張 燕，于官正，張 鈺，涂 星，3，黃 琪，邊卓陽，陳亞君

（1.長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院腫瘤科，湖北 荊州 434023；2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心，湖北 恩施 445000）

線粒體自噬（mitochondrial autophagy）是一種選擇性自噬，通過自噬選擇性地去除或降解受損線粒體的過程，其對維持細(xì)胞功能具有重要作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2]，線粒體自噬與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種臨床疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，通過對線粒體自噬進(jìn)行干預(yù)，可能會具有治療作用。二氫楊梅素（dihydromyrucetin，DMY）是一種多酚羥基二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、維持血糖穩(wěn)態(tài)、改善認(rèn)知障礙等藥理作用，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病有治療或保護(hù)作用[3]。研究表明[4，5]，DMY 可通過激活自噬預(yù)防糖尿病心肌病、改善肝纖維化等。但DMY 是否可以通過多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)線粒體自噬尚不清楚。故，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討DMY 對線粒體自噬的作用機(jī)制，為其提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 化合物靶點(diǎn)的預(yù)測和疾病靶點(diǎn)的篩選 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索“Dihydromyricetin”的SMILES號，將其輸入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，以“Homo sapiens”為設(shè)置條件，進(jìn)行化合物靶點(diǎn)的預(yù)測，刪除預(yù)測結(jié)果中的重復(fù)靶點(diǎn)，并以“Probability”值＞0 為篩選條件，篩選后的靶點(diǎn)為最終的靶點(diǎn)。以“mitophagy”為檢索詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）和NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行疾病靶點(diǎn)的篩選，刪除重復(fù)值，合并2個疾病數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)。

1.2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 利用R 4.0.2 軟件對得到化合物與疾病靶點(diǎn)取交集得到化合物疾病的共有靶點(diǎn)并繪制韋恩圖；將共有靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，最小相互作用閾值設(shè)定“custom value”（＞0.40），得到PPI 網(wǎng)絡(luò)；并對PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析及構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 運(yùn)用R 4.1.3 軟件及“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”等安裝包對共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能與KEGG 富集通路分析，設(shè)置P＜0.05；并使用在線作圖平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對其進(jìn)行可視化處理。使用Cytoscape3.7.2 軟件對共有靶點(diǎn)和KEGG 通路富集的結(jié)果進(jìn)行“化合物-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.4 分子對接 將DMY 與15 個作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫、Chem Bio3D Ultra 14.0 軟件獲得DMY 的3D 結(jié)構(gòu)；利用PDB 數(shù)據(jù)庫下載15 個靶點(diǎn)蛋白，利用PyMOL 2.4.0 軟件和Auto Dock Tools 1.5.6、Autodock Vina 軟件對作用靶點(diǎn)和DMY 進(jìn)行常規(guī)處理及分子對接。

2 結(jié)果

2.1 化合物預(yù)測和疾病靶點(diǎn)的篩選的結(jié)果 在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)預(yù)測得到化合物100 個靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后最終得到70 個靶點(diǎn)。GeneCards 數(shù)據(jù)庫1903 個靶點(diǎn)，NCBI 數(shù)據(jù)庫569 個靶點(diǎn)，最終疾病靶點(diǎn)為2248 個靶點(diǎn)。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果 化合物靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)取交集后得到15 個共有靶點(diǎn)，通過在String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，共有15 個節(jié)點(diǎn)，32 條邊，其中每個節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊表示不同蛋白之間的相互作用，見圖1。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析Degree值排名的結(jié)果可知HIF1A、KDR、APP 等排名較前，見表1。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?/p>

圖1 化合物疾病交集圖與PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析及“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 GO 功能富集分析主要包括生物過程、細(xì)胞組成和分子功能。在生物過程方面，共富集916 個結(jié)果，主要包括對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、金屬離子的反應(yīng)等；在細(xì)胞組成方面，共富集39 個結(jié)果，主要為膜筏、核點(diǎn)、膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)等；在分子功能方面，共富集72 個結(jié)果，主要為蛋白磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白絡(luò)氨酸激酶活性等；排名前15 的GO 功能結(jié)果見圖2。KEGG 富集通路共富集40 條通路結(jié)果，主要為癌癥蛋白聚糖、癌癥、MAPK 等信號通路，排名前10 的KEGG 富集通路結(jié)果見圖3。通過“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖可知，不同靶點(diǎn)與通路之間有著相互作用，圖中各連線表示靶點(diǎn)與通路直接的聯(lián)系，靶點(diǎn)越大表示其富集的通路越多，DMY 與線粒體自噬存在多靶點(diǎn)、多通路的相互作用關(guān)系，見圖4。

圖2 GO 功能富集分析

圖4 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 分子對接結(jié)果 將DMY 與15 個作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果表明DMY 均能與15 個靶點(diǎn)結(jié)合，其中與FGFR1 結(jié)合效果最佳，與PPARG 的結(jié)合效果次之，見表2、圖5。

表2 DMY 與15 個作用靶點(diǎn)對接結(jié)合能（kcal/mol）

圖5 分子對接圖

3 討論

本研究PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，HIF1A、KDR、APP 等靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度較高。有研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，DMY可介導(dǎo)HIF1A 的表達(dá)降低，而HIF1A 是HIF-1 的活性亞基，HIF-1 可以通過多種方面控制線粒體的活性，是缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬的中樞調(diào)劑。KDR也稱血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFA-2），屬于血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFA）的一種，DMY 在影響胃癌細(xì)胞VEGFA 表達(dá)的同時可抑制KDR 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[8，9]。此外，KDR 與可溶性蛋白聚糖相互作用，引起乳腺癌細(xì)胞線粒體自噬[10]。APP與Tau 對線粒體自噬具有協(xié)同作用，而DMY 可影響APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶力[11，12]。由此可知，HIF1A、KDR、APP 等靶點(diǎn)與DMY 和線粒體自噬密切相關(guān)。

本研究中GO 功能富集和KEGG 富集通路結(jié)果顯示，DMY 與線粒體自噬的生物過程主要富集于對氧化應(yīng)激、金屬離子等的反應(yīng)，分子功能主要富集為蛋白磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白絡(luò)氨酸激酶活性等；DMY 與線粒體自噬富集于癌癥蛋白聚糖、癌癥、MAPK 等40 條信號通路上。有研究發(fā)現(xiàn)[13，14]，氧化應(yīng)激與線粒體自噬具有相互作用，氧化應(yīng)激受損可加強(qiáng)線粒體的自噬程度，而線粒體自噬在一定程度上能調(diào)節(jié)抗氧化的水平，而DMY 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的線粒體而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，使其不受氧化應(yīng)激。另有研究表明[15，16]，腦出血時，周圍組織的氧化應(yīng)激和離子紊亂會影響活性氧含量、線粒體膜電位，從而導(dǎo)致線粒體外膜去極化，引起PINK1/Parkin 通路誘導(dǎo)的線粒體自噬；而DMY 可以與銅、鋅等多種金屬離子發(fā)生反應(yīng)，增強(qiáng)DMY 抑菌殺菌、抗氧化的作用。另外，MAPKA/AERK/CREB 信號通路可調(diào)節(jié)MFN2 相關(guān)的線粒體自噬[17]；MAPK 通路中的JNK信號通路參與調(diào)控多種細(xì)胞活動，其中JNK 蛋白激酶中的JNK2 可誘導(dǎo)線粒體自噬，保護(hù)組織器官的損傷[18]；p38MAPK/STAT3 信號通路可通過抑制線粒體自噬改善胰島素分泌[19，20]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對DMY 與線粒體自噬的機(jī)制進(jìn)行探討，預(yù)測得到DMY 可能通過作用于HIF1A、KDR、APP 等多個靶點(diǎn)，調(diào)控癌癥蛋白聚糖、癌癥、MAPK 等多信號通路，改善對氧化應(yīng)激、金屬離子等的反應(yīng)，從而參與線粒體自噬。