路晰媗,雷 紅,徐 禮,梁海艷,周小莉,沙立萍

碘是人體必不可少的微量元素。碘原子是一種電子供體,作為還原劑發(fā)揮作用,可被特異性過氧化物酶如甲狀腺過氧化物酶氧化,形成甲狀腺激素(THs),對人體正常代謝和生長發(fā)育至關(guān)重要[1]。組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳修飾的調(diào)節(jié)機制之一,近年來得到越來越多的關(guān)注。組蛋白不同氨基酸上的不同甲基化數(shù)目能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,并廣泛參與細胞發(fā)育、凋亡、代謝、炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等生物過程。組蛋白甲基化的形成主要依靠甲基化轉(zhuǎn)移酶通過將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到其作用的組蛋白上來完成。在脊椎動物中,組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)特異性位于ORF的5′端,被認為是基因活化的標志,其形成需要經(jīng)過H3K4甲基化轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)甲基作用[2],混合譜系白血病(MLL)家族蛋白(MLL1-4,SET1A,SET1B)則是負責(zé)H3K4甲基化最主要的蛋白[3]。組蛋白3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)位于基因啟動子區(qū)通常被認為是轉(zhuǎn)錄抑制的標志,可被賴氨酸特異性去甲基化(KDM)家族的KDM6B(又名含D3蛋白Jumonji結(jié)構(gòu),JJMJD3)和KDM6A作用發(fā)生去甲基化,引起基因轉(zhuǎn)錄激活[4]。既往有大量的研究探索了碘營養(yǎng)和甲狀腺疾病的關(guān)系,但少有分析碘對甲狀腺細胞組蛋白甲基化的影響機制。本研究主要分析碘作用于人甲狀腺細胞系后對H3K4me3和H3K27me3及相應(yīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶的影響,從表觀遺傳學(xué)方面去探究碘影響甲狀腺的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:人正常甲狀腺上皮細胞系N-thy-ori-3-1由中國醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所捐贈。細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(Gibco,美國),以及1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen,美國)中,置于37 ℃,5% CO2環(huán)境中培養(yǎng),隔天換液,棄去上清液和未貼壁的死細胞,更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)4～6 d,細胞貼壁70%～80%后將細胞接種于6孔板中,同時設(shè)定2個復(fù)孔,利用不同劑量(1 μM、10 μM、100 μM、1 mM、10 mM)的碘化鈉(Sigma,美國)分別刺激甲狀腺細胞6 h 和24 h。

1.2 Real time-PCR:細胞中加入Trizol溶液(Invitrogen,美國),根據(jù)試劑要求提取細胞RNA,檢測RNA純度和濃度,使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明在反轉(zhuǎn)錄儀器中進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,在羅氏LightCycler 480 Real-Time PCR儀器中進行分析。2-ΔΔCt法進行相對定量分析,所有目的基因均以GAPDH為內(nèi)參,最終定量=目的基因定量/GAPDH定量。引物序列如下,MLL 1上游序列為3’-GAGGACCCCGGATTAAACAT-5’,下游序列為3’-GGAGCAAGAGGTTCAGCATC-5’;MLL2上游序列為3’-AACCATATCGGCCTGGCATT-5’,下游序列為3’-CAGGCAGGTCAGCAGGTATC-5’;MLL3上游序列為3’-TGGTACTGACACTTCACAGGC-5’,下游序列為3’-ACCCGGTAGGACAAATACTGG-5’;MLL4上游序列為3’-AACCATATCGGCCTGGCATT-5’,下游序列為3’-CAGGCAGGTCAGCAGGTATC-5’;SET7/9上游序列為3’-GGCCGGTCCATTCAGCTCTCC-5’,下游序列為3’-GCAGGGCCAGGGCGTTTACA-5’; ASH1L上游序列為3’-AGTTTGCCCCCTTTAGCCTT-5’,下游序列為3’-CGATGAGAGTGCAGGGAAGT-5’;JMJD3上游序列為3’-GCAGGAATGCCAAGGTGAAAG-5’,下游序列為3’-GCAGCAGGACAGGTGAGAAGG-5’;GAPDH上游序列為3’-TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-5’,下游序列為3’-AGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-5’。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB):根據(jù)蛋白提取試劑盒(凱基,中國)步驟提取細胞蛋白。用100 μL裂解緩沖液將培養(yǎng)的細胞置于冰上裂解,用細胞刮板收集,進行渦旋震蕩,于4 ℃、12 000 r/min離心10 min。收集上清液,利用蛋白定量試劑盒(碧云天,中國)進行蛋白定量。將定量蛋白煮沸,分別在6%和12%凝膠上進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將凝膠轉(zhuǎn)移到聚乙烯膜上,(Millipore,美國),封閉2 h,用抗體anti-H3K4me3(Abcam,美國),anti-H3K27me3(Abcam)和 anti-β-actin(Abcam)在4 ℃下孵育,過夜,室溫下與HRP標記的IgG抗體孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光底物(Thermo Fisher,美國)檢測特異性條帶。使用Image-Pro Plus對相關(guān)的免疫印跡條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度碘刺激甲狀腺細胞系N-thy-ori-3-1后細胞組蛋白H3K4me3的變化:甲狀腺細胞H3K4me3蛋白水平隨著高碘濃度增加而增加,在高濃度(100 μM、1 mM和10 mM)的碘化鈉作用下H3K4me3整體蛋白水平顯著升高。隨著時間延長,在刺激24 h 后,甲狀腺細胞H3K4me3整體蛋白的水平隨著碘化鈉的刺激逐漸下降,呈動態(tài)變化,見圖1(封二)。

2.2 組蛋白H3K4me3甲基化轉(zhuǎn)移酶在不同濃碘濃度刺激下的表達:碘化鈉作用于甲狀腺細胞6 h,使得細胞組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶MLL1和MLL2的mRNA水平顯著升高,24 h后碘化鈉仍能誘導(dǎo) MLL1的轉(zhuǎn)錄表達增高,其他甲基化轉(zhuǎn)移酶在碘化鈉刺激下并無改變,見圖2(封二)。

2.3 不同濃度碘刺激甲狀腺細胞系N-thy-ori-3-1后細胞組蛋白H3K27me3的變化:隨著碘化鈉濃度的升高,H3K27me3總蛋白水平呈減少趨勢,尤其是在1 mM和10 mM碘化鈉刺激下,H3K27me3整體蛋白水平顯著下降,隨著時間延長至24 h后,H3K27me3整體蛋白水平較6 h 升高明顯,但仍有隨著碘濃度升高而下降的趨勢,與6 h 的結(jié)果一致,見圖3(封二)。

2.4 碘化鈉促進甲狀腺細胞高表達JMJD3:高濃度碘化鈉(1 mM)能誘導(dǎo)甲狀腺細胞JMJD3的轉(zhuǎn)錄水平增加,接下來的WB實驗驗證了JMJD3的蛋白表達在1 mM的碘化鈉刺激下呈一致性升高,見圖4(封二)。

3 討論

本研究通過細胞實驗探究了碘作用于甲狀腺細胞引起的組蛋白甲基化及相關(guān)修飾酶的變化,發(fā)現(xiàn)濃度梯度碘作用于甲狀腺細胞系后能夠引起細胞整體H3K4me3蛋白量逐漸增加,而H3K27me3蛋白量則逐漸下降,同時H3K4me3轉(zhuǎn)移酶MLL1,以及H3K27me3去甲基化轉(zhuǎn)移酶JMJD3表達顯著增加。

碘作為甲狀腺激素合成最基礎(chǔ)和最重要的元素,其與甲狀腺疾病的發(fā)生有著緊密聯(lián)系。機體內(nèi)合適的碘營養(yǎng)狀態(tài)對甲狀腺的功能穩(wěn)定尤為重要。碘不足和碘過量均可以導(dǎo)致甲狀腺疾病的發(fā)生,如甲狀腺腫、妊娠不良結(jié)局、甲狀腺功能減退癥、甲狀腺功能亢進癥及自身免疫性甲狀腺炎等[5-7]。既往有大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高碘可能導(dǎo)致甲狀腺自身免疫風(fēng)險的增加。有研究提示[8],碘超足量地區(qū)和碘過量地區(qū)橋本甲狀腺炎的累積發(fā)病率分別升高4.4倍和5.5倍。國外的研究顯示實行食鹽加碘政策后甲狀腺自身抗體和橋本甲狀腺炎患病率明顯提高[9]。許多基礎(chǔ)實驗研究也證實了碘在橋本甲狀腺炎中的重要作用。經(jīng)典模型就是0.05%碘化鈉飲水能誘導(dǎo)NOD.H-2h4小鼠發(fā)生自發(fā)性橋本甲狀腺炎,而減少碘水喂養(yǎng)可減輕甲狀腺炎的發(fā)生[10]。

碘過量引起甲狀腺自身免疫的具體機制尚不完全明晰,在表觀遺傳研究方面更是稀缺。組蛋白甲基化是表觀遺傳修飾中非常重要的調(diào)控機制。組蛋白H3K4me3位于轉(zhuǎn)錄起始位點標志著基因轉(zhuǎn)錄活化,啟動子區(qū)域H3K4me3的水平以及不同的分布寬度都和基因轉(zhuǎn)錄緊密相關(guān)[11]。甲狀腺細胞作為自身免疫攻擊的靶細胞,有研究報道其本身也能被碘誘導(dǎo)表達許多細胞因子和黏附分子,包括細胞間黏附分子1(ICAM-1),CC基序趨化因子配體2(CCL2),CXC基序趨化因子配體10(CXCL10)等[12-13],參與自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生及發(fā)展中。研究發(fā)現(xiàn)橋本甲狀腺炎患者甲狀腺濾泡細胞CXCL8、CCL2和 ICAM1 基因啟動子區(qū)域H3K4me3富集明顯增加,并伴ICAM1、CCL2和CXCL8的表達顯著增加,同時橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織高表達H3K4me3甲基化轉(zhuǎn)移酶MLL1[14]。本研究結(jié)果提示碘能增加甲狀腺細胞整體H3K4me3水平,同時能刺激甲狀腺細胞MLL1轉(zhuǎn)錄表達增加,這一發(fā)現(xiàn)間接為進一步探究碘是否通過影響甲狀腺細胞H3K4me3的改變而促使橋本甲狀腺炎提供了表觀學(xué)依據(jù)。

本研究的另外一個發(fā)現(xiàn)是碘也能影響H3K27me3的整體甲基化水平及JMJD3的表達。JMJD3通過轉(zhuǎn)甲基作用特異性去除啟動子區(qū)域H3K27me3的甲基從而解除對基因的轉(zhuǎn)錄抑制[15]。大量研究發(fā)現(xiàn)H3K27me3和JMJD3與自身免疫疾病相關(guān),JMJD3在調(diào)控免疫中發(fā)揮重要的作用。在系統(tǒng)性硬化疾病的患者中,JMJD3在CD4+T細胞中呈明顯的表達升高,同時相應(yīng)伴有 H3K27me3顯著下降[16]。在一項類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的研究中,半胱氨酸生成酶能減少RA患者關(guān)節(jié)成纖維細胞JMJD3 的表達,從而減少抑制白介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)下的炎癥因子表達。沉默JMJD3 基因或者用JMJD3特異性抑制劑干預(yù)則能調(diào)控基因啟動子區(qū)H3K27me3的水平進而顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)下的成纖維細胞的炎癥因子水平[17]。體內(nèi)研究也表明抑制JMJD3能顯著減緩膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀[17]。另一項研究發(fā)現(xiàn)JMJD3活性被抑制后能夠減少前炎癥因子IL-1β等刺激下的胰島細胞表達趨化因子CCL2和炎癥因子[18]。研究顯示橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織高表達JMJD3,CCL2和CXCL10,利用腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)甲狀腺炎模型后,發(fā)現(xiàn)JMJD3抑制劑能顯著減少TNF-α誘導(dǎo)下的炎癥因子CCL2和CXCL10的表達[19]。本研究發(fā)現(xiàn)高碘能誘導(dǎo)甲狀腺細胞高表達JMJD3伴隨H3K27me3整體蛋白的改變,為探討碘對橋本甲狀腺炎表觀遺傳影響提供了部分證據(jù)。但本研究僅探討了甲狀腺細胞整體甲基化的改變,缺乏對特定基因啟動子組蛋白甲基化豐度的研究,未來仍需要通過免疫共沉淀測序等方法評估全基因啟動子H3K4me3和H3K27me3的分布,更深入地分析碘對甲狀腺細胞表觀修飾的影響。

綜上所述,本研究通過體外實驗探討了碘對甲狀腺細胞的組蛋白甲基化影響,發(fā)現(xiàn)碘作用于甲狀腺細胞使得細胞整體H3K4me3的表達增加和H3K27me3的表達減少,伴隨MLL1和JMJD3的表達增加。這為進一步探討高碘與甲狀腺自身免疫的機制研究提供了表觀學(xué)的研究基礎(chǔ)和靶向治療的新思路。