器官發(fā)生變化。但是由于機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有整體性,脾臟的代償性增大又使得機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度減小,這說明自由基攻擊機(jī)體細(xì)胞的程度可能在免疫系統(tǒng)的自我平衡中得到緩解。

通過檢測(cè)外周血清中的細(xì)胞因子含量可反映機(jī)體整體的免疫功能。在此次研究所設(shè)劑量下,以灌胃和尾靜脈注射方式染毒N-CDs,對(duì)大鼠外周血清中的細(xì)胞因子IL-1、TNF-α及IFN-γ濃度沒有造成顯著的變化,說明口服和靜脈注射N-CDs均未產(chǎn)生炎癥反應(yīng),N-CDs對(duì)大鼠整體免疫功能的調(diào)節(jié)作用均無明顯影響。

綜上所述,N-CDs通過灌胃方式給藥進(jìn)入大鼠機(jī)體后,在整體水平上無明顯免疫毒性作用,無炎性作用,具有較高的免疫安全性。但灌胃給藥在濃度較高時(shí),可導(dǎo)致機(jī)體的氧化和抗氧化作用調(diào)節(jié)紊亂,對(duì)免疫系統(tǒng)特別是脾臟造成一定的氧化損傷。尾靜脈注射N-CDs對(duì)大鼠免疫系統(tǒng)的整體水平上沒有明顯影響,雖然個(gè)別指標(biāo)出現(xiàn)異常,但免疫系統(tǒng)似乎又表現(xiàn)出自身的免疫調(diào)節(jié)能力加以維護(hù)機(jī)體的整體免疫平衡,也證實(shí)了N-CDs的免疫安全性。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明不同給藥途徑N-CDs可引起機(jī)體不同的局部免疫器官的變化。