李紅英，張會(huì)軍，王軍，穆秀娥，李紅方

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心臟外科，石家莊 050031）

急性心肌梗死 （acute myocardial infarction，AMI）是一種常見(jiàn)的心血管疾病，死亡率高，及時(shí)、有效的再灌注是減少AMI后心肌損傷的重要治療選擇［1］。研究［2］報(bào)道，心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激參與了AMI的發(fā)病機(jī)制。心肌缺氧/復(fù)氧 （hypoxia/reoxygenation，H/R） 損傷與心血管外科手術(shù)高度相關(guān)［3］，預(yù)防H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡可能為AMI提供新的治療策略。越來(lái)越多的研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，lncRNA） 在包括AMI在內(nèi)的心血管疾病的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。核內(nèi)小RNA宿主基因1 （small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1） 作為一種lncRNA，已有研究［4］顯示，下調(diào)SNHG1可以抑制心肌缺血/再灌注損傷小鼠的心肌細(xì)胞凋亡。但其具體分子機(jī)制尚不完全明確。研究［5］顯示，過(guò)表達(dá)miR-145通過(guò)靶向下調(diào)程序性細(xì)胞死亡因子4 （programmed cell death 4，PDCD4） 抑制H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。生物信息學(xué)分析顯示，SNHG1與miR-145-5p存在靶向關(guān)系。而SNHG1能否通過(guò)調(diào)控miR-145-5p/PDCD4軸影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡尚不明確。因此，本研究主要探討了SNHG1對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自浙江美森細(xì)胞科技有限公司。

1.1.2 主要試劑：SNHG1小干擾RNA （si-SNHG1） 及其陰性對(duì)照 （si-NC）、miR-145-5p模擬物 （miR-145-5p mimic） 及其陰性對(duì)照 （mimic NC）、miR-145-5p抑制物 （miR-145-5p inhibitor） 及其陰性對(duì)照 （inhibitor NC），均購(gòu)自賽默飛世爾科技 （中國(guó)） 有限公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)自上海繼和生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒，購(gòu)自無(wú)錫云萃生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 試劑盒，購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；兔源一抗PDCD4、caspase 3、Bcl-2、Bax、GAPDH及過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、H/R細(xì)胞模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組：將H9c2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2。

H/R細(xì)胞模型的構(gòu)建［6］：將H9c2細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱 （37 ℃、94% N2、1% O2、5% CO2） 中培養(yǎng)24 h，再在復(fù)氧培養(yǎng)箱 （37 ℃、95%空氣、5% CO2） 中復(fù)氧1 h。

將H9c2細(xì)胞分為H/R組、si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic組、si-SNHG1+inhibitor NC組、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組。上述各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染處理48 h后，再進(jìn)行缺氧24 h、復(fù)氧1 h。si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic 組H9c2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-SNHG1、mimic NC、miR-145-5p mimic，si-SNHG1+inhibitor NC組H9c2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染si-SNHG1和inhibitor NC，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染si-SNHG1和miR-145-5p inhibitor。同時(shí)取正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞作為對(duì)照組 （NC組）。上述處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR （real-time quantitative PCR，qRTPCR） 檢測(cè)細(xì)胞中SNHG1、miR-145-5p表達(dá)：使用TRIzol試劑提取H9c2細(xì)胞中的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行定量PCR。GAPDH、U6分別作為SNHG1、miR-145-5p內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG1、miR-145-5p相對(duì)表達(dá)量。引物序列：GAPDH，正向5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，反向 5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；SNHG1，正向5’-AACTTCCCATAACTCCACTTC-3’，反向5’-ACAACCAACACAGCAACAC-3’；miR-145-5p，正向5’-TCGGCAGGGTCCAGTTTTCCCA-3’，反向5’-CTCAAC TGGTGTCGTGGA-3’；U6，正向5’-CTCGCT TCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖：將各組H9c2細(xì)胞以1×104/孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h后，將10 μL CCK-8 試劑添加到96孔板的每個(gè)孔中，將96孔板在37 ℃下孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取光密度值 （optical density，OD）。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡：將各組H9c2細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，重懸于1×結(jié)合緩沖液中，然后在室溫下依次與 5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶在黑暗條件下孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 試劑盒檢測(cè)H9c2細(xì)胞中SOD活性、MDA含量：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)H9c2細(xì)胞中SOD活性、MDA含量。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)H9c2細(xì)胞中PDCD4、Bcl-2、caspase 3、Bax蛋白表達(dá)：RIPA裂解緩沖液裂解H9c2細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜與一抗PDCD4 （1 ∶2 000）、Bcl-2 （1 ∶2 000）、caspase 3 （1 ∶2 000）、Bax （1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶2 000） 在4 ℃下孵育過(guò)夜。隨后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗 （1 ∶1 000） 在室溫下孵育 1 h，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，加入ECL試劑，觀察蛋白質(zhì)條帶，使用ImageJ 分析蛋白灰度值。1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：分別構(gòu)建SNHG1野生型質(zhì)粒 （SNHG1-WT） 和突變型質(zhì)粒 （SNHG1-MUT），將SNHG1-WT和SNHG1-MUT分別與mimic NC或miR-145-5pmimic共轉(zhuǎn)染于H9c2細(xì)胞，48 h后觀察熒光素酶活性變化。

分別構(gòu)建PDCD4野生型質(zhì)粒 （PDCD4-WT） 和突變型質(zhì)粒 （PDCD4-MUT），將PDCD4-WT和PDCD4-MUT分別與mimic NC或miR-145-5pmimic共轉(zhuǎn)染于H9c2細(xì)胞，48 h后觀察熒光素酶活性變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x-±s表示，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步2組數(shù)據(jù)的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組H9c2細(xì)胞中SNHG1、miR-145-5p、PDCD4蛋白表達(dá)比較

與NC組比較，H/R組H9c2細(xì)胞中SNHG1、PDCD4蛋白表達(dá)升高，miR-145-5p表達(dá)降低 （P< 0.05）。與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細(xì)胞中SNHG1、PDCD4蛋白表達(dá)降低，miR-145-5p表達(dá)升高 （P<0.05）。與H/R組、mimic NC 組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細(xì)胞中SNHG1表達(dá)變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P> 0.05），miR-145-5p表達(dá)升高，PDCD4蛋白表達(dá)降低 （P< 0.05）。與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞中SNHG1表達(dá)變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P> 0.05），miR-145-5p表達(dá)降低，PDCD4蛋白表達(dá)升高 （P<0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組細(xì)胞中SNHG1、miR-145-5p、PDCD4蛋白表達(dá)比較 （n = 6）Tab.1 Cellular expressions of SNHG1，miR-145-5p，and PDCD4 protein by study group （n = 6）

圖1 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)Fig.1 PDCD4 protein expression detected by Western blotting in each study group

2.2 各組H9c2細(xì)胞增殖能力比較

NC組、H/R組、si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic組、si-SNHG1+inhibitor NC組、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞OD450值分別為0.87±0.07、0.31±0.02、0.29±0.01、0.69±0.05、0.30±0.03、0.72±0.06、0.70±0.06、0.38±0.03。與NC組比較，H/R組H9c2細(xì)胞OD450值降低 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細(xì)胞OD450值升高 （P< 0.05）；與H/R組、mimic NC組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細(xì)胞OD450值升高 （P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞OD450值降低 （P<0.05）。

2.3 各組H9c2細(xì)胞凋亡能力比較

NC組、H/R組、si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic組、si-SNHG1+inhibitor NC組、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞凋亡率分別為 （3.79±0.14） %、 （18.86±1.15） %、 （18.72±1.12） %、（6.78±0.34） %、 （18.80±1.07） %、 （5.49±0.26） %、（6.69±0.29） %、 （13.34±1.17） %。與NC組比較，H/R組H9c2細(xì)胞凋亡率升高 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細(xì)胞凋亡率降低 （P< 0.05）；與H/R組、mimic NC組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細(xì)胞凋亡率降低 （P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞凋亡率升高 （P< 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡Fig.2 H9c2 cell apoptosis detected by flow cytometry

2.4 各組H9c2細(xì)胞中SOD活性、MDA含量比較

與NC組比較，H/R組H9c2細(xì)胞中SOD活性降低，MDA含量升高 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細(xì)胞中SOD活性升高，MDA含量降低 （P< 0.05）；與H/R組、mimic NC 組比較，miR-145-5p mimic 組H9c2細(xì)胞中SOD活性升高，MDA含量降低（P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞中SOD活性降低，MDA含量升高 （P< 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組H9c2細(xì)胞中SOD活性、MDA含量比較 （n = 6）Tab.2 SOD activity and MDA content of H9c2 cells by study group （n = 6）

2.5 各組H9c2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、caspase 3蛋白表達(dá)比較

與NC組比較，H/R組H9c2細(xì)胞中Bax、caspase 3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細(xì)胞中Bax、caspase 3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高 （P<0.05）；與H/R組、mimic NC 組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細(xì)胞中Bax、caspase 3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高 （P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細(xì)胞中Bax、caspase 3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低 （P< 0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組H9c2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、caspase 3蛋白表達(dá)比較 （n = 6）Tab.3 Bax，Bcl-2，and caspase 3 protein expression of H9c2 cells by study group （n = 6）

2.6 SNHG1靶向調(diào)控miR-145-5p /PDCD4軸

在Starbase （http：//starbase.sysu.edu.cn/）、Target Scan （https：//www.targetscan.org/vert_72/） 網(wǎng)站分別預(yù)測(cè)lncRNA SNHG1與miR-145-5p、miR-145-5p與PDCD4的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。與mimic NC和 SNHG1-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-145-5p mimic和 SNHG1-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低 （分別為1.05±0.12和0.23±0.01，P< 0.05）；與mimic NC和SNHG1-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-145-5p mimic和 SNHG1-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無(wú)顯著變化 （分別為1.03±0.11和1.02±0.10，P> 0.05）；與mimic NC和PDCD4-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-145-5p mimic和PDCD4-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低 （分別為1.03±0.10和0.29±0.02，P< 0.05）；與mimic NC和PDCD4-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-145-5p mimic和PDCD4-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無(wú)顯著變化 （分別為0.97±0.08和1.01±0.09，P> 0.05）。

圖4 Starbase、TargetScan網(wǎng)站分別預(yù)測(cè)lncRNA SNHG1與miR-145-5p、miR-145-5p與PDCD4的結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Binding sites of lncRNA SNHG1 and miR-145-5p as well as of miR-145-5p and PDCD4 predicted at Starbase and TargetScan websites

3 討論

AMI是冠狀動(dòng)脈急性閉塞引起的心肌損傷，嚴(yán)重威脅人類生命健康。盡管 AMI 的診斷和治療在過(guò)去幾十年中有所進(jìn)展，但全世界其發(fā)病率和死亡率仍在上升［7］。因此，早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)對(duì)于減少心肌損傷和改善患者預(yù)后是必要的。

SNHG1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，研究［8］報(bào)道，沉默SNHG1可抑制膿毒癥小鼠心肌損傷；敲低SNHG1可抑制脂多糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡［9］。以上研究表明，SNHG1在調(diào)控細(xì)胞凋亡和心肌損傷方面具有重要作用。SOD和MDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物；Bax、Bcl-2、caspase 3是常用于評(píng)估細(xì)胞凋亡的蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax、caspase 3是促凋亡效應(yīng)蛋白。本研究顯示，SNHG1在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中高表達(dá)，沉默SNHG1可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，提示SNHG1可能是治療AMI的潛在有效靶點(diǎn)。

lncRNA可通過(guò)海綿化微RNA （microRNA，miRNA）發(fā)揮作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)SNHG1與miR-145-5p 存在靶向關(guān)系。miR-145-5p作為一種miRNA，已有研究報(bào)道，下調(diào)miR-145-5p可加重心肌梗死小鼠心肌損傷［10］，過(guò)表達(dá)miR-145-5p可減輕心肌缺血/再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡［11］。以上研究表明，miR-145-5p在AMI進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，本研究顯示，miR-145-5p在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-145-5p可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)沉默SNHG1可上調(diào)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)，推測(cè)沉默SNHG1可能通過(guò)上調(diào)miR-145-5p抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究在沉默SNHG1的基礎(chǔ)上應(yīng)用miR-145-5p inhibitor干預(yù)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-145-5p inhibitor減弱了沉默SNHG1對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響。本研究證實(shí)了這一推測(cè)，即沉默SNHG1可能通過(guò)上調(diào)miR-145-5p抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

miRNA是一類非編碼RNA，通過(guò)與其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。本研究證實(shí)了PDCD4為miR-145-5p的靶基因。PDCD4基因定位于染色體10q24上［12］。研究顯示，沉默PDCD4能夠減弱H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷［13］，抑制PDCD4可抑制阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡［14］。以上研究表明，PDCD4在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。本研究顯示，PDCD4蛋白在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中高表達(dá)，沉默SNHG1后，H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)升高，而PDCD4蛋白表達(dá)降低，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了SNHG1與miR-145-5p、miR-145-5p與PDCD4存在靶向關(guān)系。證實(shí)了沉默SNHG1可能通過(guò)調(diào)控miR-145-5p/PDCD4軸，抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

綜上所述，沉默SNHG1可能通過(guò)上調(diào)miR-145-5p來(lái)抑制PDCD4表達(dá)，進(jìn)而抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。本研究尚存在不足之處，僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究SNHG1對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響，后期將進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)研究。