李東杰,薛永平,劉麗媛,陸思敏,程鎖利

白細(xì)胞介素10(IL-10)是一種多效性細(xì)胞因子,在免疫調(diào)節(jié)和抗炎中發(fā)揮重要作用。IL-10具有強(qiáng)大的抗炎作用,確立機(jī)體的免疫耐受狀態(tài),可以抑制病原體對機(jī)體的過度免疫反應(yīng)[1]。IL-10在所有固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞中均有分泌,但在CD4+T細(xì)胞亞群中分泌最常見,特別是Th2和Treg[2]。IL-10能通過抑制共刺激分子、促炎因子和趨化因子的表達(dá)影響巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的功能。近年來,人們對IL-10的功能研究進(jìn)一步深入,但仍有許多未解問題[2]。有研究認(rèn)為IL-10抑制促炎因子IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF-α的合成[3],但對CD4+T細(xì)胞亞群的具體影響仍需要進(jìn)一步探討。本研究通過IL-10過表達(dá)T細(xì)胞特異性慢病毒侵染初始(naive)CD4+T細(xì)胞和siRNA片段抑制IL-10后,分析對小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞Th1、Th2、Th17、Treg亞群中的IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3 基因和蛋白表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料:雌性BALB/c小鼠,6～8周齡,來自寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠被安置在溫度為(22±1)℃、相對濕度為(50±1)%的環(huán)境中,光/暗周期為12 h/12 h。動(dòng)物研究符合寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理機(jī)構(gòu)的規(guī)定和指南,并根據(jù)國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理評估認(rèn)證委員會(huì)(AAALAC)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)(IACUC)指南進(jìn)行。

1.2 T細(xì)胞分離,CD4+T細(xì)胞分選:小鼠2只,頸椎脫臼處死。將小鼠的脾臟無菌取出,置于無菌的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma)中,加入10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 U/mL)(Sigma)。按照試劑盒說明書操作,使用脾臟淋巴細(xì)胞分離試劑盒(Solarbio Life Sciences,P.R.China)獲得淋巴細(xì)胞。隨后,根據(jù)美天旎公司試劑盒說明書操作,應(yīng)用磁珠分選和小鼠naive CD4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,德國)分離出小鼠脾臟淋巴細(xì)胞初始CD4+T細(xì)胞(應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢查,純度大于90%)。初始CD4+T細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃,5% CO2),加入10%胎牛血清和100 U/mL濃度的青霉素和鏈霉素。

1.3 應(yīng)用qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的表達(dá)

1.3.1 制備IL-10過表達(dá)T細(xì)胞特異性慢病毒載體:IL-10(Gene ID 16153,NM_010548.2,537 bp)過表達(dá)T細(xì)胞特異性慢病毒包裝(綠色熒光)。通過檢測NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得目的基因小鼠IL-10蛋白編碼序列,總長達(dá)537 bp,被翻譯氨基酸量為178個(gè)。目的載體為pLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO載體。慢病毒載體系統(tǒng)由慢病毒載體系列、psPAX2載體和pMD2G載體三質(zhì)粒組成。293T細(xì)胞是慢病毒的包裝細(xì)胞株,其生長培養(yǎng)基是DMEM(內(nèi)含10% FBS)。通過培養(yǎng),貼壁細(xì)胞經(jīng)由生長增殖可完成向單層細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。預(yù)先完成供轉(zhuǎn)染之用293T細(xì)胞的傳代(前提為具備良好的細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài),能夠滿足后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所需)。觀察細(xì)胞密度,發(fā)現(xiàn)其匯合率達(dá)70%～80%時(shí),啟動(dòng)轉(zhuǎn)染處理;制備脂轉(zhuǎn)complex,脂轉(zhuǎn)complex混勻后于室溫中進(jìn)行15 min溫育,然后低速滴加到293T細(xì)胞內(nèi),最后移至細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過16 h轉(zhuǎn)染,替換為新鮮的完全培養(yǎng)基(內(nèi)含10% FBS);轉(zhuǎn)染后48 h 和72 h 分別收集2次慢病毒上清液(48 h收集后置換新鮮完全培養(yǎng)基)。按照實(shí)驗(yàn)要求分裝病毒,-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 慢病毒侵染naive CD4+T細(xì)胞:T細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640(10%FBS,1%雙抗)培養(yǎng)基中。準(zhǔn)備12孔板,將上述小鼠脾臟naive CD4+T細(xì)胞懸液分為3孔(每孔細(xì)胞密度約0.5×107mL),并進(jìn)行標(biāo)記,分別為空白(blank)組,陰性對照(OE-NC)組,IL-10過表達(dá)(OE-IL-10)組。細(xì)胞用10%FBS1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng),生長到90%以上,傳代。先離心棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液,加2 mL的PBS清洗細(xì)胞離心棄去。加700 μL的胰蛋白酶液(0.25%),接著放置在CO2培養(yǎng)箱內(nèi),計(jì)時(shí)1.5 min左右,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變圓后輕輕拍打培養(yǎng)皿,使貼壁細(xì)胞脫落。加2 mL的10%FBS1640培養(yǎng)基使細(xì)胞全部脫落。轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液至經(jīng)過滅菌處理的離心管內(nèi),于室溫中離心,轉(zhuǎn)速為700 r/min,計(jì)時(shí)3 min。棄去上清液,用1 mL的正常培養(yǎng)液重懸,取10 μL細(xì)胞懸液加1 μL的錐蟲藍(lán)混勻后,加于細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。小鼠CD4+T細(xì)胞的活力保證在95%以上,細(xì)胞鋪6孔板,每孔約2×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后棄上清液,換成完全培養(yǎng)基,加入慢病毒,混勻,培養(yǎng)72 h后收樣,用于后續(xù)檢測。病毒添加量根據(jù)下述公式計(jì)算,MOI(感染指數(shù)) =(病毒滴度×病毒量)/細(xì)胞量。CD4+T細(xì)胞MOI=100,TLV-m-IL-10-3flag-ZsGreen-PURO慢病毒滴度為1×108TU/mL,陰性過表達(dá)對照病毒TLV-ZsGreen-PURO滴度為1×108TU/mL。

將上述細(xì)胞在6孔板中配置2 mL的約2×105個(gè)/孔的T細(xì)胞懸液。把培養(yǎng)板移至培養(yǎng)箱內(nèi),接受24 h 預(yù)培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃)。后續(xù)按照實(shí)驗(yàn)所需分組進(jìn)行IL-10過表達(dá)T細(xì)胞特異性慢病毒侵染,侵染72 h后收樣。轉(zhuǎn)入到提前包被好的anti-CD3的12孔板中,各孔加入anti-CD28稀釋液10 μL。在37 ℃溫箱孵育48 h。后續(xù)進(jìn)行qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,每組各指標(biāo)有2次重復(fù)。

1.3.3 qRT-PCR:根據(jù)試劑盒說明書操作,使用Trizol試劑(Invitrogen)從小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中提取總RNA,使用TB GreenTM Advantage qPCR Premix(Takara)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-定量PCR (qRT-PCR)反應(yīng)。小鼠PCR引物應(yīng)用NCBI網(wǎng)站上的Primer-BLAST工具設(shè)計(jì)。所有的mRNA表達(dá)都應(yīng)用GAPDH基因做內(nèi)參?；蛐蛄幸姳?。qRT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.3.4 T細(xì)胞分化:在96孔板的每孔中,在37 ℃(含5% CO2)的完全1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)初始的CD4+T細(xì)胞(約5×105個(gè)細(xì)胞/孔)。4 h 后,在48孔板中分別使用4種不同的細(xì)胞因子組合將小鼠CD4+T細(xì)胞分化為T細(xì)胞的4種亞群,即Th1、Th2、Th17和Treg。對于Th1細(xì)胞分化,應(yīng)用包被的CD3抗體(1 μg/mL)和可溶性CD28抗體(1 μg/mL)、IL-2(20 ng/mL)、IL-12(50 ng/mL)和抗IL-4抗體(10 ng/mL,BD)培養(yǎng)細(xì)胞72 h。對于Th2細(xì)胞分化,用1 μg/mL包被的CD3抗體、1 μg/mL抗CD28、20 ng/mL IL-2、10 ng/mL IL-4(BD)和10 ng/mL抗IFN-γ處理細(xì)胞72 h。為了使細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞,應(yīng)用包被的CD3抗體(1 μg/mL)和可溶性CD28抗體(0.2 μg/mL)、TGF-β(5 ng/mL)、IL-6(100 ng/mL)、抗IFN-γ(10 ng/mL)、抗IL-4(10 ng/mL)和IL-23(50 ng/mL,BD)培養(yǎng)細(xì)胞72 h。對于調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞,應(yīng)用包被的CD3抗體(1 μg/mL)和可溶性CD28抗體(0.2 μg/mL)、IL-2(20 ng/mL)和TGF-β1(50 ng/mL,BD)培養(yǎng)細(xì)胞72 h。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測:為了進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色,在染色前用細(xì)胞刺激劑(Cell Stimulation Cocktail)加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Protein Transportation Inhibitors,Invitrogen公司)刺激細(xì)胞6 h。為了檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A和Foxp3在CD4+T細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)表達(dá),按照試劑盒的說明,使用細(xì)胞固定/破膜試劑(Invitrogen公司)對細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜(細(xì)胞濃度約0.5×106/孔)。應(yīng)用抗CD4(貨號552051)和抗CD3抗體(貨號562286)對細(xì)胞進(jìn)行染色,然后用Invitrogen公司的固定緩沖液在4 ℃暗室中固定30 min。應(yīng)用Invitrogen公司的破膜緩沖液(1x)對細(xì)胞進(jìn)行破膜,然后用標(biāo)記熒光色素的抗IFN-γ(貨號M100I16-09A)、抗IL-4(貨號81112-60-25)、抗IL-17A(貨號1929432)和抗Foxp3(貨號560414)、抗CD25抗體(貨號07312-80-25,BD)染色。用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)對染色細(xì)胞進(jìn)行檢測,用FlowJo X軟件(Tree-star,Inc.)分析結(jié)果。

1.4 IL-10抑制后檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的基因和蛋白水平表達(dá):準(zhǔn)備48孔板,將上述磁珠分選后得到的小鼠脾臟naive CD4+T細(xì)胞懸液(每孔細(xì)胞密度約0.5×107個(gè)/mL)進(jìn)行標(biāo)記,分別為陰性對照組,IL-10抑制組(siRNA基因干擾組)。由上海吉瑪基因合成3個(gè)IL-10干擾片段,分別為IL-10-mus-217(貨號 51562)、IL-10-mus-304(貨號 51563)、IL-10-mus-490(貨號51564)、相應(yīng)陰性對照(NC),基因序列見表2。

表2 IL-10抑制片段引物序列

取2支PCR管,標(biāo)記為IL-10基因干擾組和陰性對照組(NC),各加入RPMI1640培養(yǎng)基(無血清) 50 μL,稀釋好的IL-10基因干擾片段(150 nmol) 或陰性對照各30 μL,輕輕混勻,再各加入Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN公司,貨號301705)10 μL,輕輕混勻,室溫放置10 min 以上。將上述IL-10基因干擾片段和相應(yīng)陰性對照加入48孔板對應(yīng)各孔細(xì)胞懸液中,放入37 ℃培養(yǎng)箱(5% CO2)中培養(yǎng)4 h 進(jìn)行下一步操作。將上述48孔板中細(xì)胞,加入含10%FBS 1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基330 μL,轉(zhuǎn)入到提前包被好的anti-CD3的24孔板中,加入anti-CD28稀釋液10 μL。置于37 ℃溫箱孵育48 h。后續(xù)進(jìn)行qRT-PCR和流式細(xì)胞檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的表達(dá),檢測方法同上。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,每次實(shí)驗(yàn)指標(biāo)2次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 IL-10過表達(dá)后熒光定量PCR檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3 mRNA表達(dá):與陰性對照組(OE-NC)比較,IL-10過表達(dá)組(OE-IL-10)IFN-γ、IL-4、IL-17A mRNA表達(dá)下降(P<0.05),Foxp3 mRNA表達(dá)上升(P<0.05),見表3。

表3 熒光定量PCR檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3 mRNA表達(dá)

2.2 IL-10過表達(dá)后流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的分泌比率:與陰性對照組(OE-NC)比較,IL-10過表達(dá)組(OE-IL-10)IFN-γ、IL-4、IL-17A表達(dá)降低(P<0.05),Foxp3表達(dá)明顯增高(P<0.05),見表4(目次后)。

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的分泌比率

2.3 IL-10抑制(siRNA片段干擾)的效果:小鼠naive CD4+T細(xì)胞分別用150 nmol的IL-10-mus-217、IL-10-mus-304、IL-10-mus-490干擾片段轉(zhuǎn)染后,熒光定量PCR檢測IL-10的表達(dá)。與陰性對照組比較,IL-10-mus-217轉(zhuǎn)染組IL-10 mRNA表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。IL-10-mus-304轉(zhuǎn)染組IL-10 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)。IL-10-mus-490轉(zhuǎn)染組的IL-10 mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。IL-10-mus-217對IL-10抑制效果最好,后續(xù)將應(yīng)用IL-10-mus-217進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見表5。

表5 IL-10抑制(siRNA片段干擾)的效果

2.4 IL-10抑制后對IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3 mRNA表達(dá)的影響:與陰性對照組比較,IL-10抑制組IFN-γ、IL-17A mRNA表達(dá)明顯上升(P<0.05),見表6。

表6 IL-10抑制后對IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-10抑制后IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的表達(dá):與陰性對照組比較,IL-10抑制組IFN-γ、IL-17A表達(dá)升高(P<0.05),見表7,圖1至圖4(目次后)。

表7 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-10抑制后IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的表達(dá)

3 討論

CD4+T細(xì)胞作為輔助型T淋巴細(xì)胞,包括Th1、Th2、Th17、Treg等亞群,分別主要分泌IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3等細(xì)胞因子,在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群中利用T細(xì)胞特異性慢病毒過表達(dá)IL-10后,在基因水平明顯降低了IFN-γ、IL-17A、IL-4的表達(dá),明顯升高了Foxp3的基因表達(dá),同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測到明顯降低的IFN-γ、IL-17A、IL-4的分泌,明顯升高的Foxp3的表達(dá),表明IL-10能夠使Th1、Th2及Th17亞群的免疫反應(yīng)減弱,對Treg細(xì)胞Foxp3的分泌具有促進(jìn)作用,在基因和蛋白水平驗(yàn)證了IL-10對CD4+T細(xì)胞亞群分化的影響。通過siRNA片段抑制IL-10后,在基因水平明顯升高IFN-γ、IL-17A的表達(dá),但對IL-4和Foxp3影響不顯著,同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測到明顯升高的IFN-γ、IL-17A分泌水平,但對IL-4和Foxp3影響不明顯。提示IL-10對IFN-γ、IL-17A的表達(dá)起反向調(diào)控作用。

IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子及免疫抑制因子,是免疫系統(tǒng)對微生物抗原反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子。盡管先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的幾乎所有細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-10,但T細(xì)胞在許多情況下構(gòu)成了IL-10的重要來源,主要由Th2和Treg細(xì)胞產(chǎn)生。IL-10 對于分泌Th17 和 Th1 亞群的標(biāo)志性因子IL-17A和IFN-γ的CD4+T細(xì)胞具有抑制作用[4],本研究在小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中通過IL-10的過表達(dá)和抑制進(jìn)一步明確了以上結(jié)論。IL-10通過調(diào)節(jié)機(jī)體過度活化的自身免疫性疾病的過度免疫反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的保護(hù)作用。IL-10產(chǎn)生的水平?jīng)Q定免疫調(diào)節(jié)和炎癥與體液反應(yīng)之間的平衡。IL-10發(fā)現(xiàn)的早期,它是由Th2細(xì)胞所產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子,并且能抑制Th1細(xì)胞的功能[5]。IL-10不但能阻止某些細(xì)胞因子產(chǎn)生,還能促進(jìn)某些細(xì)胞因子分泌和某些共刺激分子的共同表達(dá),諸如CD80、CD86和MHC Ⅱ類分子等[6]。IL-10可以和表達(dá)于大部分免疫細(xì)胞的IL-10Rα及IL-10Rβ受體相結(jié)合,調(diào)節(jié)多種固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞引起各種不同的免疫病理反應(yīng),諸如誘導(dǎo)Treg細(xì)胞和Tr1細(xì)胞,或者在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中發(fā)揮自分泌抑制效應(yīng)[7]。本研究在小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中應(yīng)用過表達(dá)IL-10驗(yàn)證了對Treg細(xì)胞中Foxp3的促進(jìn)作用。IL-10作為Th2型細(xì)胞因子,抑制Th1型免疫反應(yīng),同時(shí)抑制IL-4的分泌,與體內(nèi)的超敏反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘、炎癥性腸病等密切相關(guān),也可以用來治療某些自身免疫性和炎癥性疾病[8-9]。本研究通過在小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中對IL-10的抑制和過表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了IL-10對IFN-γ和IL-4的抑制作用。IL-10和IL-10R2小鼠具有明顯的Th1極化反應(yīng),并且易患炎癥性腸病,表明IL-10通過抑制Th1亞群在炎癥性腸病等免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[10-11]。

在病原體對宿主的免疫活動(dòng)中,IL-10發(fā)揮的作用至關(guān)重要。IL-10不但在宿主與病原體免疫平衡中具有調(diào)節(jié)作用,并且參與在巨噬細(xì)胞對抗病原體所起的抑制作用過程,從而有利于細(xì)胞內(nèi)病原體的生存。在病原體感染過程中,降低的IFN-γ水平與升高的IL-10水平有利于病原體逃避宿主的免疫攻擊,導(dǎo)致病原體在體內(nèi)持續(xù)生存[12-14]。在沒有強(qiáng)化的免疫病理反應(yīng)的情況下,IL-10水平降低導(dǎo)致一些病原體更好地被清除[15]。對IL-10缺陷的研究,包括在小鼠中IL-10基因的抑制或者通過抗體阻斷IL-10受體,大多數(shù)情況下有利于病原體在細(xì)胞內(nèi)被控制和清除[16-17]。IL-10缺陷導(dǎo)致適應(yīng)性免疫反應(yīng)增強(qiáng),CD4+T細(xì)胞中Th1亞群的標(biāo)志性因子IFN-γ產(chǎn)生增多,正常的促炎反應(yīng)被強(qiáng)化,有利于病原體感染的控制[18-20]。IL-10的分泌增多擾亂機(jī)體對病原體的炎癥反應(yīng)和適應(yīng)性免疫,為病原體提供持續(xù)生存的溫床[21]。

綜上所述,IL-10已成為免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,是炎癥性疾病和感染性疾病的關(guān)鍵刺激因子,發(fā)揮作用具有多效性和雙重性,需要對其生物學(xué)功能和相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)一步深入探索。過表達(dá)IL-10后引起CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、IL-17A的基因和蛋白水平的明顯降低。抑制IL-10后引起CD4+T細(xì)胞中IFN-γ和IL-17A的基因和蛋白水平明顯升高。IL-10調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答,特別是反向調(diào)控CD4+T細(xì)胞中Th1、Th17亞群中的IFN-γ、IL-17A因子,在機(jī)體促炎和抗炎過程中發(fā)揮重要作用。