何燕萍, 王 昕, 李昊陽(yáng), 李 棟, 陳縉泉, 徐建華

華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200241

引 言

一種新的碳基納米材料, 熒光碳點(diǎn)(carbon dots, CDs)在這幾年引起了大家的廣泛關(guān)注。 由于其具有高穩(wěn)定性、 良好的生物相容性、 可調(diào)諧的發(fā)光波長(zhǎng)以及優(yōu)異的電子特性等[1], 有望成為一種非常有前途的光學(xué)納米探針。 目前已在光催化、 生物醫(yī)學(xué)、 傳感和細(xì)胞成像等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[2]。

碳點(diǎn)的合成一般分為兩大類。 一類方法主要是通過(guò)化學(xué)或物理手段將大塊碳材料分解為更小的碳材料, 整個(gè)過(guò)程的核心是碳原子間化學(xué)鍵的斷裂, 主要方法有電弧放電和激光燒蝕等。 另外一類方法主要是有機(jī)小分子通過(guò)熱解或碳化最終形成碳點(diǎn), 合成方法主要包括溶劑熱處理法[3]、 常規(guī)熱分解(碳化、 熱解)、 微波輔助熱解、 超聲波處理以及電化學(xué)合成等方法。 這些傳統(tǒng)的合成方法在合成過(guò)程中通常會(huì)涉及到有毒的化學(xué)試劑或有機(jī)溶劑, 在反應(yīng)過(guò)程中還需要較高的能耗、 復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)裝置以及復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作等。 從原料的選取、 時(shí)間成本以及所需能耗來(lái)看, 并不符合綠色化學(xué)的要求。 為了達(dá)到更低的經(jīng)濟(jì)以及環(huán)境成本, 開(kāi)發(fā)一種“更綠色”的方法來(lái)合成碳點(diǎn)是很有必要的。 本研究將果糖溶液與堿性溶液混合, 將它們?cè)诔叵路胖靡欢蜗鄬?duì)較短的時(shí)間后透析即可獲得碳點(diǎn)[4]。 與其他合成方法相比, 該合成辦法不需要強(qiáng)酸催化劑、 外部加熱以及額外的能量輸入, 更為簡(jiǎn)單、 節(jié)能以及高效。

目前大多數(shù)報(bào)道的碳點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)較短[1, 5], 而短波長(zhǎng)的光會(huì)破壞活細(xì)胞以及生物系統(tǒng), 特別是對(duì)于在室溫下合成的碳點(diǎn), 更難達(dá)到長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射。 因此, 在室溫下合成在長(zhǎng)波長(zhǎng)處發(fā)射的碳點(diǎn)具有重要意義, 可以為生物分子檢測(cè)提供一個(gè)更有前景的平臺(tái)。 而本研究合成的碳點(diǎn)在425 nm波長(zhǎng)的光的激發(fā)下, 最大發(fā)射峰位于535 nm, 為用于生物分子檢測(cè)的熒光探針研究提供了更多支持。

血紅蛋白(hemoglobin, Hb)作為生物體內(nèi)紅細(xì)胞的重要組成部分, 主要功能是攜帶和運(yùn)輸氧氣, 調(diào)節(jié)血液的pH值等[6], 在生命活動(dòng)中具有十分重要的意義。 觀測(cè)血紅蛋白的含量是否穩(wěn)定對(duì)于生命體的健康評(píng)估是十分必要的。 在紅細(xì)胞中, 血紅蛋白約占蛋白質(zhì)總量的90%, 及時(shí)觀測(cè)Hb含量是否在正常范圍內(nèi), 可以有效預(yù)防白血病、 貧血癥和癌癥等許多疾病的產(chǎn)生。 若能定量檢測(cè)生物體內(nèi)的Hb含量, 將對(duì)生命科學(xué)研究和臨床診斷提供重要的技術(shù)支持。 除此之外, 在刑偵領(lǐng)域, 若能對(duì)低濃度的血紅蛋白進(jìn)行高效檢測(cè), 將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 牛血紅蛋白(bovine hemoglobin, BHb)與Hb在結(jié)構(gòu)以及光譜特性上具有極高的相似性。 由于BHb來(lái)源獲取更為簡(jiǎn)單, 已被廣泛用作HHb的模型物, 應(yīng)用于各種光譜研究和機(jī)理分析[7]。

此前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了幾種用于定量檢測(cè)血紅蛋白的分析方法, 例如熒光法[8]、 電化學(xué)法和比色法等, 其中基于碳點(diǎn)熒光猝滅的檢測(cè)方法由于成本低、 檢測(cè)速度快、 靈敏度高而備受關(guān)注, 然而此前的工作對(duì)其熒光猝滅的機(jī)理研究還不夠充分[9]。 2014年Chang等將碳點(diǎn)應(yīng)用于血紅蛋白的檢測(cè)中, 通過(guò)電化學(xué)方法以甘氨酸為前體合成了碳點(diǎn), 但該文章的重點(diǎn)在于如何檢測(cè)血紅蛋白, 并沒(méi)有過(guò)多地分析其猝滅的機(jī)制[10]。

本研究通過(guò)堿催化的方法合成了碳點(diǎn), 并用該碳點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)微量牛血紅蛋白的特異性檢測(cè)。 該碳點(diǎn)在不同波長(zhǎng)激發(fā)下, 對(duì)BHb的檢測(cè)都有較好的線性響應(yīng), 合成方法也較為簡(jiǎn)單, 可以更加高效、 便捷地檢測(cè)血紅蛋白。 我們通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)、 穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀、 透射電子顯微鏡(TEM)以及皮秒時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)(TCSPC)對(duì)合成碳點(diǎn)的性質(zhì)進(jìn)行了分析, 研究了BHb對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅機(jī)制, 計(jì)算BHb猝滅碳點(diǎn)熒光的猝滅速率常數(shù), 以及兩者之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù), 并通過(guò)圓二色分光光度計(jì)(CD)分析BHb在該過(guò)程中結(jié)構(gòu)的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及設(shè)置

使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU1901)來(lái)測(cè)量穩(wěn)態(tài)吸收光譜, 探測(cè)范圍為190～650 nm。 穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜通過(guò)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(FluoroMax-4)進(jìn)行測(cè)量, 設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的范圍分別為340～425和360～830 nm。

時(shí)間分辨熒光光譜在實(shí)驗(yàn)室自行搭建的TCSPC系統(tǒng)上測(cè)量。 在該系統(tǒng)中, 使用英國(guó)Fianium公司的皮秒連續(xù)光纖激光器產(chǎn)生中心波長(zhǎng)為425 nm, 重復(fù)頻率為20 MHz的激發(fā)脈沖。 通過(guò)獨(dú)立的時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)模塊和單光子計(jì)數(shù)光電倍增管記錄熒光。 將二氧化硅納米顆粒水溶液作為樣品對(duì)其瑞利散射進(jìn)行檢測(cè), 得到儀器響應(yīng)函數(shù)(IRF)約為200 ps。 有關(guān)該系統(tǒng)的更多詳細(xì)信息, 可參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

碳點(diǎn)的透射電鏡圖由上海島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司的電子顯微鏡(JEOL2100F)獲得。 BHb的CD光譜通過(guò)日本JASCO公司的圓二色分光光度計(jì)(J-1500)測(cè)量, 范圍在190～260 nm之間, 測(cè)試過(guò)程中全程通氮?dú)狻?/p>

(1)規(guī)范性原則。在電網(wǎng)“三集五大”重要戰(zhàn)略要求下，運(yùn)營(yíng)在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)架構(gòu)設(shè)計(jì)各部分內(nèi)容，應(yīng)該按照電力企業(yè)相關(guān)技術(shù)規(guī)范、架構(gòu)設(shè)計(jì)規(guī)范等要求進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.2 樣品制備

使用的果糖、 牛血紅蛋白(分子量約為64 500)、 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉二水合物均購(gòu)買于阿拉丁公司, 氫氧化鈉購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)。 將磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉二水合物以一定比例混合得到磷酸鹽(PB)緩沖液(10 mmol·L-1, pH≈7.1), 若無(wú)額外提及, 溶劑均為上述緩沖液。

實(shí)驗(yàn)合成的碳點(diǎn)以果糖作為前體, 氫氧化鈉作為催化劑。 分別將果糖和氫氧化鈉溶于去離子水, 制成500 mmol·L-1的溶液作為母液, 將兩者以一比一的比例混合, 最終溶液中果糖和氫氧化鈉的濃度皆為250 mmol·L-1, 放置一段時(shí)間后進(jìn)行透析即可得到碳點(diǎn), 該過(guò)程僅需將兩個(gè)溶液混合靜置, 無(wú)需加熱和其他能源輸入。 將兩個(gè)溶液以一比一的比例混合靜置一周后, 用截留分子量為500D的透析袋進(jìn)行透析, 透析24 h后, 將所得水溶性碳點(diǎn)溶液放入凍干機(jī)中真空干燥36 h以獲得固體碳點(diǎn)粉末, 凍干產(chǎn)率約為4.99%。

分別稱取BHb樣品以及凍干后的碳點(diǎn)粉末溶于PB緩沖液中, 作為一級(jí)儲(chǔ)備液, 濃度分別為10 mmol·L-1和0.184 g·mL-1, 并保存在低溫(4 ℃)且避光的環(huán)境中。 實(shí)驗(yàn)時(shí)取1.5 mL碳點(diǎn)的一級(jí)儲(chǔ)備液, 根據(jù)所需BHb濃度加入不同體積的BHb一級(jí)儲(chǔ)備液與之混合, 最后加入適當(dāng)體積的PB緩沖液使得最后溶液體積保持在3 mL。 若無(wú)特別提及, 本文溶液中碳點(diǎn)的濃度為0.092 g·mL-1, BHb的濃度為0～5 μmol·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點(diǎn)的表征

通過(guò)對(duì)碳點(diǎn)的電鏡圖像的測(cè)量以及對(duì)它粒徑分布情況的統(tǒng)計(jì)(如圖1), 結(jié)果顯示得到的碳點(diǎn)為球狀, 且分散性良好。 為了避免碳點(diǎn)聚集從而影響粒徑大小的測(cè)量, 實(shí)驗(yàn)選取了碳點(diǎn)分布較為分散的區(qū)域, 測(cè)量碳點(diǎn)的粒徑大小分布在5.5～11.5 nm之間, 平均粒徑大小約為8.2 nm。

為了進(jìn)一步分析碳點(diǎn)晶面間的距離, 我們采取了更高的分辨率, 測(cè)量的高分辨電鏡圖如圖2所示, 測(cè)得碳點(diǎn)的晶面間距約為0.33 nm, 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道為石墨的(003)晶面[4]。

圖2 碳點(diǎn)的高分辨電鏡圖

2.2 BHb對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅

為了分析BHb對(duì)碳點(diǎn)光譜的影響, 我們將碳點(diǎn)與不同濃度的BHb混合, 測(cè)量混合溶液的熒光發(fā)射光譜以及吸收光譜。 在圖4(a)中, 藍(lán)色和黑色的曲線分別代表碳點(diǎn)和BHb的吸收光譜, 其中BHb的濃度為0.25 μmol·L-1, 碳點(diǎn)的濃度是4.6 mg·mL-1, 紅色曲線是兩者混合后的吸收光譜(已考慮兩溶液混合帶來(lái)的濃度降低的影響), 發(fā)現(xiàn)混合后的吸收光譜約為兩個(gè)樣品單獨(dú)存在時(shí)的吸收光譜之和。 圖4(b)顯示的是加入不同濃度的BHb后碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜。 結(jié)果表明, BHb會(huì)猝滅碳點(diǎn)的熒光, 加入的BHb濃度越高, 碳點(diǎn)熒光下降的比例就越大。 圖中熒光強(qiáng)度已經(jīng)過(guò)歸一化處理。

圖4 碳點(diǎn)和BHb的吸收光譜(a)以及加入不同濃度BHb后碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜(b)

2.2.2 猝滅機(jī)制

根據(jù)猝滅機(jī)理的不同, 熒光猝滅被分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)兩種形式。 靜態(tài)猝滅的原理是, 部分熒光分子與猝滅劑結(jié)合, 形成的絡(luò)合物不會(huì)發(fā)出熒光, 從而導(dǎo)致熒光分子的熒光強(qiáng)度減弱。 動(dòng)態(tài)猝滅的原理是, 部分熒光分子處于激發(fā)態(tài)時(shí), 與猝滅劑分子發(fā)生了碰撞或其他相互作用, 失活后直接回到基態(tài), 從而使熒光強(qiáng)度降低。 常用Stern-Volmer方程來(lái)對(duì)熒光猝滅的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 見(jiàn)式(1)。

(1)

式(1)中,F0和F分別表示加入BHb前后碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,kq為雙分子猝滅速率常數(shù), [Q]表示加入的BHb的濃度,τ0為未加BHb時(shí)碳點(diǎn)的熒光壽命。 根據(jù)Stern-Volmer方程作出碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度下降比例隨BHb濃度變化的關(guān)系曲線, 如圖5(a)所示, 可以看到, 碳點(diǎn)的熒光下降程度F0/F和BHb濃度之間表現(xiàn)為很好的線性關(guān)系, 由Stern-Volmer方程計(jì)算可得在295 K下,kq的值約為5.72×1013L·mol-1·s-1, 比最大擴(kuò)散速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·s-1)大幾個(gè)量級(jí), 表明BHb對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅是一個(gè)靜態(tài)的過(guò)程[16]。 除此之外, 這兩種猝滅形式還可以根據(jù)不同溫度下的猝滅速率常數(shù)來(lái)進(jìn)行判斷。

圖5 在不同反應(yīng)溫度下碳點(diǎn)熒光隨BHb濃度變化的Stern-Volmer圖(a), (b)

在較高的溫度下, 熒光分子和猝滅劑之間的碰撞比較劇烈。 因此隨著溫度的升高, 動(dòng)態(tài)猝滅的猝滅速率常數(shù)也隨之增大。 在靜態(tài)猝滅的情況下, 高溫不利于復(fù)合物形成, 因此隨著溫度的升高, 靜態(tài)猝滅的猝滅速率常數(shù)也隨之減小。 從圖5(a)中觀察發(fā)現(xiàn), 溫度越高, Stern-Volmer圖線的斜率越低, 也就是猝滅速率常數(shù)越小, 因此該過(guò)程是靜態(tài)猝滅過(guò)程, 求得猝滅速率常數(shù)如表1所示。 由式(2), 可進(jìn)一步求得結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n, 在三個(gè)溫度下, 分別作出熒光變化量的對(duì)數(shù)形式隨BHb濃度的對(duì)數(shù)的變化曲線, 經(jīng)過(guò)線性擬合, 求得結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)如表1所示。 在不同的溫度下, 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)都在1附近, 表明在碳點(diǎn)和BHb之間有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。 在295 K下, 結(jié)合常數(shù)為2.94×105L·mol-1, 較高的結(jié)合常數(shù)表明碳點(diǎn)和BHb之間有一個(gè)比較強(qiáng)的結(jié)合。 隨著溫度升高, 結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)皆有一定程度的下降, 進(jìn)一步證明了BHb對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅是一個(gè)靜態(tài)的過(guò)程。

表1 在不同溫度下的猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)

(2)

為了獲得更直接的證據(jù)證明兩者之間發(fā)生了靜態(tài)猝滅, 我們測(cè)量了碳點(diǎn)的熒光壽命在猝滅過(guò)程是否發(fā)生改變。 由圖6(a)可知, 加入不同濃度的BHb, 碳點(diǎn)的熒光壽命基本保持不變, 經(jīng)擬合, 碳點(diǎn)的熒光壽命約為1.7 ns, 激發(fā)和探測(cè)的波長(zhǎng)分別為425和535 nm。

圖6 加入不同濃度BHb后碳點(diǎn)的時(shí)間分辨熒光光譜(a)以及加入碳點(diǎn)前后BHb的圓二色譜(b)

2.2.3 圓二色譜

(3)

(4)

式(3)和式(4)中,c為蛋白的濃度, 實(shí)驗(yàn)選用的BHb的濃度為5 μmol·L-1;n為蛋白質(zhì)中氨基酸的數(shù)量, 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道為574[19];l為光程, 為2 mm; MRE209 nm則代表209 nm處BHb的平均殘基橢圓率。 計(jì)算后發(fā)現(xiàn)加入碳點(diǎn)后BHb的α-螺旋含量由43.1%下降至40.3%, 說(shuō)明碳點(diǎn)的加入會(huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)。

2.3 碳點(diǎn)檢測(cè)BHb的性能分析

2.3.1 線性方程與檢測(cè)限

我們檢測(cè)了不同濃度BHb對(duì)于碳點(diǎn)熒光的影響, 發(fā)現(xiàn)加入BHb后碳點(diǎn)的熒光峰值下降, 由圖7(a)可見(jiàn), 碳點(diǎn)熒光變化F0/F在BHb濃度為0～5 μmol·L-1時(shí), 兩者表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系, 回歸方程為y=0.091 28x+0.994 87, 相關(guān)系數(shù)r為0.998, 在線性方程中BHb濃度的單位為μmol·L-1, 以三倍信噪比計(jì)算得到檢測(cè)BHb的檢測(cè)限為304 nmol·L-1, 相比其他檢測(cè)BHb的方法[20], 該碳點(diǎn)檢測(cè)BHb也具有比較低的檢測(cè)限。 除此之外, 由于碳點(diǎn)具有可調(diào)諧熒光的特性, 當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)由425 nm減小為370 nm, 熒光峰也會(huì)發(fā)生一定的藍(lán)移。 利用碳點(diǎn)的該特性, 我們用370 nm的光激發(fā)碳點(diǎn), 觀察BHb對(duì)碳點(diǎn)熒光的影響, 也呈現(xiàn)與425 nm的光激發(fā)相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 如圖7(b), 線性回歸方程為y=0.095 96x+0.987 51, 在線性方程中BHb濃度的單位為μmol·L-1, 相關(guān)系數(shù)r為0.998, 檢測(cè)限為243 nmol·L-1, 同樣可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微量血紅蛋白的檢測(cè)。 除此之外, 我們通過(guò)不同緩沖液的實(shí)驗(yàn)證實(shí), 在Tris緩沖液中, 加入BHb后碳點(diǎn)的熒光特性與碳點(diǎn)在PB緩沖液中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)論相同, 表明不同的緩沖液體系對(duì)于熒光碳點(diǎn)檢測(cè)BHb沒(méi)有影響。

圖7 碳點(diǎn)熒光變化與BHb濃度在0～5 μmol·L-1之間的線性關(guān)系, 激發(fā)波長(zhǎng)分別為425 nm(a)和370 nm(b)

2.3.2 選擇性與熒光穩(wěn)定性

為了評(píng)估該碳點(diǎn)檢測(cè)BHb的選擇性, 我們選擇了生物體血液中存在的7種常見(jiàn)的氨基酸或蛋白質(zhì), 包括牛血清白蛋白、 色氨酸、 酪氨酸、 丙氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸以及蛋氨酸, 分別與碳點(diǎn)混合, 測(cè)量在不同體系下, 碳點(diǎn)的熒光變化(425 nm激發(fā)), 樣品的濃度均設(shè)置為20 μmol·L-1。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只有在碳點(diǎn)/BHb體系中, 熒光有明顯的變化, 證實(shí)了合成碳點(diǎn)對(duì)血紅蛋白的高選擇性, 結(jié)果如圖8(a)所示。 加入BHb后, BHb與碳點(diǎn)發(fā)生相互作用, 形成復(fù)合物。 碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化如圖8(b)所示, 表明用該碳點(diǎn)探針檢測(cè)BHb, 碳點(diǎn)的熒光具有較好的穩(wěn)定性。

圖8 基于碳點(diǎn)熒光猝滅檢測(cè)血紅蛋白的選擇性(a)以及熒光穩(wěn)定性(b)

3 結(jié) 論

采用化學(xué)方法以果糖和氫氧化鈉為原料制備了水溶性發(fā)光碳點(diǎn), 合成過(guò)程遵循綠色化學(xué)原則, 無(wú)需加熱等高能耗過(guò)程, 需要的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單, 具有較高的實(shí)用性。 合成的碳點(diǎn)可用于微量血紅蛋白的特異性檢測(cè)。 通過(guò)皮秒時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)以及熒光溫控實(shí)驗(yàn)證明了血紅蛋白對(duì)合成碳點(diǎn)熒光的猝滅是一個(gè)靜態(tài)的過(guò)程, 兩者之間發(fā)生結(jié)合, 形成了基態(tài)復(fù)合物, 并通過(guò)圓二色譜分析發(fā)現(xiàn), 在該過(guò)程血紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化, 對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)分析。 本研究展示了一種基于發(fā)光碳點(diǎn)熒光猝滅來(lái)檢測(cè)血紅蛋白的方法, 該方法具有高選擇性, 高穩(wěn)定性以及低成本的優(yōu)勢(shì)。