范蕾 秦積龍 林曉東 吳悅 何珍珍 何萍

肺癌是目前世界上死亡率最高的腫瘤[1]，也是中國最常見的癌癥[2]。近年來肺腺癌的發(fā)病率不斷攀升，已經(jīng)超過鱗癌成為肺癌最常見的組織學(xué)亞型。盡管通過影像學(xué)篩查，肺癌的早期發(fā)現(xiàn)率已大幅提升，但仍有較大比例的早期肺腺癌患者在手術(shù)后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。由此可見，預(yù)測早期肺腺癌的復(fù)發(fā)風險以及研究肺腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移機制尤為重要。

近年來，病理學(xué)家發(fā)現(xiàn)除傳統(tǒng)觀念的肺腺癌浸潤方式（間質(zhì)、脈管及胸膜侵犯）外，腫瘤細胞呈巢團狀或團簇狀在肺泡腔內(nèi)進行播散的現(xiàn)象同樣具有侵襲作用，2021版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）肺腫瘤病理分類將該現(xiàn)象命名為氣腔擴散（spread through air spaces, STAS）（圖1A-圖1D）。

圖1 肺浸潤性腺癌氣腔擴散及人為假象圖像（HE：A、C、E：×40；B、D：×100；F：×200）。A：浸潤性腺癌（虛線以左為腫瘤主體）；B：STAS現(xiàn)象；C：浸潤性腺癌（虛線以右為腫瘤主體）；D：STAS現(xiàn)象；E：浸潤性腺癌（虛線以上為腫瘤主體）；F：STAS現(xiàn)象及人為假象（黑色箭頭示STAS腫瘤細胞簇；紅色箭頭示線條狀腫瘤細胞）。虛線：腫瘤邊界；紅色方框：STAS。Fig 1 Morphologic features and morphologic artifacts of STAS pattern (HE : ×40 in A, C and E；×100 in B and D；×200 in F). A: Invasive adenocarcinoma (The main tumor is to the left of the dotted line); B: The pattern of STAS; C: Invasive adenocarcinoma (The main tumor is to the right of the dotted line); D: The pattern of STAS; E: Invasive adenocarcinoma (Above the dotted line is the main tumor); F: The pattern of STAS (The black arrow shows the tumor cell nest of STAS; The red arrow shows a line of tumor cells-a sign of artefact). Dotted line: tumor boundary; Red box:STAS. STAS: spread through air spaces; HE: hematoxylin-eosin.

STAS獨特的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及生物學(xué)特性，吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注。有多項研究[4-8]顯示STAS可作為肺癌不良預(yù)后的獨立危險因素，因此，STAS的精確診斷有助于為患者制定更合適的手術(shù)方案及治療策略。但目前由于STAS的判讀標準未能完全統(tǒng)一，STAS基因狀態(tài)的研究結(jié)果尚不完全一致，對于STAS究竟是病理制片過程中的人為假象還是腫瘤侵襲的一種表現(xiàn)形式尚存在爭議，所以有必要對STAS的生物學(xué)行為及基因狀態(tài)進行深入研究。本文擬對STAS與肺腺癌的臨床病理學(xué)特征及分子改變之間的相關(guān)性進行探討，以進一步為STAS的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 納入2019年7月至2021年3月于廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肺癌根治術(shù)的肺非黏液性浸潤性腺癌共3347例，其中STAS陽性病例為344例。綜合評估后，通過傾向性評分匹配方法，選取同時間段內(nèi)STAS陰性病例350例。記錄患者年齡、性別及病理學(xué)特征等。此研究已通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批（No.2020第K-55），患者及家屬均知情同意并自愿參加。

1.2 病理診斷方法 肺腺癌診斷標準：結(jié)合手術(shù)切除標本及病理檢查結(jié)果，腫瘤病理學(xué)以腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期為準，依據(jù)為第八版美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）癌癥分期手冊。肺腺癌標本按照2021年WHO胸部腫瘤分類進行組織學(xué)分型，并對其生長方式及有無胸膜、脈管、神經(jīng)束侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征進行分析。

STAS診斷標準：主瘤體邊界外的氣腔內(nèi)出現(xiàn)微乳頭狀細胞簇、實性細胞巢或單個腫瘤細胞。本研究中將超過腫瘤主體3個肺泡腔且存在于肺組織內(nèi)的腫瘤細胞判定為STAS現(xiàn)象。無法區(qū)分腫瘤細胞與組織細胞時，采用免疫組化細胞角蛋白7（cytokeratin 7, CK7）/甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyriod transcription factor-1, TTF-1）協(xié)助診斷。

人為假象的判定：（1）肺泡腔內(nèi)隨機出現(xiàn)的單個細胞，且缺乏持續(xù)擴散現(xiàn)象；（2）沿肺泡壁脫落的線性細胞帶及鋸齒狀細胞團簇（圖1E，圖1F）；（3）位于組織邊緣或切片水平面以外的腫瘤細胞簇；（4）正常的良性肺細胞或支氣管細胞；（5）與主瘤體組織學(xué)形態(tài)不一的腫瘤細胞。以上情況均不納入樣本統(tǒng)計。

胸膜侵犯診斷標準[9]：胸膜侵犯分為PL0-3級。PL0為腫瘤細胞緊鄰臟層胸膜但未超出外彈力板；PL1為腫瘤細胞超出外彈力板，但未突破臟層胸膜間皮層；PL2為腫瘤細胞突破臟層胸膜間皮層，但未侵犯壁層胸膜；PL3為侵犯壁層胸膜。本研究中將PL1-3均判定為胸膜侵犯。

間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）蛋白表達陽性免疫組化判讀標準如下：以腫瘤細胞胞漿彌漫性、強顆粒狀著色判讀為蛋白表達陽性（圖2）。胞膜著色則為陰性。

圖2 120 mm STAS的HE染色及ALK免疫組化染色（HE：A：×40，B：×200；ALK免疫組化染色：C：×40，D：×200）。A、C：浸潤性腺癌（虛線以下為腫瘤主體）；虛線：腫瘤邊界；紅色方框：STAS；B、D：STAS現(xiàn)象。Fig 2 HE staining and ALK immunohistochemical staining of STAS (HE: A: ×40, B: ×200; ALK immunohistochemical staining: C: ×40, D: ×200). A, C:Invasive adenocarcinoma (Below the dotted line is the main body of the tumor); Dotted line: Tumor boundary; Red box: STAS; B, D: The pattern of STAS. ALK: anaplastic lymphoma kinase.

1.3 質(zhì)量控制 病理閱片由兩名高年資呼吸病理亞?？漆t(yī)生采取雙盲法完成，排除意見不一致的病例。為避免現(xiàn)患新發(fā)病例偏倚，均選用2019年7月至2021年3月首次診斷的新發(fā)病例。

1.4 免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚切片，行蘇木素-伊紅（hematoxylineosin, HE）及免疫組化染色。間變性淋巴瘤激酶［ALK（D5F3）］伴隨診斷試劑盒（Ventana即用）、OptiView DAB免疫組化檢測試劑盒均購自瑞士羅氏公司。免疫組化染色均設(shè)立陰性及陽性對照，其中陰性對照采用兔單克隆陰性質(zhì)控抗體。檢測設(shè)備為羅氏全自動免疫組化染色儀（型號：BenchMark ULTRA），染色流程按照試劑盒說明書進行。

1.5 基因檢測 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變檢測采用擴增阻滯突變系統(tǒng)-聚合酶鏈反應(yīng)（amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction, ARMSPCR）技術(shù)，肉瘤致癌因子受體（ROS proto-oncogene 1-receptor,ROS1）基因融合檢測采用反轉(zhuǎn)錄-PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR）技術(shù)。

EGFR基因突變檢測試劑盒、ROS1融合基因檢測試劑盒及福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed and parrffin-embedded, FFPE）DNA/RNA核酸提取試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。MX3000P實時熒光定量PCR儀購自安捷倫科技（中國）有限公司。具體檢測流程均依據(jù)操作指南及試劑盒說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差表示；計數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）描述，采用χ2檢驗、χ2檢驗校正公式或Fisher確切概率法進行分析；采用二分類Logistic回歸模式進行多因素分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 臨床病理學(xué)資料 研究人群的臨床病理特征見表1。694例肺腺癌患者中，男性336例（48.4%），女性358例（51.6%），其中年齡＞65歲者為215例（31.0%），≤65歲者為479例（69.0%），年齡范圍為25.00-85.00歲，平均年齡為（59.76±8.33）歲。腫瘤最大徑范圍為0.60-8.50 cm，平均值為（2.38±1.24） cm，其中543例（78.2%）腫瘤最大徑≤3 cm，151例（21.8%）腫瘤最大徑＞3 cm。腫瘤分期中，I期為475例（68.4%），II期為81例（11.7%），III期為113例（16.3%），IV期為25例（3.6%）。

表1 STAS與臨床病理因素的分析Tab 1 Analysis between STAS and the clinicopathological factors

生物學(xué)行為特征：胸膜侵犯208例（30.0%），脈管侵犯247例（35.6%），神經(jīng)束侵犯21例（3.0%），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移155例（22.3%）。組織病理學(xué)亞型特征：腺泡型411例（59.2%），乳頭型106例（15.3%），貼壁型76例（11.0%），實性50例（7.2%），微乳頭型43例（6.2%），復(fù)雜腺體型8例（1.2%）。

STAS陽性病例中，ALK陽性48例（14.4%,48/333），ROS1陽性4例（2.2%, 4/183），EGFR陽性106例（57.9%, 106/183）。STAS陰性病例中，ALK陽性12例（4.2%, 12/287），ROS1陽性3例（1.8%, 3/164），EGFR陽性101例（61.6%, 101/164）（表2）。

表2 STAS與ALK蛋白表達及ROS1融合、EGFR突變的分析Tab 2 Analysis between STAS and the protein expression status of ALK and ROS1, EGFR mutation.

所有檢測病例中EGFR突變陽性共207例，EGFR基因突變率為59.7%（207/347），在STAS陽性及陰性病例中EGFR突變率分別為57.9%與61.6%。單位點突變前5位分別是：L858R有93例（44.9%, 93/207），19-Del有78例（37.7%, 78/207），G719X有10例（4.8%,10/207），L861有4例（1.9%, 4/207），S768I有4例（1.9%, 4/207）。STAS陽性病例中，單位點突變前五位分別是：L858R有42例（39.6%, 42/106），19-Del有41例（38.7%, 41/106），G719X有6例（5.7%, 6/106），L861有3例（2.8%, 3/106），S768I有3例（2.8%,3/106）。

2.2 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果 單因素分析顯示，STAS陽性與腫瘤最大徑（P＜0.001）、胸膜侵犯（P＜0.001）、脈管侵犯（P＜0.001）、神經(jīng)束侵犯（P=0.013）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、臨床分期（P＜0.001）、組織學(xué)分型（P＜0.001）（表1）及ALK蛋白表達（P＜0.001）（表2）相關(guān)；與性別（P=0.258）、年齡（P=0.360）（表1）、ROS1融合（P=0.814）及EGFR突變（P=0.488）（表2）無關(guān)。

多因素分析顯示，胸膜侵犯（P=0.001）、脈管侵犯（P＜0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）及ALK蛋白表達（P=0.032）與STAS陽性相關(guān)（表3）。此外，臨床分期和組織學(xué)分型與STAS陽性有關(guān)。在臨床分期中，以I期作為參照，II、III、IV期發(fā)生STAS的可能性分別是4.354、3.642及6.125倍。組織學(xué)分型中，以貼壁型生長方式為主的肺腺癌為參照，微乳頭型生長方式為主的肺腺癌發(fā)生STAS陽性的可能性是34.503倍，復(fù)雜腺體結(jié)構(gòu)為主是21.153倍，其余乳頭型、實體型及腺泡型分別為8.982、7.096及5.235倍。

表3 STAS與相關(guān)病理因素多因素回歸分析Tab 3 Multivariate regression analysis of STAS and the clinicopathological features

3 討論

STAS在2021版WHO肺腫瘤病理分類中被定義為“出現(xiàn)在主瘤體邊界外肺泡腔內(nèi)的微乳頭狀腫瘤細胞簇、實性腫瘤細胞巢或單個腫瘤細胞”。STAS的提出意味著腫瘤對“空氣”的侵襲作為一個新的概念被普遍接受，除傳統(tǒng)的肺腺癌浸潤方式（間質(zhì)、脈管或胸膜侵犯）外，STAS被確定為第4種肺浸潤性腺癌的侵襲模式。

既往在STAS分級研究中，主要是從STAS腫瘤細胞簇與主瘤體之間的距離及STAS腫瘤細胞簇的數(shù)量兩個方面進行分析。Warth等學(xué)者[10]以STAS腫瘤細胞簇與腫瘤主體之間的距離作為判定標準，將距離小于3個肺泡者定義為局限性STAS，將距離大于3個肺泡者定義為廣泛性STAS，研究結(jié)果提示3個肺泡腔以上的廣泛STAS現(xiàn)象更易出現(xiàn)在以高級別生長方式為主的肺腺癌中。另Han的團隊[5]在研究中以2500 μm（1個×10物鏡的視野）作為分界點，將距離＜2500 μm定義為STAS I級，距離≥2500 μm定義為STAS II級，該研究提示具有STAS II級的肺腺癌預(yù)后更差。Toyokawa等[11]以STAS腫瘤細胞簇的數(shù)量作為研究對象，根據(jù)腫瘤細胞數(shù)量將STAS分為3類：“no STAS”（未見明確腫瘤細胞）、“l(fā)ow STAS”（1-4個單個或簇狀腫瘤細胞）及“high STAS”（5個及5個以上單個或簇狀腫瘤細胞），結(jié)果顯示腫瘤細胞數(shù)量的多少與不良預(yù)后之間具有正相關(guān)關(guān)系。以上文獻研究表明，當STAS距腫瘤主體超過3個肺泡腔以及STAS數(shù)量≥5個腫瘤細胞時更具有侵襲性，故本研究將腫瘤細胞距離主瘤體≥3個肺泡腔作為STAS陽性的判定標準。

本研究中，STAS陽性病例有192例（55.8%）出現(xiàn)脈管侵犯，157例（45.6%）出現(xiàn)胸膜侵犯，115例（33.4%）出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。經(jīng)多因素回歸分析，胸膜侵犯（P=0.001）、脈管侵犯（P＜0.001）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）與STAS有關(guān)。結(jié)果表明STAS陽性病例發(fā)生胸膜侵犯、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險更大，提示預(yù)后更差。

此前有研究[8,10,12,13]顯示高級別生長方式為主的肺腺癌中更易出現(xiàn)STAS，且多以廣泛性STAS為主。本研究中STAS在不同病理亞型肺腺癌中出現(xiàn)的比例為：腺泡型47.7%（196/411）、實體型64.0%（32/50）、乳頭型60.4%（64/106）、微乳頭型90.7%（39/43）、貼壁型7.9%（6/76）、復(fù)雜腺體型87.5%（7/8）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，以微乳頭型生長方式為主的肺腺癌中最容易出現(xiàn)STAS陽性，其余依次為復(fù)雜腺體型、乳頭型及實體型肺腺癌（表3）。

迄今，不同研究小組對STAS的分子學(xué)改變進行了研究，并展示了相應(yīng)的結(jié)果。有研究[14]表明STAS陽性的患者大多容易出現(xiàn)EGFR（-）、KRAS（-）、BRAF（-）、ALK（+）和HER2野生型這5種分子學(xué)改變。STAS與野生型EGFR基因狀態(tài)相關(guān)[10,14-19]。STAS在肺腺癌中與ALK和ROS1蛋白表達有關(guān)[20]，Tian等[15]及Sun等[16]也證實了在具有ALK重排的肺腺癌中更易觀察到STAS現(xiàn)象。

本研究中STAS陽性與ALK蛋白表達有關(guān)，但與EGFR突變及ROS1融合無明顯關(guān)系。統(tǒng)計結(jié)果示STAS陽性病例中ALK蛋白陽性率為14.4%（48/333），STAS陰性病例中ALK蛋白陽性率為4.2%（12/287）。STAS陽性病例的ALK蛋白陽性率遠高于STAS陰性患者。研究結(jié)果與Gao等[21]及Shin等[22]學(xué)者的觀點一致。本研究中ROS1陽性率在STAS陽性及陰性人群中均不高，分別為2.2%及1.8%。STAS與提示患者預(yù)后不良的高危因素及ALK蛋白表達均有關(guān)，故我們推測ALK陽性肺癌的不良預(yù)后可能與STAS的出現(xiàn)有關(guān)。

本研究中，EGFR突變位點主要為L858R（44.9%）及19-Del（37.7%），總占比可達EGFR突變陽性病例的82.9%。但本研究在STAS陽性及STAS陰性組間未發(fā)現(xiàn)EGFR突變率及突變位點的差異。

本研究存在不足之處，因研究對象均為2019年7月之后的病例，隨訪時間較短，故未能進行生存及預(yù)后分析。另外，本研究未能按照STAS細胞群的位置、大小、數(shù)量不同對病例進行分層分析。

本研究結(jié)果顯示STAS陽性與肺癌腫瘤大小、胸膜侵犯、脈管侵犯、神經(jīng)束侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，表明STAS并非病理制片過程中的人為假象，而確實是腫瘤侵襲的一種表現(xiàn)形式。在臨床工作中，STAS的判斷能為臨床術(shù)式選擇、精準治療及預(yù)后判斷等方面提供有價值的信息，病理醫(yī)師應(yīng)當重視對于肺腺癌中STAS的識別和診斷。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

He P conceived and designed the study. Fan L performed the experiments and analyzed the data. Qin JL contributed analysis tools. Lin XD contributed immunohistochemical techniques.Wu Y and He ZZ collected the data. He P provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.