邵宇云，王 涵，王 瀟，戴晶晶，李 軍，蔣龍鳳

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染病科，江蘇 南京 210029

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是臨床上最常見的肝臟疾病，由某種特定的藥物或/和其代謝產(chǎn)物直接或間接作用于肝臟導致，其臨床表現(xiàn)多樣［1］。一項來自308個醫(yī)學中心25 927例患者的回顧性研究顯示，DILI 發(fā)生率為0.023 8%［2］。對乙酰氨基酚（acetyl-para-aminophenol，APAP）是臨床上最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，過量的APAP 攝入是導致嚴重肝損傷最常見的病因［3］。然而APAP 導致DILI的發(fā)病機制還有待進一步研究。

在APAP誘導的肝損傷（APAPinducedliver injury，AILI）中，肝臟固有免疫反應激活和肝細胞死亡是其發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。既往研究顯示，轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）是核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB（p-65）信號通路激活過程中的關鍵激酶，在機體固有免疫和適應性免疫中發(fā)揮重要作用，如在巨噬細胞中，TAK1可調(diào)控gasdermin D（GSDMD）的水解，從而調(diào)控細胞死亡［4］。而在巨噬細胞中，caspase-8（Casp-8）已被證明是NLRP3 炎癥小體形成、耶爾森菌誘導的促炎細胞因子表達及焦亡過程中必需的［5］。進一步研究顯示，抑制Casp-8 的表達或敲除Casp-8 后，受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）-RIPK3-混合譜系激酶域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）途徑被激活，誘導腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）釋放，加劇細胞損傷，甚至死亡［6-8］；說明Casp-8 可能是控制細胞死亡并防止組織損傷的關鍵。在AILI中，肝巨噬細胞（如Kupffer細胞）通過釋放大量的促炎因子介導炎癥反應，從而加重肝細胞死亡，參與肝損傷的進展［1］。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細胞Notch1 信號可以加重AILI［9］；但Notch1信號調(diào)控APAP誘導肝細胞死亡的機制仍不清楚，有待進一步研究。

本研究構(gòu)建腹腔注射APAP誘導小鼠肝損傷模型，探索髓系特異性Notch1 敲除（myeloid-specific Notch1 knockout，Notch1M-KO）誘導肝細胞死亡的機制。研究發(fā)現(xiàn)，髓系特異性Notch1 敲除通過上調(diào)TAK1 的表達，從而抑制Casp-8，調(diào)控RIPK1-MLKL壞死性凋亡信號，加重肝組織損傷。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級雄性C57BL/6J背景的髓系特異性Notch1敲除（Notch1M-KO）和對照floxed Notch1（Notch1FL/FL）小鼠，6～8 周齡，來自美國Jackson 實驗室。ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司），APAP（Sigma-Aldrich 公司，美國）。Notch1 抗體、TAK1 抗體、p65抗體、p-p65抗體、Casp-8抗體、RIPK1抗體、p-MLKL抗體（CST 公司，美國），p-TAK1 抗體（賽默飛公司，美國），熒光標記二抗（Jackson Immunoresearch，美國），CD11b 抗體（Abcam 公司，美國），H2DCFDA 活性氧熒光探針（ThermoFisher 公司，美國）。熒光顯微鏡（Keyence 公司，日本），全自動生化分析儀（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細胞和肝巨噬細胞分離

小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學實驗動物中心，溫度（25±1）°C，濕度（55±5）%，光照時間維持12 h 光照和12 h 黑暗周期，并給予充足的食物和無菌蒸餾水供其自由采食，所有實驗動物符合南京醫(yī)科大學實驗動物福利倫理（批準編號：IACUC-2206039）。

采用“兩步灌注法”分離Notch1M-KO和Notch1FL/FL小鼠的原代肝細胞及肝臟巨噬細胞［10］。每組取3 只小鼠，打開小鼠腹腔，暴露門靜脈，門靜脈穿刺成功后固定，10 mL/min 流量經(jīng)過門靜脈灌注含1%雙抗的EGTA 溶液（9.5 mg EGTA 粉末加至50 mL HBSS中，37 益預熱30 min），總量為40 mL，再用含1%雙抗的Ⅱ型膠原酶（0.01 g 膠原酶加至40 mL GBSS 溶液中，37 益預熱30 min）灌注肝臟，灌注完成后可見肝臟呈土黃色。灌注完畢后用組織剪將肝臟從腹腔分離后置入含有膠原酶維持液的培養(yǎng)皿中，用鑷子鈍性分離肝臟直至無明顯塊狀組織，制成細胞懸液。70目過濾網(wǎng)過濾后離心，GBSS重懸離心（50g，5 min）清洗2 次，Percoll 密度梯度離心純化，分別獲得原代肝細胞和肝巨噬細胞，0.4%臺酚藍測定細胞狀態(tài)并計數(shù)，DMEM+10%胎牛血清（FBS）+1%青鏈霉素培養(yǎng)，接種至6 孔板中，細胞數(shù)為1.0×106～1.5×106個/孔，培養(yǎng)箱（37 益、5%CO2）中培養(yǎng)3 h后，37 益預熱的PBS 清洗細胞3 次，去除非貼壁細胞。24 h換液，并收集上清液，-80 益儲存。按照每1×106個細胞加入100 μL RIPA，混勻后冰浴靜置30 min 充分裂解細胞。BCA定量蛋白，用于Western blot檢測。

1.2.2 小鼠AILI模型的制備及生存率分析

取Notch1M-KO和Notch1FL/FL小鼠各6 只，腹腔注射APAP 以構(gòu)建AILI 模型，APAP 溶液在實驗使用前1 h配制，將APAP溶解在PBS中，濃度為10 mg/mL，并在水浴箱中加熱到40 益。雄性小鼠禁食16 h，然后用400 mg/kg APAP 腹腔注射。在注射后的72 h內(nèi)每12 h觀察小鼠存活情況并記錄。

1.2.3 小鼠分組及處理

Notch1M-KO和Notch1FL/FL小鼠各12 只，分別隨機取6 只，通過腹腔注射APAP 構(gòu)建AILI 模型（Notch1FL/FL+APAP組、Notch1FL/FL+APAP組），具體方法同前。其余6只腹腔注射PBS作為對照（Notch1FL/FL+PBS 組、Notch1M-KO+PBS 組）。24 h 后通過乙醚吸入對小鼠進行安樂死，收集血液和肝臟組織。

1.2.4 肝功能及細胞因子檢測

小鼠的血液樣本室溫靜置30 min，3 000 r/min離心12 min，收集上清。采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）。TNF-α、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1 使用ELISA檢測。

1.2.5 肝臟組織切片染色

收集小鼠肝組織，部分肝組織石蠟包埋后切片（5 μm）行HE 染色觀察肝臟病理情況，Suzuki 評分評估肝組織損傷程度。部分肝組織OCT包埋后，冰凍切片（10 μm）行免疫熒光染色觀察肝組織CD11b和p-TAK1 的表達情況；冰凍切片室溫復溫30 min，4%福爾馬林固定10 min，0.1% Triton X-100 破膜（2.5%BSA），CD11b 抗體、p-TAK1 抗體（1∶100）4 益孵育過夜，熒光標記二抗（1∶250）室溫避光孵育1 h，DAPI封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測

50 mg 肝組織加入RIPA 蛋白裂解液超聲碾磨后提取總蛋白，BCA 試劑盒定量，確保蛋白上樣量為30 μg/孔。經(jīng)過電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，Notch1 抗體、TAK1 抗體、p-TAK1 抗體、p65 抗體、p-p65 抗體、Casp-8 抗體、RIPK1 抗體、p-MLKL 抗體（1∶1 000）4 益孵育過夜，根據(jù)一抗種屬進行二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，曝光得到條帶后經(jīng)Image J 分析灰度值。

1.2.7 原代肝細胞ROS檢測

分離Notch1FL/FL+APAP 組、Notch1M-KO+APAP 組小鼠（每組4 只）原代肝細胞進行ROS 檢測，DCF 探針（1∶500）加入不含血清培養(yǎng)基的原代肝細胞，37 益孵育20～30 min。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Prism8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，Kaplan-Meier 法進行小鼠生存分析；計量數(shù)據(jù)采用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 髓系特異性Notch1敲除驗證

分別分離Notch1FL/FL、Notch1M-KO小鼠的原代肝細胞和肝巨噬細胞，提取蛋白，Western blot 檢測Notch1的表達。結(jié)果顯示，Notch1M-KO小鼠肝巨噬細胞不表達Notch1，而Notch1FL/FL小鼠的原代肝細胞和肝巨噬細胞中Notch1正常表達（圖1A）。

圖1 Notch1M-KO加重APAP誘導的肝損傷及炎性細胞浸潤Figure 1 Myeloid-specific Notch1 knockout exacerbates APAP-induced liver injury and immune cell accumulation

2.2 Notch1M-KO加重APAP誘導的肝損傷

APAP 腹腔注射構(gòu)建小鼠AILI 模型，觀察小鼠死亡率。結(jié)果顯示，與Notch1FL/FL+APAP 組相比，Notch1M-KO+APAP組小鼠死亡率有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義（圖1B）。

HE染色結(jié)果顯示，PBS處理的小鼠肝臟病理未見明顯異常。小鼠腹腔注射APAP 后，肝臟病理提示肝細胞體積增大，竇道淤血，并出現(xiàn)廣泛的壞死。與Notch1FL/FL+APAP 組相比，經(jīng)APAP 腹腔注射的Notch1M-KO小鼠肝竇淤血，肝細胞體積增大及空泡樣變性，細胞邊界形態(tài)模糊等更為嚴重，出現(xiàn)廣泛細胞的壞死和炎性細胞浸潤；兩組Suzuki 評分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖1C）。血清轉(zhuǎn)氨酶是評價肝功能損傷的一個重要標志，PBS 處理的小鼠血清ALT及AST水平正常，而APAP處理組表達明顯升高。與Notch1FL/FL+APAP 組相比，Notch1M-KO+APAP組小鼠血清ALT 和AST 水平升高更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖1D）。進一步通過免疫熒光染色觀察肝臟切片中CD11b 的表達情況，APAP處理后，肝組織切片中CD11b 表達明顯升高，說明肝損傷后肝內(nèi)巨噬細胞浸潤增多；而與Notch1FL/FL+APAP 組相比，Notch1M-KO+APAP 組肝臟巨噬細胞浸潤增加更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.001，圖1E）。

2.3 Notch1M-KO通過激活TAK1 信號抑制細胞壞死性凋亡

Notch1 敲除后，APAP 處理組小鼠肝組織中p-TAK1 表達水平明顯升高（P＜0.001），同時伴有p-p65 表達上調(diào)（圖2A），但Casp-8 表達受到抑制，RIPK1 和p-MLKL 的表達上調(diào)（P＜0.001，圖2A）。而PBS 處理的Notch1FL/F和Notch1M-KO小鼠肝組織中p-TAK1、p-p65、Casp-8、RIPK1 和p-MLKL 蛋白的表達未見明顯差異。說明APAP可激活壞死性凋亡通路，導致肝細胞壞死增加，符合組織學結(jié)果。進一步通過免疫熒光染色檢測p-TAK1 在肝組織中表達情況，經(jīng)APAP 腹腔注射的Notch1M-KO小鼠肝組織中p-TAK1陽性的細胞明顯增多（P＜0.001，圖2B）。結(jié)合Western blot和免疫熒光染色結(jié)果，說明Notch1敲除后，激活p-TAK1 的表達促進肝臟細胞凋亡壞死，加重APAP誘導肝損傷的發(fā)生。

圖2 Notch1M-KO通過激活TAK1信號抑制細胞壞死性凋亡Figure 2 Myeloid-specific Notch1 knockout inhibits necroptosis through activation of TAK1 signaling

2.4 Notch1M-KO 加重全身炎癥反應及原代肝細胞ROS產(chǎn)生

與Notch1FL/FL+APAP組小鼠相比，Notch1M-KO+APAP組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（圖3A～D）。進一步通過DCF探針檢測原代肝細胞ROS情況，結(jié)果顯示Notch1M-KO小鼠肝細胞的ROS水平明顯升高（P＜0.01，圖3E）。

圖3 Notch1M-KO加重全身炎癥反應及原代肝細胞ROS產(chǎn)生Figure 3 Myeloid-specific Notch1 knockout exacerbates systemic inflammatory response and ROS generation in primary hepatocytes

3 討論

AILI可能不是DILI首位病因，卻是導致急性肝損傷的主要病因之一［3］。在美國，46%的急性肝損傷是服用過量APAP導致的［11］。急性肝損傷隨后引起各種并發(fā)癥甚至是多器官衰竭，進一步危及患者生命，最終需要行肝移植手術，而肝源缺乏導致只有少數(shù)患者才能得到救治。因此，進一步研究AILI發(fā)病機制，為臨床提供潛在治療靶點和預防策略顯得非常重要。

本研究通過對Notch1 特異性敲除小鼠腹腔注射APAP 構(gòu)建AILI 動物模型。研究發(fā)現(xiàn)，與PBS 處理組相比，APAP 處理組小鼠肝臟病理提示肝細胞水腫及肝細胞壞死，伴炎性細胞浸潤，說明AILI造模成功。與Notch1FL/FL+APAP組相比，Notch1M-KO+APAP 組小鼠肝組織損傷更嚴重，使用Suzuki 量化肝組織損傷程度，Suzuki評分明顯高于對照組，且血清ALT、AST表達明顯升高，說明髓系特異性Notch1敲除后加重了APAP誘導的肝損傷。

肝臟巨噬細胞在肝臟遭遇損傷應激后扮演重要角色，研究顯示，在AILI中，有51.5%的Kupffer細胞被激活［12］。本研究采用免疫熒光染色觀察CD11b的表達情況，結(jié)果顯示，經(jīng)APAP 處理后，Notch1M-KO組CD11b+細胞比例明顯升高，說明肝內(nèi)巨噬細胞浸潤增加。浸潤的巨噬細胞隨后釋放各種細胞因子，如TNF-α等，與靶細胞膜表面的TNF受體相結(jié)合，激活RIPK1-MLKL 信號通路放大炎癥信號［13］，甚至啟動細胞程序性死亡［14］。程序性死亡是細胞應對外界應激損傷的一個重要方式。既往研究表明可通過NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號調(diào)控炎癥反應［15］。APAP誘導肝損傷后，壞死的肝細胞釋放損傷相關的分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）招募炎性細胞。浸潤的炎性細胞隨后釋放多種促炎因子，導致“炎性因子風暴”或炎癥因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），進一步危及機體的生命［16］。本研究結(jié)果顯示，APAP 處理后小鼠RIPK1、p-MLKL表達增加，且Notch1M-KO組表達增加更明顯，說明巨噬細胞Notch1 缺乏導致炎性因子釋放增加，從而促進肝細胞壞死性凋亡通路激活，進一步加重肝損傷的發(fā)生。

既往研究發(fā)現(xiàn)，TAK1 是NF-κB 和c-Jun N 端激酶的上游細胞內(nèi)蛋白激酶，它被眾多細胞因子、生長因子和微生物產(chǎn)物激活［17］。而TAK1和RIPK1的相互作用在多種模型中被證實［18-20］。本研究通過Western blot 和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)在Notch1M-KO組AILI 模型中p-TAK1 表達明顯升高，說明Notch1 缺乏可促進肝臟TAK1 的磷酸化。進一步研究顯示，p-p65的表達上調(diào)，而Casp-8的表達下調(diào)，最終激活RIPK1-MLKL 信號通路，導致肝細胞壞死性凋亡增加。ROS 是反映細胞氧化應激的一個重要標志，過量的APAP 在體內(nèi)耗盡谷胱甘肽后形成APAP 蛋白結(jié)合物，進而導致肝細胞內(nèi)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，ROS 釋放，從而進一步加重氧化應激，最終使細胞裂解死亡［1］。通過DCF 探針檢測肝細胞中ROS，進一步證實Notch1M-KO組ROS水平明顯升高。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建小鼠AILI 模型，并通過髓系特異性敲除進一步探討固有免疫Notch1信號缺陷對AILI 肝細胞死亡機制的作用。結(jié)果顯示，髓系特異性Notch1 敲除加重肝細胞損傷，其可能機制是通過上調(diào)肝內(nèi)TAK1 信號，抑制Casp-8 的表達，從而激活RIPK1-MLKL 信號通路啟動肝細胞壞死性凋亡，最終導致?lián)p傷加重。本研究有可能為DILI 提供潛在的治療靶點，但也存在一定的缺陷。如沒有通過Notch1 過表達進一步驗證下游信號通路表達情況，Notch1 信號在巨噬細胞中如何調(diào)節(jié)炎性細胞因子的釋放，以及細胞間接觸相互影響如何，TAK1 如何調(diào)控Casp8 和RIPK1 的表達等，均有待進一步研究。