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UHPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析不同采收期茶枝柑青皮中黃酮類成分

2023-11-03 04:21:32張戴英何小芳黃健晶張英吳孟華曹暉馬志國(guó)廣東大翔中藥制藥有限公司廣州51085張戴英女職工創(chuàng)新工作室廣州51085暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心廣州511400
中南藥學(xué) 2023年10期
關(guān)鍵詞:陳皮素號(hào)峰青皮

張戴英,何小芳,黃健晶,張英,吳孟華,曹暉,馬志國(guó)*(1.廣東大翔中藥制藥有限公司,廣州 51085;2.張戴英女職工創(chuàng)新工作室,廣州 51085;.暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心,廣州 511400)

青皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮,具有疏肝破氣、消積化滯的功效[1]。青皮中含有揮發(fā)油、黃酮類化合物、氨基酸、胺類、生物堿、有機(jī)酸等成分,其中以橙皮苷為代表的黃酮類成分是青皮的主要活性成分[2-3],多采用HPLC法進(jìn)行分析[4-7]。文獻(xiàn)報(bào)道,采收期不同的個(gè)青皮與四花青皮中黃酮類成分、揮發(fā)油含量及組成均存在較大差異[8-12]。茶枝柑(Citrusreticulata‘Chachi’)是橘的眾多栽培品種之一,主產(chǎn)于廣東新會(huì),為廣東道地藥材廣陳皮的基原植物,5月落果曬干為個(gè)青皮,俗稱“柑胎仔”;7~9月份采收未成熟的果實(shí)后將果皮縱向剖成4瓣,去除果籽果肉,曬干后即得四花青皮[13],俗稱“柑青皮”,文獻(xiàn)報(bào)道橙皮苷在“柑胎仔”中的含量明顯高于“柑青皮”[14],而其他成分與采收時(shí)間的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用UHPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)定量方法,對(duì)不同采收期茶枝柑青皮的指紋圖譜和8個(gè)黃酮類成分含量進(jìn)行對(duì)比,為不同采收期茶枝柑青皮中黃酮類成分變化趨勢(shì)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器);XSR105/A十萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒-托利多),F(xiàn)A 2204B 萬(wàn)分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司);KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DK-98-Ⅱ單列兩孔恒溫水浴鍋(TAISITE儀器有限公司);YF-高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司);DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精其儀器有限公司)。

1.2 試藥

蕓香柚皮苷(批號(hào):Y-071-190329)、橙皮苷(批號(hào):C-006-191012)、香蜂草苷(批號(hào):X-034-181216)、甜橙黃酮(批號(hào):T-046-190328)、川陳皮素(批號(hào):C-015-180306)、3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮(批號(hào):Q-113-191016)、桔皮素(批號(hào):J-022-180730)(成都瑞芬思生物科技有限公司,純度均大于98.0%);5-去甲川陳皮素(批號(hào):wkq19021312,四川維客奇生物科技有限公司,純度大于98.0%)。乙腈(上海麥克林生化科技有限公司)、甲酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)均為色譜純,水為純凈水[華潤(rùn)怡寶飲料(中國(guó))有限公司],其余試劑均為分析純。

本研究收集了5月產(chǎn)的茶枝柑干燥幼果11批,曬干,為個(gè)青皮;7~9月采摘茶枝柑未成熟鮮果38批,加工為干燥的果皮,為四花青皮。詳見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表Tab 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取青皮樣品粉末0.2 g(過(guò)5號(hào)篩),精密稱定,置150 mL具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL,密塞,搖勻,稱定重量,超聲處理(700 W,40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黃酮、川陳皮素、3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮、桔皮素和5-去甲川陳皮素對(duì)照品粉末適量,加入甲醇配成質(zhì)量濃度分別為149、334、61.6、15.4、62、16、60.8、15.7 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),流動(dòng)相為乙腈(B)-0.1%甲酸水(A),梯度洗脫(0~8 min:15%→45%B,8~12 min:45%→65%B,12~15 min:65%→15%B),檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm或330 nm,流速為0.3 mL·min-1,柱溫為35℃,進(jìn)樣量為2 μL。

2.4 UHPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品(QP-0501)粉末(過(guò)5號(hào)篩),按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,以2號(hào)峰為參照峰,計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.10%,相對(duì)峰面積的RSD均小于0.20%,表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(QP-0501)粉末(過(guò)5號(hào)篩),按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定,以2號(hào)峰為參照峰,計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.10%,相對(duì)峰面積RSD均小于0.70%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批樣品(QP-0501)粉末(過(guò)5號(hào)篩)各6份,精密稱定,按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備,進(jìn)樣測(cè)定,以2號(hào)峰為參照峰,計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.20%,相對(duì)峰面積RSD均小于2.3%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立 取所有批次的樣品,按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。利用Agilent Chem Station 軟件將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出為“AIA”格式,并將5、7、8、9月份的青皮樣品所得的數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012)相似度軟件,生成各自的指紋圖譜及共有模式圖譜(見(jiàn)圖1、2)。

圖2 不同采收期青皮的共有模式圖Fig 2 Specific chromatograms of Canarh Fructus at different harvesting periods

2.4.5 共有峰的指認(rèn) 取混合對(duì)照品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。通過(guò)保留時(shí)間結(jié)合紫外光譜圖對(duì)指紋圖譜中的8個(gè)共有峰進(jìn)行了指認(rèn),分別為蕓香柚皮苷(1號(hào)峰)、橙皮苷(2號(hào)峰)、香蜂草苷(3號(hào)峰)、甜橙黃酮(4號(hào)峰)、川陳皮素(5號(hào)峰)、3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮(6號(hào)峰)、桔皮素(7號(hào)峰)、5-去甲川陳皮素(8號(hào)峰)。

從圖1、2可以看出,5月采收的青皮圖譜與另外3個(gè)月采收的青皮圖譜有明顯差異,而7~9月間的青皮圖譜變化不明顯;隨著生長(zhǎng)期的增加,2號(hào)峰(橙皮苷)的相對(duì)峰高明顯降低,A區(qū)域的共有峰隨著月份的增加變化不明顯,需進(jìn)一步通過(guò)含量測(cè)定進(jìn)行分析比較。

2.4.6 相似度分析 將以上得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012)相似度軟件,計(jì)算各自的相似度,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同采收期青皮樣品相似度評(píng)價(jià)Tab 2 Similarity evaluation of Canarh Fructus at different harvesting periods

從表2可知,49批4個(gè)不同采收期(5、7、8、9月份)青皮的指紋圖譜相似度分別是0.996~1.000、0.972~1.000、0.985~1.000、0.984~1.000。相同采收期的青皮相似度均>0.97,說(shuō)明相同月份采摘的青皮之間質(zhì)量穩(wěn)定性較好。通過(guò)對(duì)比4個(gè)不同采摘月份的青皮的共有模式圖的相似度(見(jiàn)表3),發(fā)現(xiàn)7~9月采收的四花青皮相似度極高,而5月份采收的個(gè)青皮與四花青皮相似度<0.78,相似度較低,表明不同成熟度的青皮質(zhì)量存在一定的差異。

表3 共有模式的相似度比較Tab 3 Similarity of shared patterns

2.5 青皮中8種黃酮類成分的含量測(cè)定

參考本課題組已建立的UHPLC法[15],對(duì)不同采收期茶枝柑青皮的樣品中的8個(gè)黃酮類成分進(jìn)行定量分析。

2.5.1 含量測(cè)定 分別精密吸取“2.1”及“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液2 μL,按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定,用外標(biāo)法計(jì)算含量,結(jié)果見(jiàn)表4、5。

表4 不同采收期青皮樣品8個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果(%)Tab 4 Content of 8 components of Canarh Fructus at different harvesting periods (%)

由表5可知,不同采收期的青皮樣品中各測(cè)定成分有不同程度的差異,采用單因素方差分析,對(duì)不同月份的8種成分含量進(jìn)行差異比較。結(jié)果表明,蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷和5-去甲川陳皮素的5月份的含量顯著高于7~9月份(P<0.001)。甜橙黃酮5月份的含量明顯低于7~9月份(P<0.001)。川陳皮素5月份的含量明顯低于7月份和8月份(P<0.001),而9月份的川陳皮素含量低于8月份(P<0.05)。3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮5月份的含量明顯低于7~9月份(P<0.001),而且7月份的3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮含量顯著低于8月份(P<0.01)。桔皮素在5月、7月、8月和9月的含量沒(méi)有顯著差異。

表5 不同采收期青皮中8個(gè)成分的含量平均值(%)Tab 5 Average content of 8 components of Canarh Fructus at different harvesting periods (%)

2.5.2 聚類分析 為比較不同采收時(shí)間青皮之間成分的差異,以各樣品中黃酮類成分含量測(cè)定結(jié)果為變量,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ImageGP進(jìn)行熱圖聚類分析(見(jiàn)圖3)。由聚類分析結(jié)果可得,5月份采收的青皮可聚為一類,7、8、9月份的青皮聚為另一類,從熱圖可以看出5月份采收的個(gè)青皮中蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷含量均高于其他月份采收的四花青皮,提示隨著采收時(shí)間的后推,黃酮苷類成分有降低的趨勢(shì)。

2.5.3 主成分分析 采用SIMCA 14.1軟件,以測(cè)得的8個(gè)黃酮類成分含量測(cè)得結(jié)果為變量,建立主成分分析模型,繪制主成分分析得分圖(見(jiàn)圖4)。結(jié)果可知,前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為93.5%,其中第1主成分貢獻(xiàn)率為 68.8%,第2主成分貢獻(xiàn)率為24.7%。從所得的方差貢獻(xiàn)率來(lái)看,建立的模型累積解釋能力參數(shù)R2X和預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2分別為0.935 和 0.855,說(shuō)明模型的區(qū)分度和預(yù)測(cè)程度都較好,前2個(gè)主成分已基本能反映出不同月份青皮樣品的主要特征。5月份采收的個(gè)青皮與7、8、9月份采收的四花青皮能顯著區(qū)分開(kāi)來(lái),個(gè)青皮與四花青皮在成分含量上存在明顯的差異;而7~9月采收的樣品并不能顯著分開(kāi),說(shuō)明這3個(gè)月份采收的青皮黃酮類含量差異不明顯。主成分分析結(jié)果與熱圖聚類分析結(jié)果一致,提示青皮含有的黃酮類成分與采收時(shí)間具有一定的相關(guān)性。

圖4 不同月份青皮主成分分析圖Fig 4 Principal component analysis for different months

3 討論

3.1 不同采收期青皮的指紋圖譜

本研究建立了青皮藥材中黃酮類成分的UHPLC-DAD指紋圖譜,共標(biāo)定了8個(gè)共有峰,分別為蕓香柚皮苷(1號(hào)峰)、橙皮苷(2號(hào)峰)、香蜂草苷(3號(hào)峰)、甜橙黃酮(4號(hào)峰)、川陳皮素(5號(hào)峰)、3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮(6號(hào)峰)、桔皮素(7號(hào)峰)和5-去甲川陳皮素(8號(hào)峰)。采用UHPLC指紋圖譜法對(duì)不同采收期的青皮進(jìn)行相似度分析,發(fā)現(xiàn)相同月份采收的青皮樣品的指紋圖譜相似度均>0.9,說(shuō)明相同采收期的青皮樣品之間均一性相對(duì)較高、質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。5月份與其他月份的共有模式圖相似度均<0.8,而7~9月采收的青皮的相似度極高。聚類分析與主成分分析均可將5月采收的樣品與7~9月采收的樣品分開(kāi),說(shuō)明采收期是影響青皮質(zhì)量的關(guān)鍵因素,7~9月份采收的青皮質(zhì)量較穩(wěn)定。

3.2 不同采收期青皮的黃酮類成分含量

不同采收期青皮中8種黃酮類成分含量測(cè)定結(jié)果表明,7~9月的青皮中甜橙黃酮和3',4',3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮的含量明顯高于5月;川陳皮素和桔皮素的含量隨著月份的增加變化不明顯;隨著生長(zhǎng)期的增加,蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、5-去甲川陳皮素4種黃酮類成分顯著減少,其中以未成熟幼果入藥的個(gè)青皮(柑胎仔)含量最高,說(shuō)明青皮中黃酮類成分的含量與生長(zhǎng)期密切相關(guān)。

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