楊淑銀，岳二麗，郭留云，陸 珂，楊夢宇

鄭州大學第一附屬醫(yī)院牙周科（鄭州 450000）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，易發(fā)生頭部或頸部淋巴結轉移，嚴重影響患者預后和生存[1-2]。因此探討OSCC發(fā)生發(fā)展的分子機制對尋找OSCC治療靶點以及改善OSCC患者預后具有重要意義。微小RNA（miRNA，miR）是一類內源性單鏈非編碼小分子RNA，可通過調節(jié)其下游靶基因的表達參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學過程，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預后密切相關[3-4]。近年研究顯示，miR-222-3p在宮頸癌[5]、非小細胞肺癌[6]及甲狀腺癌[7]等多種惡性腫瘤組織中異常表達，并與患者預后密切相關。已有證據(jù)顯示，miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表達，且與TNM分期和淋巴結轉移及生存期密切相關。但miR-222-3p在OSCC中的作用機制尚未明確，本研究通過分析miR-222-3p對人OSCC CAL-27細胞增殖、凋亡及侵襲的影響，初步探討其對OSCC生物學行為的影響，為OSCC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人OSCC CAL-27細胞株及人正常口腔角質細胞株（hNOK）均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Trizol試劑、脂質體lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（M-0283）購自美國Sigma公司；BAX（ab32503）、Bcl-2（ab32124）、MMP-2（ab92536）、N-cadherin（ab76011）、E-cadherin（ab40772）及β-actin（ab8226）抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

CAL-27和hNOK細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。實驗分為對照組（NC組）、inhibitor NC組和miR-222-3p inhibitor組。將對數(shù)生長期的CAL-27細胞接種到96孔板（1×104/孔）中，待細胞融合度達到70%左右按照liporfectamine 2000轉染試劑說明書分別將miR-222-3p inhibitor和陰性對照質粒（inhibitor NC）轉染至細胞，轉染48 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

采用RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，并逆轉錄合成cDNA，然后使用qRT-PCR儀（美國ABI）進行qRT-PCR檢測。引物序列：miR-222-3p上游5'-AGCTACATCT GGCTACTGGGT-3'，下游5'-GCGAGCACAGAA TTAATACGA C-3'；U6上游5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應條件：95 ℃預變性15 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算細胞中miR-222-3p的相對表達水平。

1.4 MTT法檢測細胞增殖能力

將CAL-27細胞接種至96孔板中，分別培養(yǎng)24，48，72和96 h后，每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清加入150 μL DMSO振蕩充分溶解，于酶標儀上檢測波長在570 nm處測吸光值（OD），檢測各組細胞的增殖情況。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

利用Annexin-V和碘化丙碇（PI）凋亡檢測試劑盒（美國Sigma-Aldrich）檢測細胞凋亡。將轉染48 h的CAL-27細胞消化后，重懸于結合緩沖液中，混勻后加入5 μL Annexin V（FITC），避光染色10 min后加入50 mg/L PI染色室溫避光反應5 min，采用流式細胞儀（美國Becton Dickinson）檢測細胞凋亡情況。

1.6 Transwell檢測細胞侵襲

將轉染后的細胞懸浮液100 μL加入小室的上室中，將600 μL含有10% FBS的PRMI-1640培養(yǎng)基或100 μL稀釋后的Matrigel基質膠均勻加到下室中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室細胞，4%多聚甲醛固定遷移到下室的細胞，0.1%結晶紫染色，洗凈晾干后，倒置于顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)。實驗重復3次。

1.7 蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平

采用細胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度后進行SDS-PAGE電泳，轉膜后用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入BAX、Bcl-2、MMP-2、N-cadherin、E-cadherin及β-actin（1 : 1 000）一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔或鼠的二抗IgG（1 ∶ 2 000）。室溫孵育2 h后，暗室中用ECL發(fā)光，并采用軟件Image J進行圖像分析。以β-actin為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。本研究各項實驗均重復3次，計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-222-3p在CAL-27細胞中的表達

CAL-27細胞中miR-222-3p的表達水平顯著高于hNOK細胞（4.63±0.35vs.1.01±0.21，P＜0.001）。

2.2 各組細胞miR-222-3p的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，miR-222-3p inhibitor組miR-222-3p的相對表達量顯著低于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05）；inhibitor NC組和NC組間miR-222-3p的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組細胞miR-222-3p的表達（n=3）Figure 1.Expression of miR-222-3p in each group(n=3)

2.3 miR-222-3p對CAL-27細胞增殖能力的影響

MTT實驗結果顯示，miR-222-3p inhibitor組CAL-27細胞在48，72，96 h處的增殖能力顯著低于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05），而inhibitor NC組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 miR-222-3p對CAL-27細胞增殖能力的影響（n=3）Figure 2.Effects of miR-222-3p on proliferation of CAL-27 cells (n=3)

2.4 miR-222-3p對CAL-27細胞凋亡的影響

Annexin-V/PI雙染結果顯示，miR-222-3p inhibitor組的細胞凋亡率顯著高于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05），而inhibitor NC組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3-A。進一步對凋亡下游標志蛋白進行檢測，結果顯示，與inhibitor NC組和NC組相比，miR-222-3p inhibitor組BAX蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；inhibitor NC組和NC組細胞中BAX和Bcl-2的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3-B。

圖3 miR-222-3p對CAL-27細胞凋亡的影響（n=3）Figure 3.Effect of miR-222-3p on apoptosis of CAL-27 cells (n=3)

2.5 miR-222-3p對CAL-27細胞侵襲的影響

Transwell檢測結果顯示，miR-222-3p inhibitor組細胞侵襲數(shù)量均顯著低于inhibitor NC組和NC組（P＜0.05），見圖4-A。蛋白質印跡法分析顯示，與inhibitor NC組和NC組相比，miR-222-3p inhibitor組MMP-2和N-cadherin蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），E-cadherin表達水平顯著升高（P＜0.05），inhibitor NC組和NC組細胞中MMP-2、N-cadherin和E-cadherin的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4-B。

3 討論

OSCC是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，易發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移，嚴重威脅人類的健康[8]，因此尋找新的分子靶點對OSCC的診斷、治療及預后評估具有臨床意義。miRNA現(xiàn)已成為生物醫(yī)學領域的研究熱點，其通過調控下游目標基因的表達，在細胞增殖、分化及免疫調節(jié)等多種生理病理學過程中發(fā)揮著重要作用[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在腫瘤中異常表達，可作為腫瘤早期診斷、預后評估及靶向治療的靶點[10]。因此分析OSCC相關miRNA的作用及機制，有利于探尋新的治療靶點。

miR-222-3p是一類重要的miRNA，在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[11-12]。miR-222-3p在甲狀腺癌中高表達，其可通過靶向SLC4A4促進甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，有望成為甲狀腺癌患者的分子治療靶點[13]。miR-222-3p在宮頸癌患者血清和宮頸癌細胞系SiHa中表達上調，其通過抑制SOCS5增強宮頸癌細胞SiHa增殖、遷移和侵襲能力，可能參與宮頸癌的發(fā)病[14]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)miR-222-3p在肝細胞癌組織和細胞系中顯著上調，乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）感染后miR-222-3p進一步升高；miR-222-3p通過下調THBS1調控HBV (-) HepG2細胞、HBV (+) HepG2.2.15細胞、Huh7-V細胞、Huh7-HBV細胞的增殖和凋亡，說明miR-222-3p可能是肝細胞癌和HBV相關肝細胞癌潛在的診斷和治療靶點[15]。此外，許云等研究發(fā)現(xiàn)OSCC組織中miRNA-222表達升高，且與腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移有關，可作為診斷和病情判斷的生物學指標[16]。miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表達，且與pTNM分期和淋巴結轉移及生存期密切相關[17]。然而，miR-222-3p在OSCC中的作用尚未明確。

為探討miR-222-3p在OSCC中的作用，本研究檢測了miR-222-3p在CAL-27細胞中的表達，結果發(fā)現(xiàn)miR-222-3p在CAL-27細胞株中高表達。為進一步探討miR-222-3p在OSCC進展中的功能，通過CAL-27細胞中轉染miR-222-3p inhibitor，結果發(fā)現(xiàn)，轉染miR-222-3p inhibitor后，CAL-27細胞的凋亡率顯著升高，增殖、侵襲能力顯著降低。此外，通過分析凋亡及侵襲相關蛋白表達發(fā)現(xiàn)，下調miR-222-3p表達后，BAX、E-cadherin蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2、MMP-2和N-cadherin蛋白表達水平明顯降低，說明下調miR-222-3p表達能夠抑制CAL-27細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡，與SCC-15和Tca-83細胞中的研究結果一致[18]，說明在不同OSCC細胞系中，miR-222-3p的作用基本一致。但miR-222-3p是如何調控OSCC細胞的增殖、侵襲和凋亡及其在不同OSCC細胞系中的作用機制還需更深入的探討。

綜上所述，miR-222-3p在CAL-27細胞中高表達，下調miR-222-3p表達能抑制CAL-27細胞的增殖和侵襲能力，并促進細胞凋亡，可作為OSCC的生物治療的潛在靶標之一。