詹福壽,魏 波,宋旭梅,馬一婧,芮淑賢,賈 偉

羊水細(xì)胞染色體核型分析目前仍是診斷胎兒染色體病的金標(biāo)準(zhǔn),可檢出低比例嵌合體、非整倍體、片段較大(常大于5 Mb)的染色體缺失、重復(fù)、倒位及易位等,而對(duì)于小于5 Mb的染色體微缺失、微重復(fù)片段則無(wú)法檢出,并不能準(zhǔn)確判斷額外小標(biāo)記染色體的來(lái)源[1-2]。單核苷酸多態(tài)性芯片技術(shù)(SNP-array)實(shí)驗(yàn)程序煩瑣、成本較高、通量較低,這些限制了該技術(shù)在產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷中的大規(guī)模應(yīng)用。拷貝數(shù)變異測(cè)序(CNV-seq)是一種低深度全基因組測(cè)序技術(shù),可檢出基因組內(nèi)大于100 kb的基因拷貝數(shù)變異(CNVs),具備操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)范圍廣、報(bào)告周期短、費(fèi)用較低、所需樣本DNA量少(10 ng～50 ng DNA)、分辨率高、通量高等技術(shù)優(yōu)勢(shì)[3]。2019年專家共識(shí)提到可以考慮將CNV-seq檢測(cè)作為一線的產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于臨床[4]。本研究主要探討CNV-seq技術(shù)聯(lián)合染色體G顯帶核型分析在胎兒染色體病產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2020年10月至2022年6月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院產(chǎn)前中心就診936例患者,平均年齡(32.56±5.18)歲,其中,年齡高風(fēng)險(xiǎn)(預(yù)產(chǎn)年齡≥35歲)157例(16.77%),年齡<35歲者779例(83.23%)。產(chǎn)前診斷時(shí)的孕周為16+2～32+6周,平均孕周(18.95±3.47)周。孕婦簽署產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)后穿刺,抽取羊水行CNV-seq技術(shù)和染色體G顯帶核型分析聯(lián)合檢測(cè)。

1.2 產(chǎn)前診斷指征:①年齡高風(fēng)險(xiǎn)(預(yù)產(chǎn)年齡≥35歲者)157例;②產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦128例,包括早、中孕期血清學(xué)篩查(MSS)高風(fēng)險(xiǎn)和無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn);③產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常365例,其中超聲異常包括頸項(xiàng)透明層(NT)增厚、頸項(xiàng)軟組織(NF)增厚、羊水過(guò)多或過(guò)少、結(jié)構(gòu)異常及多個(gè)超聲軟指標(biāo)異常等;④胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩62例;⑤既往有不明原因的不良孕產(chǎn)史85例;⑥夫婦一方染色體異常者46例,包括染色體平衡易位攜帶者或非平衡染色體結(jié)構(gòu)異常;⑦其他93例,包括夫婦一方有致畸因素接觸史、孕期服藥史、不良生活史、近親婚配等。本研究通過(guò)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(第2020—689號(hào)),所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書(shū)。

1.3 方法

1.3.1 超聲引導(dǎo)下羊水標(biāo)本采集:完善相關(guān)檢驗(yàn)、檢查,簽署介入性產(chǎn)前診斷知情同意書(shū),孕婦仰臥位,超聲引導(dǎo)下采用21 G穿刺針行羊膜腔穿刺術(shù),為避免母體細(xì)胞污染,穿刺成功后先抽取羊水1～2 mL丟棄,更換注射器后繼續(xù)抽取羊水3管,每管約8～10 mL,其中2管用于細(xì)胞培養(yǎng)制備染色體,剩余1管提取DNA用于CNV-seq技術(shù)檢測(cè)。

1.3.2 羊水細(xì)胞染色體G顯帶核型分析:2管羊水分2線獨(dú)立操作,1線采用和能生物羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州和能生物科技有限公司),另1線采用BI羊水細(xì)胞培養(yǎng)基(上海碧艾生物科技有限公司),分別置于兩臺(tái)含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱獨(dú)立培養(yǎng)。8～10 d后視細(xì)胞生長(zhǎng)情況加入秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)3～5 h,使用胰蛋白酶消化法收獲細(xì)胞,滴片并于75 ℃烤片3 h 后G顯帶。制備好的玻片置于MetaSystems染色體全自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)(Ziess公司,德國(guó))掃片分析,每線培養(yǎng)物計(jì)數(shù)不少于10個(gè)細(xì)胞,挑選不少于5個(gè)分散適中、帶紋清晰、至少達(dá)到400條帶水平的完整細(xì)胞進(jìn)行核型分析。如疑為嵌合體或異常核型,則加大計(jì)數(shù),一般不少于50個(gè)細(xì)胞。染色體的核型描述依據(jù)人類染色體國(guó)際命名體制(ISCN)ISCN 2016進(jìn)行。

1.3.3 CNV-seq技術(shù)檢測(cè):常規(guī)抽提羊水基因組DNA,使用染色體CNV檢測(cè)試劑盒(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))和Illumina測(cè)序平臺(tái)NextSeq CN500對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,檢測(cè)染色體非整倍體及全基因CNV,嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行操作。測(cè)序結(jié)果通過(guò)ChAS 2.0軟件(Chromosome analysis Suite)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,選取長(zhǎng)度≥100 kb的片段進(jìn)行分析。按照《美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)序列變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南2015》進(jìn)行CNV致病性分析。主要參考人群多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)DGV(the Database of Genomic Variant)、人類孟德?tīng)栠z傳在線數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、患者表型相關(guān)的基因組結(jié)構(gòu)變異數(shù)據(jù)庫(kù)DECIPHER(the Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensemble Resources)、基因劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)ClinGen(Clinical Genome Resource)、基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)ClinVar及PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)進(jìn)行CNV結(jié)果的判讀。根據(jù)CNV的性質(zhì)不同分為致病性CNVs(pathogenic variants,P)、可能致病CNVs(likely pathogenic variants,LP)、臨床意義不明確CNVs(variants of unknown significance,VOUS)、良性CNVs(benign variants,B)及可能良性CNVs(likely benign variants,LB)5類[4]。為了臨床遺傳咨詢的需要,本研究只對(duì)前3類CNVs進(jìn)行分析[5]。對(duì)檢測(cè)到VOUS的病例,建議進(jìn)行胎兒父母CNV-seq檢測(cè)驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)成功率:936例具備產(chǎn)前診斷指征并行羊膜腔穿刺的孕婦羊水標(biāo)本,有1例血性羊水細(xì)胞培養(yǎng)至14 d,未見(jiàn)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng),培養(yǎng)失敗,其余均培養(yǎng)成功,檢測(cè)成功率為99.89%(935/936)。CNV-seq技術(shù)檢測(cè)成功率為100%(936/936)。

2.2 胎兒羊水染色體G顯帶核型分析結(jié)果:胎兒羊水染色體G顯帶核型分析檢出異常74例,陽(yáng)性檢出率為7.91%(74/936)。染色體數(shù)目異常47例,陽(yáng)性檢出率為5.02%(47/936),其中21-三體27例,18-三體 3例,13-三體1例,Turner綜合征7例,Klinefelter綜合征3例,47,XXX綜合征2例,47,XYY綜合征1例,其他染色體數(shù)目異常3例。染色體結(jié)構(gòu)異常26例,陽(yáng)性檢出率為2.78%(26/936),其中平衡易位14例,倒位6例,其他染色體結(jié)構(gòu)異常6例。染色體數(shù)目異常合并結(jié)構(gòu)異常1例,陽(yáng)性檢出率為0.11%(1/936)。染色體G顯帶異常核型分布情況及陽(yáng)性率,見(jiàn)表1。

表1 胎兒羊水染色體G顯帶異常核型分布情況及陽(yáng)性率

2.3 胎兒CNV-seq檢測(cè)結(jié)果:CNV-seq檢出染色體異常98例,陽(yáng)性檢出率為10.47%(98/936)。檢出染色體數(shù)目異常46例,其中1例胎兒羊水染色體G顯帶核型為47,XN,+3[5]/46,XN[95],CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示未見(jiàn)異常。另外,14例胎兒染色體平衡易位攜帶者(包括5例羅伯遜易位)和6例胎兒染色體倒位攜帶者,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果也提示未見(jiàn)異常。CNV-seq技術(shù)檢出致病性CNVs 64例(其中21-三體27例,18-三體 3例,13-三體1例,9號(hào)染色體三體嵌合體1例,Turner綜合征7例,Klinefelter綜合征3例,47,XXX綜合征2例,47,XYY綜合征1例),可能致病CNVs 12例,臨床意義不明確CNVs 22例。與傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析技術(shù)(7.91%)相比,陽(yáng)性檢出率提高了2.56個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 胎兒羊水染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq檢測(cè)結(jié)果:胎兒羊水染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq檢出染色體異常118例,陽(yáng)性檢出率為12.61%(118/936)。胎兒羊水染色體G顯帶核型分析與CNV-seq檢測(cè)技術(shù)對(duì)于染色體非整倍體的異常檢出率一致。1例胎兒羊水染色體G顯帶核型為47,XN,+3[5]/46,XN[95],1例46,XN,add(11)(q25)[4]/46,XX[71]的低比例嵌合體,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果均提示未見(jiàn)異常。1例47,XN,+9[11]/46,XN[39],CNV-seq結(jié)果提示9號(hào)染色體三體15%嵌合。對(duì)于羊水染色體G顯帶核型分析檢出的7例不平衡性改變,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示異常并能準(zhǔn)確地檢出染色體異常的位置及片段大小。羊水染色體G顯帶核型分析結(jié)果正常,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示異常45例。羊水染色體G顯帶核型分析提示異常,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示未見(jiàn)異常21例。兩種方法均檢測(cè)到異常的53例。CNV-seq部分致病性CNVs檢出信息表,見(jiàn)表2。

表2 CNV-seq部分致病性CNVs檢出信息表

2.5 胎兒羊水染色體G顯帶核型分析、CNV-seq兩者單獨(dú)檢測(cè)與其聯(lián)合檢測(cè)染色體異常檢出率比較:胎兒羊水染色體G顯帶核型分析、CNV-seq二者單獨(dú)檢測(cè)對(duì)染色體異常檢出率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CNV-seq單獨(dú)檢測(cè)與其聯(lián)合染色體核型分析檢測(cè)對(duì)染色體異常檢出率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。羊水染色體G顯帶核型分析單獨(dú)檢測(cè)與其聯(lián)合CNV-seq檢測(cè)對(duì)染色體異常檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。羊水染色體G顯帶核型分析、CNV-seq二者單獨(dú)檢測(cè)與其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)染色體異常檢出率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 染色體G顯帶核型分析、CNV-seq兩者單獨(dú)檢測(cè)與其聯(lián)合檢測(cè)染色體異常檢出率比較

3 討論

染色體異常包括染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常,是導(dǎo)致胚胎停育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及新生兒圍產(chǎn)期死亡的主要原因。產(chǎn)前診斷是減少遺傳病患兒出生的有效手段之一,是遺傳病預(yù)防的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳染色體G顯帶核型分析仍是產(chǎn)前診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn),但其無(wú)法檢測(cè)出染色體亞顯微結(jié)構(gòu)改變,即染色體的微缺失和微重復(fù)綜合征(MMS)。到目前為止,已明確由拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的MMS已達(dá)三百余種,其發(fā)病率約為1/600[6-7],占染色體異常所致出生缺陷的50%[8]。相關(guān)研究表明,染色體G顯帶核型分析未見(jiàn)異常但產(chǎn)前超聲提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒中,有6%～7%存在致病性或可能致病性的CNVs[9-11]。

張素華等[12]對(duì)316例孕婦羊水樣本進(jìn)行染色體G顯帶核型分析和CNV-seq檢測(cè),染色體G顯帶核型分析陽(yáng)性檢出率為7.59%(24/316),CNV-seq技術(shù)對(duì)致病或可能致病性染色體異常的檢出率為9.49%(30/316),與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)相比,染色體異常檢出率提高了1.90個(gè)百分點(diǎn)。本研究對(duì)具備產(chǎn)前診斷指征且無(wú)羊膜腔穿刺手術(shù)禁忌證的936例孕婦胎兒羊水標(biāo)本行CNV-seq技術(shù)和染色體G顯帶核型分析聯(lián)合檢測(cè),除1例血性羊水培養(yǎng)失敗外,其余均檢測(cè)成功。染色體G顯帶核型分析檢出異常74例,陽(yáng)性檢出率為7.91%(74/936)。CNV-seq技術(shù)檢出染色體異常98例,陽(yáng)性檢出率為10.47%(98/936)。與傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析技術(shù)(7.91%)相比,陽(yáng)性檢出率提高了2.56個(gè)百分點(diǎn)。胎兒羊水染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq檢出染色體異常118例,陽(yáng)性檢出率為12.61%(118/936)。與僅CNV-seq技術(shù)(10.47%)相比,陽(yáng)性檢出率提高了2.14個(gè)百分點(diǎn),與其他研究報(bào)道結(jié)果相似[5]。對(duì)于羊水染色體G顯帶核型分析檢出的7例不平衡性改變,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示異常并能準(zhǔn)確地檢出染色體異常的位置及片段大小。羊水染色體G顯帶核型分析結(jié)果正常,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示異常45例。羊水染色體G顯帶核型分析提示異常,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果提示未見(jiàn)異常21例。本研究表明,對(duì)于胎兒非整倍體染色體異常,上述兩種檢測(cè)方法均能準(zhǔn)確診斷,并且對(duì)于染色體核型分析無(wú)法判斷染色體來(lái)源的異常片段,CNV-seq技術(shù)能夠精確地進(jìn)行定位。CNV-seq技術(shù)不能檢出染色體的平衡易位、插入及倒位等[13],也不能檢出低比例的嵌合體,但是這些在表型異常的人群中是相對(duì)罕見(jiàn)的(占比<1%)[14]。如本研究中的1號(hào)孕婦胎兒染色體核型為47,XN,+mar,但染色體核型分析不能準(zhǔn)確辨認(rèn)其來(lái)源,CNV-seq檢測(cè)提示為13號(hào)染色體q11q12.12存在5.18 Mb的重復(fù),致病性CNVs,為產(chǎn)前遺傳咨詢及胎兒的去留提供有力的科學(xué)依據(jù)。

嵌合體是指由來(lái)自不同基因型的合子演變而來(lái)的兩個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞系混合構(gòu)成的個(gè)體。嵌合體的形成機(jī)制較為復(fù)雜,存在真性和假性嵌合體兩種,因產(chǎn)前獲取的胎兒相關(guān)表型有限,所以給產(chǎn)前遺傳咨詢帶來(lái)了較大的挑戰(zhàn)和難度。染色體G顯帶核型分析不能區(qū)分真性和假性嵌合體,因此有研究認(rèn)為,核型分析提示嵌合體的個(gè)體應(yīng)使用其他檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步印證[15]。在本研究中,1例胎兒羊水染色體G顯帶核型為47,XN,+3[5]/46,XN[95],1例46,XN,add(11)(q25)[4]/46,XX[71]的低比例嵌合體,CNV-seq檢測(cè)結(jié)果均提示未見(jiàn)異常。有研究報(bào)道1例染色體G顯帶核型分析結(jié)果為2號(hào)染色體三體嵌合體,嵌合比例為9%,而CNV-seq技術(shù)檢測(cè)嵌合比例高達(dá)33%,因超聲隨訪發(fā)現(xiàn)胎兒多發(fā)畸形而引產(chǎn)[16]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,越來(lái)越多的臨床醫(yī)師把染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)作為產(chǎn)前診斷的有效策略,CNV-seq技術(shù)可對(duì)未培養(yǎng)的原始細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),且檢測(cè)范圍廣,報(bào)告周期短,分辨率高,通量高,有效彌補(bǔ)了細(xì)胞遺傳檢測(cè)技術(shù)的不足,兩種方法聯(lián)合檢測(cè),可明顯提高染色體嵌合體檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度[17]。

綜上所述,染色體G顯帶核型分析和CNV-seq技術(shù)各具優(yōu)勢(shì),檢測(cè)結(jié)果之間相互印證。染色體G顯帶核型分析在低比例嵌合體、平衡易位及倒位攜帶者檢測(cè)方面更具優(yōu)勢(shì),而CNV-seq技術(shù)可檢出染色體的微缺失、微重復(fù)綜合征,可彌補(bǔ)染色體G顯帶核型分析分辨率的不足。CNV-seq技術(shù)和染色體G顯帶核型分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,可提高染色體異常的檢出率,降低漏診率,有效提高產(chǎn)前診斷的質(zhì)量,進(jìn)一步降低人口出生缺陷的發(fā)生率。