程釧 吳巍 俞嘉鑫 袁冬冬 王玉炯 李樂(lè)

肺癌是最常見(jiàn)的癌癥之一，占總病例的11.4%，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1,2]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例的80%-85%[3]，具有易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、基因突變概率大等特點(diǎn)。盡管在開(kāi)發(fā)新的化療靶向藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑方面取得了進(jìn)展，但為改善治療結(jié)果，仍有許多工作要做[4]。為了提高肺癌患者的治愈率，探索新的抗肺癌策略勢(shì)在必行[5]。

在治療癌癥方面，中草藥因其在預(yù)防腫瘤發(fā)生、降低毒性、提高放化療療效、減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到世界各國(guó)的認(rèn)可[6]。中草藥為癌癥治療提供了大量的自然資源。然而，應(yīng)用嚴(yán)格和系統(tǒng)的方法來(lái)評(píng)估中藥配方的療效并將其轉(zhuǎn)化為臨床藥物至關(guān)重要[7-10]。本研究所使用的中藥配方（novel Chinese medicine formula-01,NCHF-01）由苦參、虎杖、紫草、連翹、桂枝等12味中藥組成，該方有通肺清熱化痰之功效。雖然NCHF-01已被用于肺癌的臨床治療，但其抗NSCLC的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究使用NCHF-01通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討NCHF-01抗NSCLC的作用機(jī)制，為NCHF-01臨床治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物 人NSCLC細(xì)胞H1299和A549由清華大學(xué)江鵬教授提供，小鼠肺癌細(xì)胞（lewis lung cells,LLC）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

30只SPF級(jí)4周齡雄性C57BL/6 J小鼠，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)為：IACU-NYLAC-2022-029，在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別的動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥材和試劑 該中藥配方的總重量為200 g，由連翹（20 g）、苦參（15 g）、天葵子（15 g）、蔓荊子（20 g）、桂枝（10 g）、虎杖（20 g）、蛇床子（20 g）、厚樸（15 g）、生姜（10 g）、重樓（20 g）、紫草（15 g）、補(bǔ)骨脂（20 g）12味中藥組成，均購(gòu)自寧夏大河源中藥有限公司。所有原料均用水煎煮2次，濃縮至400 mL，生藥濃度為500 mg/mL，在實(shí)驗(yàn)前用0.22 μm PES膜過(guò)濾器過(guò)濾藥物。Dulbecco’s modified eagle’s medium DMEM（C11995500BT）、RPMI-1640（C11875500BT）培養(yǎng)基、預(yù)染色蛋白Marker（26616）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；胎牛血清FBS（FCS500）購(gòu)自吉泰依科賽公司；BCA蛋白定量試劑盒（MPK002）購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；MTT（M1020）試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（CA1020）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒（S9687）購(gòu)自美國(guó)Selleck；鼠抗β-actin抗體（1:5000, BE0021）、山羊抗兔抗體（1:8000, BE0101）、山羊抗鼠抗體（1:8000, BE0102）購(gòu)自中國(guó)EASYBIO公司；兔抗6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphate glucose dehydrogenase, G6PD）（1:3000, 25413-AP）、兔抗6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGD）（1:1000, 14718-1-AP）、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein, Bax）（1:1000, 50599-2-Ig）、兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）（1:1000, 12789-1-AP）購(gòu)自武漢Proteintech。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Waters Acquity I-Class UPLC液相色譜儀串聯(lián)Waters Xevo G2-S高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Life Sciences公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、液氮罐、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）；流式細(xì)胞儀（中國(guó)深圳唯工生物）；ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印電泳儀（上海Tanon公司）；多功能酶標(biāo)儀（中國(guó)杭州奧盛公司）；超聲破碎儀（中國(guó)寧波新芝公司）；移液器（德國(guó)Eppendorf公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 UHPLC-Q-TOF-MS分析 使用Acquity UHPLC系統(tǒng)和Waters Synapt G2-Si Q-TOF對(duì)NCHF-01進(jìn)行鑒定分析。液相色譜條件為Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm, i.d., 1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫35oC，流速0.25 mL/min，上樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210-400 nm。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（electrospray ionization, ESI），掃描范圍為50-1500 m/z；掃描模式為MSe，溫度為500oC（ESI+）和400oC（ESI-），-2.5 kV（ESI-）和2.0 kV。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，將1×106LLC細(xì)胞用0.1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline, PBS）重懸，皮下注射到小鼠背部一側(cè)。7 d后，對(duì)照組給予純凈水灌胃，NCHF-01組分別給予3.75、7.5、15 g/kg藥物灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）25 mg/kg腹腔注射，PBS對(duì)照組給予相同劑量腹腔注射，兩天一次。15 d后，取出腫瘤并稱(chēng)重。

1.2.3 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色 小鼠處理15 d后，乙醚麻醉，0.9%生理鹽水心內(nèi)灌注至肝臟變白，用4%多聚甲醛溶液全身灌注，取出組織置于4%甲醛溶液中過(guò)夜。組織包埋于石蠟中，并切成5 μm，置于二甲苯中脫烴，在分級(jí)乙醇中再水化，然后用HE染色。使用顯微鏡拍攝并記錄。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) H1299細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基，A549和LLC細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，所有細(xì)胞均用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在37oC、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 將5×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，在37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后加入不同濃度藥物處理，NCHF-01的濃度為：0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、22.5 mg/mL，對(duì)照組用水處理，48 h后，用MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.6 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將2×104個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，在37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度NCHF-01處理，每隔1天更換含有NCHF-01的培養(yǎng)基，對(duì)照組用水處理。7 d后，選取每個(gè)處理組中的3個(gè)重復(fù)，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，1個(gè)重復(fù)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，用0.05%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗后拍照。

1.2.7 細(xì)胞周期檢測(cè) NCHF-01處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，70%乙醇，4oC固定12 h后，加入100 μL RNase A在37oC下孵育30 min，加入400 μL PI，在4oC下避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，利用Flow Jo對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè) NCHF-01處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，加入100 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL的AV試劑避光染色10 min，最后加入5 μL的PI試劑避光染色5 min，補(bǔ)加900 μL的1×Binding Buffer。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，利用Flow Jo對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.9 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 將UHPLC-Q-TOF-MS分析得到的化合物使用Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)其治療靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)收集NSCLC相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。利用Venny 2.1.0軟件篩選化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白與蛋白互作（proteinprotein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)。采用基因本體（Gene Ontology, GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析對(duì)化合物作用于NSCLC的分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.10 活性氧測(cè)定 NCHF-01處理細(xì)胞H1299和A549，48 h后，加入含有10 μmol/L DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37oC、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。收集細(xì)胞，PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，利用Flow Jo對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.11 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) NCHF-01處理細(xì)胞H1299和A549，48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度。使用相同濃度蛋白上樣量進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4oC孵育過(guò)夜，使用TBST清洗3遍，每遍4 min，室溫孵育二抗1 h，TBST清洗3遍，每遍4 min，ECL發(fā)光液孵育，化學(xué)發(fā)光儀曝光顯影。

1.2.12 G6PD和6PGD酶活性檢測(cè) NCHF-01處理細(xì)胞H1299和A549，48 h后，加入100 μL的EMBOIP Buffer裂解液，冰上裂解30 min，離心去沉淀，BCA測(cè)定蛋白濃度，并將蛋白量調(diào)整為一致，取20 μL加入到180 μL的緩沖體系（1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L Tris pH 8.1，200 μmol/L G6PD和6PGD，100 μmol/L NADP+）中，利用酶標(biāo)儀，在341 nm下進(jìn)行酶活性檢測(cè)，每15 s檢測(cè)1次，檢測(cè)14 min。測(cè)定結(jié)果為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）的含量，以此測(cè)定G6PD和6PGD的酶活性。

1.2.13 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC） 采用IHC檢測(cè)Ki-67、Bcl-2、G6PD、6PGD在腫瘤組織中的表達(dá)。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，脫蠟和再?gòu)?fù)水石蠟切片與Ki-67（1:500）、Bcl-2（1:300）、G6PD（1:300）、6PGD（1:300）一抗孵育2 h后，與相應(yīng)的二抗孵育2 h，然后，滴加新鮮的二甲基聯(lián)苯胺底物對(duì)切片進(jìn)行可視化，使用蘇木素反染，并進(jìn)行鏡檢分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析并作圖，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。兩組之間差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCHF-01中活性成分分析 NCHF-01的UPLC-Q-TOF/MS的代表性色譜圖見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)分析，利用數(shù)據(jù)庫(kù)匹配和現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)NCHF-01的109個(gè)活性成分進(jìn)行初步鑒定和描述。從NCHF-01中鑒定出的主要活性成分，包括37種黃酮類(lèi)化合物、13種皂苷類(lèi)化合物、8種香豆素類(lèi)化合物、7種羧酸類(lèi)化合物、8種生物堿類(lèi)化合物、6種苷類(lèi)化合物、14種酚類(lèi)化合物、種木質(zhì)素類(lèi)化合物、7種醌類(lèi)化合物以及其他類(lèi)型化合物。其中虎杖、連翹和重樓是鑒定活性成分的主要來(lái)源。之后，我們選取NCHF-01中幾種活性成分進(jìn)行定量分析（表1），結(jié)果顯示，在NCHF-01中和厚樸酚的平均濃度為20.9 ng/mL，氧化苦參堿的平均濃度為39.5 ng/mL，重樓皂苷VII、連翹酯苷A及虎杖甙的平均濃度分別達(dá)到249.7、354.7以及381.7 ng/mL。

表1 NCHF-01成分分析結(jié)果Tab 1 Analysis results of different components in NCHF-01

圖1 NCHF-01的UPLC-Q-TOF-MS基峰離子流圖。A：正離子模式；B：負(fù)離子模式。Fig 1 UPLC-Q-TOF-MS base peak ion flow diagram of NCHF-01. A: Positive mode; B: Negative mode. NCHF-01: novel Chinese medicine formula-01.

2.2 NCHF-01抑制LLC荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng) 為了評(píng)估NCHF-01是否能夠達(dá)到治療NSCLC的效果，我們構(gòu)建LLC荷瘤小鼠模型，并通過(guò)灌胃的方式進(jìn)行給藥處理，15 d后取出腫瘤并拍照。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，NCHF-01明顯抑制了LLC荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)（圖2A，圖2B）。為檢測(cè)NCHF-01是否存在副作用，我們將LLC荷瘤小鼠心臟、肝臟和腎臟取出，并進(jìn)行HE染色。結(jié)果表明，在NCHF-01治療組中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的組織學(xué)改變（圖2C）。此外，我們還檢測(cè)了血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血尿素氮、肌酐和堿性磷酸酶的含量，以了解NCHF-01是否影響肝臟和腎臟功能。結(jié)果顯示，在NCHF-01治療組和未治療組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差異（表2）。以上結(jié)果顯示，該中藥配方NCHF-01能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且無(wú)明顯的毒副作用。

表2 NCHF-01對(duì)腫瘤小鼠肝腎功能的影響Tab 2 Effects of NCHF-01 on liver and kidney function in tumor mice

圖2 NCHF-01對(duì)LLC荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。A、B: 不同處理組小鼠的腫瘤大?。ˋ）及重量（B）；C: 小鼠不同器官組織切片HE染色（比例尺=200 μm）。**P＜0.01。Fig 2 Effect of NCHF-01 on tumor growth in LLC tumor-bearing mice. A, B: Tumor size (A) and weight (B) of mice in different treatment groups: C:HE staining analysis of tissue sections from different organs of mice (Scale bar=200 μm). **P＜0.01. LLC: lewis lung cells; HE: hematoxylin-eosin;PBS: phosphate buffer solution; 5-FU: 5-fluorouracil.

2.3 NCHF-01抑制NSCLC細(xì)胞的增殖 通過(guò)構(gòu)建小鼠腫瘤模型，我們測(cè)定該中藥配方NCHF-01能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)（圖2）。因此，我們通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該中藥配方所發(fā)揮的抗腫瘤作用。為了檢測(cè)NCHF-01對(duì)NSCLC細(xì)胞活力的影響，我們利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，在藥物的作用下，H1299和A549細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯下降，NCHF-01能夠明顯抑制細(xì)胞的活力（圖3A，圖3B），其對(duì)H1299和A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）分別為8.9和9.6 mg/mL，由于10.0和15.0 mg/mL之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，我們選擇5.0、10.0 mg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證NCHF-01對(duì)NSCLC細(xì)胞的抗增殖作用，我們進(jìn)行結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)照組（0 mg/mL）中H1299和A549細(xì)胞數(shù)分別為8.29×105和9.12×105，在使用不同濃度藥物處理后，5.0 mg/mL中H1299和A549細(xì)胞數(shù)分別為3.31×105和4.02×105，10.0 mg/mL中H1299和A549細(xì)胞數(shù)分別為8.36×104和7.88×104，細(xì)胞的增殖能力明顯下降（圖3C，圖3D）。表明NCHF-01能夠抑制NSCLC細(xì)胞的增殖能力。

圖3 NCHF-01對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響。A、B：NCHF-01以0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、22.5 mg/mL濃度處理細(xì)胞48 h后，檢測(cè)H1299（A）和A549（B）細(xì)胞的活力；C、D: NCHF-01以0、5.0、10.0 mg/mL濃度處理細(xì)胞，7 d后觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響（C）并計(jì)數(shù)（D）。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。Fig 3 Effect of NCHF-01 on the proliferation of NSCLC cells. A, B: NCHF-01 treated cells with 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0, 20.0, 22.5 mg/mL for 48 h, and to detect the viability of H1299 (A) and A549 (B) cells; C, D: NCHF-01 treated cells with 0, 5.0, 10.0 mg/mL for 7 d, and to observe its effect on cell proliferation (C) and count (D). *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001; NS: no significant difference. NSCLC: non-small cell lung cancer.

2.4 NCHF-01抑制NSCLC細(xì)胞周期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡 為了進(jìn)一步探討NCHF-01對(duì)細(xì)胞增殖的抑制是否是由于其對(duì)細(xì)胞周期的影響，我們進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)去檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示，NCHF-01促進(jìn)細(xì)胞的G2/M期停滯（圖4A，圖4B）。之后，我們利用Annexin V-FITC和Propidium iodide對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重標(biāo)記，以檢測(cè)NCHF-01對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H1299和A549細(xì)胞的凋亡率隨藥物濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從11.01%、9.79%上升至64.90%、62.90%，其明顯增加了H1299和A549細(xì)胞的凋亡率（圖4C，圖4D）。結(jié)果表明，NCHF-01處理可以有效地誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的G2/M期停滯，抑制細(xì)胞周期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖4 NCHF-01以0、5.0、10.0 mg/mL濃度處理細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H1299和A549細(xì)胞的細(xì)胞周期（A、B）和細(xì)胞凋亡（C、D）。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。Fig 4 Flow cytometry detection of cell cycle (A, B) and apoptosis (C, D) of H1299 and A549 cells in NCHF-01 treated cell with 0, 5.0, 10.0 mg/mL for 48 h. *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001.

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)NCHF-01治療NSCLC的作用機(jī)制 為了探究該中藥配方抑制NSCLC的分子機(jī)制，我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)NCHF-01治療NSCLC的作用靶點(diǎn)。從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中分別收集得到2655個(gè)和13個(gè)候選靶點(diǎn)，刪除重復(fù)后得到2657個(gè)NSCLC相關(guān)基因靶點(diǎn)。將UHPLC-Q-TOF-MS分析得到的NCHF-01中含有的活性成分使用Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)，得到1034個(gè)治療所有疾病的靶點(diǎn)。利用Venny 2.1對(duì)2657個(gè)NSCLC相關(guān)疾病靶點(diǎn)基因和1034個(gè)預(yù)測(cè)的NCHF-01治療所有疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射和交叉，得到464個(gè)NCHF-01治療NSCLC的靶點(diǎn)（圖5A）。根據(jù)選定的活性成分和藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，將464個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得其相互作用關(guān)系，通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5B）。GO分析（圖5C）顯示NCHF-01通過(guò)各種生物學(xué)過(guò)程影響NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，包括肽-酪氨酸磷酸化、激酶活性的正向調(diào)節(jié)、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、蛋白激酶活性的正調(diào)控、腺體發(fā)育、活性氧反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)。KEGG分析顯示（圖5D），磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT）信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、MAPK信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、內(nèi)分泌抵抗、碳代謝等是參與NCHF-01治療NSCLC的主要代謝通路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激以及碳代謝在NCHF-01的抗NSCLC中發(fā)揮重要作用。

圖5 NCHF-01的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果。A：Venny圖交集得到的NCHF-01治療NSCLC的靶點(diǎn)；B：根據(jù)交集得出的作用靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；C、D：交集靶點(diǎn)的GO分析與KEGG富集分析。Fig 5 Results of network pharmacology analysis of NCHF-01. A: The target of NCHF-01 in the treatment of NSCLC obtained by the intersection of Venny diagram; B: According to the intersection targets to construct the PPI network; C, D: GO analysis and KEGG enrichment analysis for the intersection targets. PPI: protein-protein interaction; PD-L1: programmed cell death ligand 1; PD-1: programmed cell death 1; EGFR: epidermal growth factor receptor; PI3K: phosphatidyl inositol 3-kinase; AKT: protein kinase B; MAPK: mitogen-activated protein kinase; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GO: Gene Ontology.

2.6 NCHF-01誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞ROS的積累 為了維持穩(wěn)定的腫瘤微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞需調(diào)節(jié)各種抗氧化機(jī)制。研究表明，ROS水平異常高時(shí)，它可以通過(guò)與線(xiàn)粒體蛋白的相互作用引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，我們用5.0和10.0 mg/mL濃度的NCHF-01處理H1299和A549細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NCHF-01處理組的ROS水平隨藥物濃度的增加也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，明顯增加了細(xì)胞內(nèi)ROS的水平（圖6A，圖6B）。為了研究ROS在NCHF-01的抗NSCLC中的作用，我們用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）處理H1299和A549細(xì)胞，與對(duì)照組相比，加入NAC后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯下降，并且細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)明顯下降，降低了NCHF-01誘導(dǎo)的ROS積累（圖6C，圖6D）和細(xì)胞凋亡（圖6E，圖6F）。結(jié)果表明，ROS的積累能夠促進(jìn)NCHF-01的抗NSCLC作用。

圖6 NCHF-01對(duì)NSCLC細(xì)胞中ROS水平的影響。A、B：NCHF-01以0、5.0、10.0 mg/mL濃度處理細(xì)胞48 h后，檢測(cè)細(xì)胞ROS水平的變化；C、D：NCHF-01以0、10.0 以及5.0 mmol/L NAC濃度處理細(xì)胞48 h后，檢測(cè)細(xì)胞ROS水平的變化；E、F：NCHF-01以0、10.0以及5.0 mmol/L NAC濃度處理細(xì)胞48 h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。Fig 6 Effect of NCHF-01 on ROS levels in NSCLC cells. A, B: Changes in ROS levels after NCHF-01 treated cells with 0, 5.0, 10.0 mg/mL for 48 h; C,D: Changes in ROS levels after NCHF-01 treated cells with 0, 10.0 and 5.0 mmol/L NAC for 48 h; E, F: Changes of cell apoptosis after NCHF-01 treated cells with 0, 10.0 and 5.0 mmol/L NAC for 48 h. *P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001. ROS: reactive oxygen species; NAC: N-acetylcysteine.

2.7 NCHF-01抑制NSCLC細(xì)胞的磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP） 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出，氧化應(yīng)激以及碳代謝在NCHF-01的抗NSCLC中發(fā)揮重要作用，而在碳代謝過(guò)程中，PPP所產(chǎn)生的NADPH對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡至關(guān)重要，我們假設(shè)NCHF-01通過(guò)抑制NSCLC細(xì)胞中的PPP，進(jìn)而降低NADPH的水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累。因此，我們用NCHF-01處理H1299和A549細(xì)胞，并檢測(cè)PPP關(guān)鍵酶的表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，NCHF-01降低了PPP中關(guān)鍵酶G6PD和6PGD的蛋白表達(dá)和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)（圖7A），并減弱細(xì)胞中G6PD和6PGD的酶活性（圖7B）。此外，我們提取LLC荷瘤小鼠模型腫瘤組織蛋白，檢測(cè)腫瘤組織中PPP和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究NCHF-01的抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，NCHF-01治療組的G6PD、6PGD和Bcl-2的蛋白表達(dá)較低，Bax的蛋白表達(dá)則較高（圖7C）。通過(guò)IHC分析檢測(cè)Ki-67、G6PD和6PGD的表達(dá)，如圖7D所示，NCHF-01治療明顯降低了Ki-67和Bcl-2的表達(dá)，表明NCHF-01可以抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且G6PD和6PGD的表達(dá)減少表明NCHF-01誘導(dǎo)了PPP的抑制。以上結(jié)果表明，NCHF-01可以抑制NSCLC細(xì)胞的PPP，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，引起ROS的積累，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖7 NCHF-01對(duì)NSCLC的PPP的影響。A、B：NCHF-01以0、5.0、10.0 mg/mL濃度處理細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)PPP相關(guān)蛋白表達(dá)（A），并檢測(cè)PPP關(guān)鍵酶活性（B）；C：Western blot檢測(cè)不同處理組小鼠腫瘤組織PPP相關(guān)蛋白表達(dá)；D：IHC檢測(cè)腫瘤組織Ki-67、Bcl-2、G6PD和6PGD的表達(dá)（比例尺=200 μm）。*P＜0.05；***P＜0.001。Fig 7 Effect of NCHF-01 on the PPP in NSCLC. A, B: Expression of PPP related proteins (A) and activity of PPP key enzymes (B) in the cells were treated with NCHF-01 at 0, 5.0, 10.0 mg/mL for 48 h; C: Western blot detection of PPP related protein expression in tumor tissues of mice in different treatment groups; D: IHC detection of the expression of Ki-67, Bcl-2, G6PD and 6PGD in tumor tissues (Scale bar=200 μm). *P＜0.05;***P＜0.001. PPP: pentose phosphate pathway; IHC: immunohistochemistry; Bcl-2: B-cell lymphoma-2; G6PD: 6-phosphate glucose dehydrogenase;6PGD: 6-phosphogluconate dehydrogenase.

3 討論

根據(jù)臨床發(fā)現(xiàn)，NCHF-01具有抗NSCLC的作用，能夠抑制肺部腫瘤的生長(zhǎng)，并幫助血液指數(shù)恢復(fù)正常。然而，其治療肺癌的作用機(jī)制仍然是未知的。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，我們驗(yàn)證該中藥配方NCHF-01具有抗NSCLC能力。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得知，氧化應(yīng)激以及碳代謝在NCHF-01的抗NSCLC中可能發(fā)揮重要作用。

一般來(lái)說(shuō)，適量的ROS會(huì)激活許多信號(hào)通路，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生增殖和癌變。細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS通過(guò)對(duì)細(xì)胞大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等造成損傷而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-14]。ROS可以減少促凋亡因子Bax的泛素化，增加抗凋亡因子Bcl-2的泛素化，降低Bcl-2與Bax的比例[15-17]。因此，增加ROS的積累以特異性殺傷癌細(xì)胞和清除異常升高的ROS以防止癌癥形成都是有益的抗癌策略。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，NCHF-01治療NSCLC與氧化應(yīng)激和中樞碳代謝有關(guān)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，NCHF-01能夠促進(jìn)細(xì)胞中ROS水平的升高。接下來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)使用5 mmol/L ROS清除劑NAC處理可以減少NCHF-01誘導(dǎo)的ROS增加并抑制NSCLC細(xì)胞凋亡，表明ROS可能有助于NCHF-01誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞凋亡。

當(dāng)產(chǎn)生ROS的過(guò)程和減少ROS的過(guò)程不平衡時(shí)，ROS水平會(huì)增加。低水平的ROS實(shí)際上促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[18,19]。然而，異常增加的ROS可以與線(xiàn)粒體蛋白相互作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。NADPH是一種主要的細(xì)胞內(nèi)氫供體，對(duì)清除ROS至關(guān)重要。NADPH能夠參與細(xì)胞合成代謝反應(yīng)和氧化還原平衡，癌細(xì)胞增加其N(xiāo)ADPH水平免受ROS損害[20,21]，而細(xì)胞質(zhì)中的NADPH主要由G6PD和6PGD通過(guò)PPP途徑產(chǎn)生[22]。腫瘤細(xì)胞的代謝被重新編程，以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的抗氧化防御和生物合成[23,24]，使PPP成為滿(mǎn)足細(xì)胞抗氧化防御和生物合成需求的關(guān)鍵葡萄糖代謝途徑[25]。G6PD是PPP第一步中的關(guān)鍵酶，為細(xì)胞提供NADPH，用于還原性抗氧化防御和生物合成。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NCHF-01降低G6PD和6PGD的蛋白表達(dá)和酶活性。因此，NCHF-01對(duì)PPP的抑制減少了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和NADPH的生成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，有助于NCHF-01促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的凋亡。

我們的研究表明，NCHF-01可能是一種ROS誘導(dǎo)劑，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡。大規(guī)模、多中心合作的臨床試驗(yàn)在未來(lái)對(duì)優(yōu)化NCHF-01在臨床上的應(yīng)用潛力至關(guān)重要。由于時(shí)間限制，尚未分析NCHF-01的哪種活性成分會(huì)影響NSCLC的PPP調(diào)節(jié)。然而，通過(guò)對(duì)這些物質(zhì)的附加和協(xié)同作用的額外研究，這一結(jié)果將得到改善。在這項(xiàng)研究中，結(jié)果顯示，NCHF-01對(duì)NSCLC細(xì)胞和LLC荷瘤小鼠具有明顯的治療效果。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)NCHF-01的藥理作用受到ROS水平和PPP途徑的影響。因此，我們的研究為進(jìn)一步利用NCHF-01治療NSCLC提供了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

倫理聲明

本研究得到了動(dòng)物保護(hù)機(jī)構(gòu)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)（Certificate No.IACU-NYLAC-2022-029）。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Cheng C and Wu W performed the experiments, analyzed the data and wrote the draft manuscript. Yu JX and Yuan DD carried out data curation. Li L and Wang YJ provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.