郝文杰，楊文明，魏濤華，唐露露，楊 悅，錢南南，楊玉龍

（1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230038； 3.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038）

肝豆狀核變性，又稱Wilson 病，是銅代謝障礙導致以大腦基底節(jié)變性和肝功能損害為主要表現的常染色體隱性遺傳性疾病，臨床上以進行性加重的肝損害、神經系統(tǒng)癥狀等為主要特征［1］。研究發(fā)現該病不僅存在銅代謝障礙，其鐵代謝障礙在發(fā)病機制中也起著重要作用［2］。由于肝臟是金屬離子代謝的主要靶器官，肝損害為Wilson 病患者最常見的癥狀，暴發(fā)性肝衰竭是最常見的致死因素［3］。進行早期干預對保護患者肝損害具有重要的臨床意義。據相關研究報道，鐵死亡在Wilson 病肝損害中具有起到關鍵作用［4］。鐵死亡是一種被公認的以鐵依賴性脂質過氧化為特征的細胞調控死亡形式［5］。

肝豆扶木湯是楊文明教授根據新安醫(yī)學固本培元的理論，針對Wilson 病創(chuàng)制的專方，全方行滋補肝腎、豁痰化瘀之功。課題組前期研究發(fā)現，肝豆扶木湯能有效改善Wilson 病患者和模型鼠的肝功能及肝纖維化程度，發(fā)揮肝保護作用［6］，且其作用機制可能與調控轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1） /Smad［7］、活性氧（reactive oxygen species，ROS） /Jun 氨基末端激酶，Jun Nterminal kinase，JNK）［8］信號通路有關，但與鐵死亡相關作用機制尚待深入研究。故本研究借助生物信息學系統(tǒng)預測肝豆扶木湯干預鐵死亡的活性成分、潛在靶點，并結合體外實驗進行初步驗證。

1 材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞HepG2 （貨號CL-0103） 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞生長至70% ～80%時開始傳代，用于后續(xù)實驗。

1.2 藥物 肝豆扶木湯由制何首烏4 g、枸杞子20 g、三七3 g、土茯苓12 g、白芍15 g、郁金12 g、柴胡12 g 組成，均購自安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，符合2020 年版《中國藥典》 標準，加10 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后轉文火再煎30 min，濾過，再加8 倍量水重復以上步驟，將2次水煎液混勻，紗布過濾后于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至0.3 g/mL，冷凍干燥得凍干粉17.5 g，得率為22.4%，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。肝豆扶木湯凍干粉溶液用無菌PBS 制成1 g/L （1 g 凍干粉相當于4.46 g 生藥量） 母液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。

1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WH0022C021）； Erastin 試劑（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號C13632104）； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （日本TaKaRa 公司，批號AJ51485A）； CCK8 檢測試劑盒、2 × SYBR Green qPCR Master Mix （High ROX） （武漢賽維爾生物科技有限公司，批號CR2112050、LT202201）； 山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG （上海張沈生物醫(yī)藥科技有限公司，批號142637、139931）； 溶質載體家族7 成員11 （solute carrier family 7 member 11，SLC7A11） 抗體、谷胱甘肽過氧化酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 抗體、P53 抗體 （美國Affinity 公司，批號84a5792、78p5366、23y9837）； RIPA 裂解液（強）（合肥白鯊生物科技有限公司，批號69128033）；PAGE 膠促凝劑 （北京索萊寶科技有限公司，批號1020F024）； PVDF 膜 （ 美國 Millipore 公司，批號R8KA7385）； 胰酶、Western 一抗二抗去除液（上海碧云天生物技術有限公司，批號C0201、051418180626）； ECL 超敏發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號S1257444）； 丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH） 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20220518、20220525）； 活性氧（ROS） 檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號BB20081）。

1.4 儀器 3111 型恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 超凈工作臺（上海力辰儀器科技有限公司）； CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）； 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）； 電泳儀、轉膜儀（上海天能科技有限公司）； 自動曝光儀（上海培清科技有限公司）；酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

2 方法

2.1 生物信息學

2.1.1 活性成分篩選 利用BATMAN-TCM 數據庫（http： / /bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/） 檢索肝豆扶木湯方中何首烏、枸杞子、三七、柴胡、白芍、土茯苓、郁金7 味中藥的化學成分，以靶點預測的得分值（Score cutoff） ≥20、靶點分析P＜0.05 為標準［9］，篩選出具有較高活性的成分和潛在靶點。利用 PubChem 數據庫（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 下載對應的活性成分信息，以3D 結構保存為SDF 格式，用于分子對接。

2.1.2 鐵死亡靶點篩選 在GeneCards （https： / /www.genecards.org/）、OMIM （http： / /www.omim.org/）、TTD數據庫 （http： / /db.idrblab.net/ttd/） 中輸入檢索詞“Ferroptosis”，收集鐵死亡相關的非重復靶基因。將鐵死亡相關靶點的相關度值（Relevance score） 定義為≥3，與藥物活性成分作用潛在靶點進行匹配，最終獲得肝豆扶木湯干預鐵死亡的作用靶點，用于后續(xù)分析。

2.1.3 分子對接 選取匹配后篩選得到的核心靶蛋白作為核心受體蛋白，在PDB 數據庫（https： / /www.rcsb.org）中輸入靶蛋白名稱，設置種屬為“Homosapiens”，選取分辨率高的靶蛋白三維結構。使用CB-Docking 數據庫［10］（http： / /clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php） 將篩選出來的受體與配體進行在線對接處理，比較對接后的Vina score 值，再進行對比分析。

2.2 細胞實驗

2.2.1 Erastin 誘導劑最佳作用劑量和時間篩選 將HepG2細胞分為空白組、Erastin 誘導劑組，空白組只加DMEM 培養(yǎng)基，Erastin 誘導劑組分別加入含10、20、30、40 μmol/L Erastin 的DMEM 培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯免疫檢測儀上450 nm 波長處測量各孔吸光度。

2.2.2 肝豆扶木湯凍干粉最佳作用劑量和時間篩選 將HepG2 細胞分為空白組、肝豆扶木湯凍干粉組，空白組只加DMEM 培養(yǎng)基，肝豆扶木湯凍干粉組分別加入含5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 凍干粉和最佳作用濃度Erastin 的DMEM 培養(yǎng)基，在Erastin 最佳作用時間點換液3 次后棄培養(yǎng)液，每孔加10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯免疫檢測儀上450 nm 波長處測量各孔吸光度。

2.2.3 分組及給藥 實驗分為空白組 （HepG2 細胞＋PBS）、模型組（HepG2 細胞＋Erastin 誘導劑） 和肝豆扶木湯低、中、高劑量組（HepG2 細胞＋Erastin 誘導劑＋160、320、640 μg/mL 肝豆扶木湯凍干粉）。取對數生長期HepG2 細胞，接種于平底培養(yǎng)板，每組設3 個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，模型組加入最佳濃度的Erastin 誘導劑，肝豆扶木湯組同時加入最佳濃度的Erastin 誘導劑和不同質量濃度的凍干粉，空白組加入等量PBS 溶液，處理至Erastin 誘導劑最佳時間點時進行換液，繼續(xù)處理至凍干粉最佳作用時間后檢測相關指標。

2.2.4 GSH、MDA 水平檢測 取對數生長期HepG2 細胞，接種于6 孔板，按“2.2.3” 項下方法處理，按照相關試劑盒說明書操作步驟檢測GSH、MDA 水平。

2.2.5 ROS 水平檢測 取對數生長期HepG2 細胞，接種于6 孔板，按“2.2.3” 項下方法處理，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min，其間顛倒混勻4 ～5 次，使細胞與探針充分接觸，再用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，除去多余的DCFH-DA，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強度，NovoExpress 軟件分析并計算熒光強度值。

2.2.6 Western blot 法檢測細胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達 按“2.2.3” 項下方法處理細胞，提取各組細胞總蛋白，經電泳、轉膜、封閉后，分別加P53 （1 ∶500）、SLC7A11 （1 ∶500）、GPX4 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶500）一抗，4 ℃孵育過夜，加相應二抗繼續(xù)孵育2 h，顯影，用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.2.7 RT-qPCR 法檢測細胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA表達 按“2.2.3” 項下方法處理細胞，提取RNA，逆轉錄為cDNA，然后進行PCR 擴增，2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，組間多重比較采用LSD 法； 反之，采用Kruskal-Wallis 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 生物信息學

3.1.1 活性成分及作用靶點 以Score cutoff≥20、P＜0.05為條件進行檢索，得到肝豆扶木湯方中化學成分226 種，其中何首烏16 種，枸杞子46 種，白芍18 種，三七51 種，土茯苓13 種，柴胡63 種，郁金18 種。以OB ≥30%、DL≥0.18 為條件，篩選得到214 種化學成分。

3.1.2 作用靶點篩選 共得到肝豆扶木湯活性成分潛在作用靶點10 463 個，其中何首烏298 個，枸杞子2 077 個，白芍300 個，三七3 964 個，土茯苓367 個，柴胡1 845個，郁金1 612 個，剔除重復部分，得到潛在作用靶點1 741個。利用GeneCards 數據庫獲得274 個與鐵死亡相關的靶基因，相關度值（Relevance score） 定義為≥3，最終獲得與鐵死亡相關的靶基因23 個。將藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，最終收集11 個共同作用靶點用于分子對接分析，見圖1。

圖1 肝豆扶木湯活性成分靶點與鐵死亡靶點的韋恩圖

3.1.3 分子對接 將11 個鐵死亡核心靶蛋白與對應的肝豆扶木湯活性成分進行分子對接，并根據Vina score 值繪制熱圖（圖2），其中Vina score＜-7.0，表明靶蛋白與活性成分結合性好，而且Vina score 值越小，兩者結合能力越強［11］。由此可知，肝豆扶木湯的主要活性成分維生素B2、抗壞血酸、γ-氨基丁酸、尼克酸、維生素C、核黃素、芍藥二酮、鬼傘毒素、苯乙酮、3，4-二甲基苯甲酸、鄰苯二酸辛酯、白芷素、壬烯酸、亞麻酸、姜黃酮、莪術二酮、姜黃烯、香芹酮與鐵死亡核心靶點SLC7A11 蛋白均有很強的結合能力，再繪制對接模式圖（圖3）。此外，維生素B2、核黃素、芍藥二酮、白芷素、莪術二酮與TP53、ACSL4、ACSL4、VDAC2、VDAC3、ALOX15、PRKAA1、MDM2 靶蛋白均有良好的結合能力。

圖2 肝豆扶木湯活性成分與鐵死亡核心靶蛋白分子對接熱圖

圖3 肝豆扶木湯活性成分與SLC7A11 蛋白對接模式圖

3.2 細胞實驗

3.2.1 Erastin 誘導劑最佳作用劑量、時間篩選 與空白組比較，10 μmol/L Erastin 誘導劑作用12、24、36、48 h 時細胞活性均高于50%，20 μmol/L Erastin 誘導劑作用12、24 h時細胞活性均高于50%，30 μmol/L Erastin 誘導劑作用36、48 h 時細胞活性均低于50%，40 μmol/L Erastin 誘導劑作用12、24、36、48 h 時細胞活性均低于50%，故選擇30 μmol/L、24 h 分別作為Erastin 誘導劑最佳作用劑量、時間，見表2。

表2 Erastin 誘導劑不同作用劑量、時間下細胞相對活性（±s，n＝3）

表2 Erastin 誘導劑不同作用劑量、時間下細胞相對活性（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，*P＜0.05。

組別劑量/（μmol·L-1）12 h24 h36 h48 h空白組01.002±0.0111.003±0.0221.014±0.0161.001±0.021 Erastin 誘導劑組100.879±0.041*0.825±0.029*0.783±0.027*0.692±0.063*200.688±0.017*0.649±0.044*0.509±0.040*0.469±0.014*300.557±0.060*0.496±0.029*0.282±0.011*0.249±0.018*400.287±0.044*0.214±0.021*0.176±0.014*0.146±0.012*

3.2.2 肝豆扶木湯凍干粉最佳作用劑量、時間篩選 與空白組比較，5 μg/mL 凍干粉作用48、72 h 時，10、20、40、80 μg/mL 凍干粉作用24、48 h 時，以及160 μg/mL 凍干粉作用24 h 時細胞活性降低（P＜0.05）； 40、80、160 μg/mL凍干粉作用72 h 時，320 μg/mL 凍干粉作用48、72 h 時，以及640 μg/mL 凍干粉作用24、48、72 h 時細胞活性升高（P＜0.05），故選擇160、320、640 μg/mL 分別作為低、中、高劑量，見表3。

表3 肝豆扶木湯凍干粉不同作用劑量、時間下細胞相對活性（±s，n＝3）

表3 肝豆扶木湯凍干粉不同作用劑量、時間下細胞相對活性（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，*P＜0.05。

組別劑量/（μg·mL-1）24 h48 h72 h空白組01.003±0.0221.001±0.0210.999±0.013肝豆扶木湯凍干粉組50.984±0.0140.824±0.033*0.914±0.072*100.935±0.010*0.846±0.068*0.991±0.048 200.867±0.013*0.853±0.078*1.037±0.049 400.822±0.008*0.917±0.034*1.084±0.061*800.787±0.018*0.950±0.066*1.129±0.042*1600.920±0.014*1.075±0.0341.174±0.01*3201.051±0.0221.286±0.027*1.305±0.009*6401.170±0.061*1.330±0.068*1.364±0.029*

3.2.3 肝豆扶木湯對Erastin 誘導HepG2 細胞GSH、MDA、ROS 水平的影響 與空白組比較，模型組細胞GSH 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01），ROS 熒光強度增強（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯各劑量組細胞GSH 水平升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01），ROS 熒光強度減弱（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖4。結果表明，肝豆扶木湯能提高HepG2 細胞GSH 水平，降低MDA、ROS 水平，提高抗氧化能力，抑制HepG2 細胞的氧化應激損傷。

圖4 肝豆扶木湯對HepG2 細胞GSH、MDA、ROS 水平的影響（±s，n＝3）

3.2.4 肝豆扶木湯對Erastin 誘導HepG2 細胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組細胞P53 蛋白表達升高（P＜0.01），SLC7A11 和GPX4 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯中、高劑量組細胞P53 蛋白表達降低（P＜0.01），肝豆扶木湯各劑量組細胞SLC7A11、GPX4 蛋白表達升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖5。結果表明，肝豆扶木湯抑制HepG2細胞鐵死亡的作用可能與其下調P53 蛋白表達，上調SLC7A11、GPX4 蛋白表達有關。

圖5 肝豆扶木湯對HepG2 細胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.2.5 肝豆扶木湯對Erastin 誘導HepG2 細胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組細胞P53 mRNA 表達升高（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯各劑量組細胞P53 mRNA 表達降低（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表達升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖6。結果表明，肝豆扶木湯抑制HepG2 細胞鐵死亡的作用與其下調P53 mRNA 表達，上調SLC7A11、GPX4 mRNA 表達有關。

圖6 肝豆扶木湯對HepG2 細胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

肝損害幾乎是每一個Wilson 病患者都存在的癥狀，如不能及時有效地進行干預，易出現暴發(fā)性肝衰竭，甚至導致死亡［3］。如能早期有效干預，則能顯著延緩肝損害的病理進程［12］。近年來，國內外學者對Wilson 病肝損害的分子機制研究取得了一定的進展［13-14］。Wilson 病患者存在鐵代謝障礙，鐵離子的沉積在疾病的進展中起到重要作用［15-16］。分子對接技術是通過計算機模擬化合物與蛋白質受體匹配的模式和親和力，是現代藥物探索和新藥發(fā)現的重要工具［17］。故本研究將肝豆扶木湯的活性成分與鐵死亡相關蛋白進行分子對接，結果顯示鐵死亡關鍵蛋白SLC7A11 與肝豆扶木湯的活性成分具有良好的結合能力。

肝豆扶木湯是針對Wilson 病肝損害的病機特點創(chuàng)立而成［18］，由枸杞子、白芍、制何首烏、三七粉、土茯苓、柴胡、郁金組成，課題組前期臨床和基礎實驗研究證實該方對Wilson 病肝損害具有保護作用［19］?，F代藥理表明，肝豆扶木湯的活性成分具有抗氧化等作用［20-21］。本研究采用Erastin 誘導HepG2 細胞構建鐵死亡模型，以肝豆扶木湯干預，發(fā)現肝豆扶木湯能提高HepG2 細胞的抗氧化能力，對細胞具有保護作用。細胞內ROS、MDA 升高及GSH 消耗是氧化應激的標志，也是鐵死亡發(fā)生的標志之一。本研究結果顯示，HepG2 細胞經Erastin 誘導后，其ROS 和MDA 水平升高，GSH 水平降低，說明Erastin 誘導HepG2 細胞發(fā)生氧化應激； 而肝豆扶木湯干預降低了ROS 和MDA 水平，提高了GSH 水平，說明肝豆扶木湯具有抗氧化的作用。

SLC7A11 可促進細胞對胱氨酸的攝取和GSH 合成，提高抗氧化能力，保護細胞免受鐵死亡［22］。P53 可以抑制SLC7A11 表達，導致GSH 合成受損并增加消耗，促進鐵死亡［23］。GPX4 是一種抗氧化酶，能降低ROS 水平來抑制鐵死亡的發(fā)生，而GSH 缺失可使GPX4 失活［24］。抑制GPX4活性可導致脂質過氧化物積累發(fā)生鐵死亡［25］。當SLC7A11表達被抑制，胱氨酸吸收減少，GSH 合成被影響，導致GPX 活性降低，抗氧化能力下降，ROS 積聚，最終導致鐵死亡［26］。本研究采用Erastin 誘導處理HepG2 細胞后，其P53 蛋白和mRNA 表達升高，SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表達降低，說明Erastin 處理后的HepG2 細胞發(fā)生了鐵死亡； 而肝豆扶木湯干預后下調了P53 蛋白和mRNA 表達，上調了SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表達，說明肝豆扶木湯能夠抑制鐵死亡，且可能通過SLC7A11/GPX4 軸對細胞產生保護作用。

綜上所述，肝豆扶木湯能通過降低ROS 和MDA 水平，提高GSH 水平，下調P53 表達，上調SLC7A11 和GPX4 表達來減輕HepG2 細胞的鐵死亡，其作用可能是通過調控SLC7A11/GPX4 軸實現的。本研究為臨床運用肝豆扶木湯治療Wilson 病患者肝損害提供科學證據。