喬浩東，劉一璠，梁 澤，郭懷斌

河北省人民醫(yī)院肝膽外科（石家莊 050051）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，亞洲尤其嚴(yán)重，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，2020年亞洲HCC新增人數(shù)占全球72.5%，相關(guān)死亡人數(shù)占全球73.3%[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)手術(shù)和介入相結(jié)合的療法對部分HCC患者產(chǎn)生了不錯的療效[2-5]。但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)HCC時已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，無法進(jìn)行手術(shù)[6]。近年來，免疫療法尤其是抗程序性死亡因子1及其受體（programmed cell death-1 and its ligand，PD-1/PD-L1）通路治療對部分晚期HCC的預(yù)后有所改善[7-9]，但該療法的預(yù)后缺乏可靠的預(yù)測指標(biāo)[9]。如何篩選出適合PD-1/PD-L1的優(yōu)勢人群，從而節(jié)約醫(yī)療資源，降低患者醫(yī)療費(fèi)用，已成為目前免疫治療的熱點(diǎn)。最新研究表明，三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）對HCC免疫治療的預(yù)后有一定的指導(dǎo)作用。本文闡述了TLS和PD-1/PD-L1信號通路在HCC治療中的最新進(jìn)展及TLS對抗PD-1/PD-L1預(yù)后的預(yù)測價值。

1 TLS與HCC及其免疫治療

1.1 TLS的基本結(jié)構(gòu)

TLS是在非造血器官中形成的淋巴聚集物，該結(jié)構(gòu)最初在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)，之后在多種腫瘤組織中被證實(shí)[10-11]?；窘Y(jié)構(gòu)由生發(fā)中心、B細(xì)胞區(qū)和T細(xì)胞區(qū)構(gòu)成，其中生發(fā)中心由成熟B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）構(gòu)成，B細(xì)胞區(qū)由B淋巴細(xì)胞構(gòu)成，T細(xì)胞區(qū)由T淋巴細(xì)胞構(gòu)成。成熟TLS的生發(fā)中心較大，T細(xì)胞區(qū)較小[12]。

1.2 TLS的形成機(jī)制

C-X-C趨化因子配體13 （C-X-C chemokine ligand 13，CXCL13）及其受體C-X-C趨化因子受體5（C-X-C chemokine receptor 5，CXCR5）與肺癌、結(jié)直腸癌、皮膚黑色素瘤及口腔癌等多種腫瘤的TLS形成有關(guān)[13-15]（具體機(jī)制詳見圖1）。此外，凋亡外泌體樣囊泡可通過促進(jìn)淋巴毒素和炎癥因子的釋放從而促進(jìn)TLS形成[16]（具體機(jī)制詳見圖2）；有研究發(fā)現(xiàn)CXCL13會促進(jìn)淋巴毒素分泌[16-17]，這可能是其產(chǎn)生和發(fā)展TLS的途徑；Suematsu等人發(fā)現(xiàn)趨化因子與DC可促進(jìn)TLS中淋巴細(xì)胞簇的形成，且趨化因子起主導(dǎo)作用，DC起增強(qiáng)作用[18]；Finkin等人發(fā)現(xiàn)與同月齡Alb-cre小鼠相比，IKK-β（EE）Hep小鼠（該小鼠能持續(xù)表達(dá)IKKB及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性）肝臟中TLS較多[19]，說明IKK-NF-κB信號通路是肝臟TLS產(chǎn)生的重要途徑。

圖1 CXCL13促進(jìn)TLS的形成Figure 1.CXCL13 promotes the initiation of tertiary lymphoid structure development

圖2 細(xì)胞凋亡促進(jìn)TLS形成Figure 2.Apoptosis promotes the initiation of tertiary lymphoid structure development

1.3 TLS的測量和分級方法

目前臨床上采用HE染色或HE染色聯(lián)合免疫組化判定HCC組織中TLS的存在。HE染色切片中TLS的特征是成熟DC位于T細(xì)胞區(qū)并鄰近生發(fā)中心[20]。TLS常見免疫組化標(biāo)志物為CD21、CD20 、CD3、CD8 和CD208[21-22]。

在HCC的TLS分級方面，目前缺乏統(tǒng)一的分級標(biāo)準(zhǔn)。近年來比較有影響力的分級方法是Julien Calderaro等人的方法：①淋巴細(xì)胞聚集體型TLS：模糊、定義不清的淋巴細(xì)胞簇；②初級淋巴濾泡型TLS：無生發(fā)中心形成的圓形淋巴細(xì)胞簇；③次級淋巴濾泡型TLS：含有生發(fā)中心的濾泡[19,23-24]。此外，Nie等人根據(jù)成熟度將TLS分為聚集體（腫瘤樣本僅顯示聚集體而無淋巴濾泡）和淋巴濾泡型TLS（腫瘤樣本顯示至少一個淋巴濾泡或生發(fā)中心，有無聚集體均可）[22]。而在非小細(xì)胞肺癌的TLS相關(guān)研究中，Devi-Marulkar等人提出可以根據(jù)TLS內(nèi)部免疫細(xì)胞比例的不同，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）/B細(xì)胞和γδT細(xì)胞等對TLS進(jìn)一步劃分，優(yōu)化分級方法[25]。

1.4 誘導(dǎo)TLS形成的方法

目前大多數(shù)研究表明，TLS對HCC的預(yù)后起到積極作用，可考慮人工誘導(dǎo)TLS的形成以改善HCC預(yù)后。Suematsu等人研究將表達(dá)LTα或趨化因子的細(xì)胞系和DC嵌入到海綿狀膠原支架并移植到小鼠的腎包膜下進(jìn)行培養(yǎng)，成功構(gòu)建出了人工TLS，并且證實(shí)了其結(jié)構(gòu)和功能與一般TLS存在相似性[18,26]。此外，Aoyama等人根據(jù)TLS的形成條件，總結(jié)了目前可能作為人工TLS支架的構(gòu)建材料，如膠原基質(zhì)、水凝膠、介孔二氧化硅棒和聚酰胺纖維[27]。

1.5 TLS對HCC免疫的影響

腫瘤相關(guān)TLS有助于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而改善腫瘤預(yù)后[28]。作為淋巴細(xì)胞產(chǎn)生局部免疫的“前沿堡壘”和“傳導(dǎo)體”，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗腫瘤免疫作用需通過TLS啟動和維持，包括T細(xì)胞免疫、B細(xì)胞體液免疫、DC抗原呈遞或其他結(jié)構(gòu)的作用。Lin等人發(fā)現(xiàn)TLS通過產(chǎn)生中樞記憶T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，在抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。Sautès-Fridman等人通過泛癌分析制作了T-分布隨機(jī)鄰域嵌入圖，發(fā)現(xiàn)HCC組織中，腫瘤內(nèi)TLS成熟度的增加則提示機(jī)體產(chǎn)生了長期的抗腫瘤免疫[30]。Wen等人通過單因素比例風(fēng)險回歸分析發(fā)現(xiàn)TLS內(nèi)中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值與HCC總生存率呈正相關(guān)[21]。El-Rebey等人的研究表明HCC腫瘤TLS內(nèi)的CD8+T、CD4+T和NK等免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用[31]。Li等人通過對HCC患者的腫瘤組織進(jìn)行免疫熒光和免疫組化染色，也發(fā)現(xiàn)TLS內(nèi)CD20+B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與HCC患者總生存期呈明顯正相關(guān)關(guān)系，CD3+T細(xì)胞和LAMP3+DCs的數(shù)量與患者無進(jìn)展生存期顯著正相關(guān)[32]。

然而，在HCC中，局部免疫不僅產(chǎn)生抗腫瘤作用，也具有加速腫瘤惡性程度進(jìn)展的作用。這是因為在長期抗HBV的免疫過程中，免疫抑制介質(zhì)例如肝臟駐留的Kupffer細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-10，作用于HBV特異性CD8+T細(xì)胞，使其數(shù)量減少或活性喪失，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)無法根除HBV感染[33-34]。但其他免疫細(xì)胞如CD4+T細(xì)胞仍然繼續(xù)分泌細(xì)胞因子和生長因子，刺激肝臟持續(xù)產(chǎn)生炎癥，導(dǎo)致肝損傷和肝細(xì)胞再生的重復(fù)循環(huán)，進(jìn)而加速腫瘤進(jìn)展。Finkin等人通過分析82例進(jìn)行過肝切除的HCC患者的臨床資料、組織學(xué)切片和肝TLS相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)TLS與HCC預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[19]。研究認(rèn)為IKK-β（EE）Hep小鼠肝組織中TLS表達(dá)增多，HCC發(fā)生率升高，而注射抗原Thy-1.2抗體（該種抗體通過消融T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞減少了TLS的產(chǎn)生和發(fā)展）的小鼠HCC產(chǎn)生幾率較低[19]。此外，TLS周圍的肝細(xì)胞最先惡化為腫瘤細(xì)胞并表達(dá)多種HCC祖細(xì)胞標(biāo)志物。組織學(xué)檢測證實(shí)這是因為TLS中的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞通過分泌LTα等細(xì)胞因子，促使其周圍的肝細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化并獲得自分泌相同細(xì)胞因子的能力。Zhao等人的研究發(fā)現(xiàn)TLS中Tregs產(chǎn)生促腫瘤作用，并會加速HCC的惡化[35]。

2 PD-1/PD-L1通路與HCC及其免疫治療

2.1 PD-1/PD-L1通路與腫瘤免疫

PD-1是一種在免疫細(xì)胞表面表達(dá)的抑制性跨膜蛋白，PD-L1在多種組織類型的表面，而PD-L2大部分在造血細(xì)胞表面[36]。該信號可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，在免疫穩(wěn)態(tài)、消炎、耐受等方面具有重要作用。PD-1在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中有兩個酪氨酸基序，當(dāng)與配體接合時，酪氨酸殘基處被磷酸化，募集多種蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPs），如蛋白酪氨酸磷酸酶Src和同源蛋白2等。這些PTPs通過去磷酸化作用拮抗T細(xì)胞抗原受體（TCR）和CD28產(chǎn)生的陽性信號，從而影響T淋巴細(xì)胞的下游信號通路分子，例如磷酸肌醇3激酶（PI3K）-Akt、Ras、胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、VAV和磷脂酶Cγ（PLCγ）、p27、p15[37-39]。

正常細(xì)胞表面表達(dá)PD-L1，通過結(jié)合PD-1而抑制淋巴細(xì)胞功能。當(dāng)組織損傷時，細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)量減少，出現(xiàn)免疫反應(yīng)[40]。較大程度的免疫反應(yīng)會產(chǎn)生炎癥，促進(jìn)PD-L1表達(dá)量增加，減少免疫系統(tǒng)對正常組織的損傷，形成負(fù)反饋循環(huán)，既保證了免疫系統(tǒng)能發(fā)揮作用，又減少了對正常組織的損傷。腫瘤細(xì)胞高度表達(dá)PDL1，通過PD-1/PD-L1通路減少淋巴細(xì)胞的殺傷作用和長期免疫作用，產(chǎn)生免疫逃逸[41]。阻斷PD-1/PD-L1通路可以增強(qiáng)腫瘤免疫治療效果[42]（圖3）。

圖3 腫瘤細(xì)胞通過PD-1/PD-L1通路抑制免疫細(xì)胞的殺傷作用Figure 3.Tumor cells inhibit the killing effect of immune cells through PD-1/PD-L1 pathway

2.2 PD-1/PD-L1免疫治療的不足

目前分子靶向治療和免疫治療是晚期HCC唯一的治療方案。免疫治療，尤其是抗PD-L1聯(lián)合抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）療法顯示出更高的緩解率（約30%），并顯著延長HCC患者生存期[43]，例如卡瑞利珠單抗、納武單抗或帕博利珠單抗聯(lián)合索拉非尼療法[44-47]。盡管如此，大多數(shù)晚期HCC患者對靶向治療反應(yīng)仍不佳[48-49]。實(shí)際臨床治療中，抗PD-1/PD-L1藥物應(yīng)答率普遍較低，如納武單抗的應(yīng)答率僅20%[45]。且有研究表明，抗PD-1/PD-L1治療甚至?xí)黾臃蔷凭灾靖嗡翲CC的惡性程度[50-51]。因此，在進(jìn)行PD-1/PD-L1免疫治療前需檢測生物標(biāo)志物預(yù)測治療效果，以降低治療成本并避免治療相關(guān)不良事件。目前對抗PD-1/PD-L1免疫治療HCC預(yù)后的評估指標(biāo)——免疫組化、腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的準(zhǔn)確性均不足[9,45,47]。由于肝癌組織本身很少發(fā)生基因突變，因此后兩項并不作為主要評判指標(biāo)，尤其是腫瘤突變負(fù)荷，不僅尚未得到驗證，甚至在HCC免疫治療中的作用也未完全闡明[52-53]。雖然在多種腫瘤中，PD-L1表達(dá)程度的增加與PD-1阻斷治療反應(yīng)率的增加和腫瘤預(yù)后的改善有關(guān)[54-56]，但在HCC免疫治療中PD-L1的表達(dá)卻不能準(zhǔn)確預(yù)測療效，例如在KEYNOTE-224以及CheckMate 040試驗中，PD-L1就不具有預(yù)測價值[45,47]。Yan等人在探索HCC免疫治療生物標(biāo)志物的研究中同樣觀察到PD-L1的表達(dá)程度不足以對HCC中抗PD-1/PD-L1免疫治療效果進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測[57]。因此，迫切需要開發(fā)更有效的生物標(biāo)志物，以準(zhǔn)確預(yù)測抗PD-1/PD-L1免疫治療對晚期HCC患者的療效。

3 TLS與HCC抗PD-1免疫治療

TLS作為腫瘤免疫環(huán)境的首要特征[58]，反映抗腫瘤免疫應(yīng)答的程度[20,59]，對抗PD-1/PD-L1免疫治療效果有一定的預(yù)測價值[12,59]。2020年以來均有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中，成熟TLS與免疫治療的更好反應(yīng)性有關(guān)[60-61]。Helmink發(fā)現(xiàn)TLS中的B細(xì)胞可通過與其他免疫成分相互作用并分泌細(xì)胞因子（包括TNF、IL-2、IL-6和IFNγ）激活和招募其他免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞，以增強(qiáng)腫瘤對免疫治療的反應(yīng)[62]。Clubb等人也發(fā)現(xiàn)TLS形成與頭頸癌抗PD-1/PD-L1免疫治療有協(xié)同作用，這與TLS維持免疫反應(yīng)微環(huán)境中的作用有關(guān)，并據(jù)此提出可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生TLS或增加其成熟度以增強(qiáng)免疫治療作用的觀點(diǎn)[63]。此外，Li等在HCC與TLS相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶作為通過調(diào)控細(xì)胞因子信號通路、趨化因子信號通路和T細(xì)胞活化參與TLS形成和成熟的分子，其表達(dá)水平與HCC患者對HCC免疫治療的敏感性呈正相關(guān)[32]。Zhong等以高密度TLS作為判斷條件，對伴有門靜脈瘤栓的HCC實(shí)行抗PD-1治療聯(lián)合索拉非尼，發(fā)現(xiàn)預(yù)測效果良好，表明TLS有作為預(yù)測免疫治療反應(yīng)指標(biāo)的價值[64]。因此，在研究抗PD-1/PD-L1免疫治療效果時，可考慮將TLS視為一個生物標(biāo)志物。

4 結(jié)語

未來HCC免疫治療的研究方向可能為：①從TLS入手，提出預(yù)測HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)；②將導(dǎo)致HCC、亞臨床HCC和有惡化為HCC風(fēng)險的肝臟疾病的病因作為一個考慮因素，評判HCC患者聯(lián)合治療時是否應(yīng)當(dāng)加入抑制PD-1通路的免疫治療以及將其作為主要治療方式或輔助治療，可通過以上兩點(diǎn)，更新HCC患者免疫治療的評判量表，依據(jù)病情提出提升患者生存時間和生存質(zhì)量的方案；③目前預(yù)測抗PD-1/PD-L1療效的指標(biāo)單一，將TLS及其密度、與腫瘤位置的遠(yuǎn)近、組成成分和成熟程度作為抗PD-1/PD-L1療效的評判指標(biāo)可提高預(yù)測準(zhǔn)確度；④HCC中TLS存在及成熟度與抗PD-1/PD-L1療效呈負(fù)相關(guān)，因此，誘導(dǎo)TLS形成或成熟可能成為提高HCC抗 PD-1/PD-L1療效的方法之一。