黃冠又　葛學成　甘鴻川　郝淑煜　吳震

摘要：目的 探討趨化因子配體18（CCL18）在膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）中的表達與GBM臨床預后的關系以及對U87MG細胞增殖和遷移的影響。方法 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型-組織表達（GTEx）數(shù)據(jù)庫中GBM和正常腦組織數(shù)據(jù)，分析CCL18在GBM與正常腦組織中的表達差異，采用免疫組織化學染色進行驗證。應用Kaplan-Meier生存分析、單因素和多因素Cox回歸分析評估CCL18對GBM患者預后的影響?；诙嘁蛩谻ox回歸模型構建生存列線圖，繪制校準曲線和受試者工作特征（ROC）曲線進行驗證。將人膠質(zhì)母細胞瘤U87MG細胞分為siRNA-CCL18組、siRNA-NC組和Mock-siRNA組，采用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測細胞中CCL18 mRNA表達，CCK-8法和細胞劃痕愈合實驗檢測U87MG細胞的增殖和遷移能力。結果 TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，GBM組織中CCL18基因表達水平高于正常腦組織；免疫組織化學染色結果顯示，GBM組CCL18陽性表達率高于對照組（P＜0.05）。CCL18高表達組患者預后較低表達組差（P＜0.01）。Cox回歸分析結果顯示，IDH野生型和CCL18高表達是GBM患者死亡的獨立危險因素（P＜0.05）。校準曲線顯示列線圖預測模型與實際生存有較好一致性，ROC曲線表明該模型對GBM患者生存概率有較好預測能力。siRNA-CCL18組CCL18 mRNA表達水平、細胞增殖（48 h、72 h和96 h）和遷移能力（24 h）均低于siRNA-NC組和Mock-siRNA組（P＜0.05）。結論 CCL18在GBM中表達上調(diào)，可促進GBM腫瘤細胞增殖和遷移，且可導致患者預后不良。

關鍵詞：膠質(zhì)母細胞瘤；趨化因子CCL18；細胞增殖；細胞運動；預后

中圖分類號：R739.41文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221791

Expression of CCL18 in glioblastoma and its effect on proliferation and migration of

human U87MG cells

HUANG Guanyou GE Xuecheng GAN Hongchuan HAO Shuyu WU Zhen

1 Department of Neurosurgery， the Second Peoples Hospital of Guiyang， Guiyang 550081， China; 2 Department of Neurosurgery， Beijing Tiantan Hospital， Capital Medical University

Corresponding Author E-mail： wuzhen1966@aliyun.com

Abstract： Objective To analyze the expression chemokine （C-C motif） ligand 18 （CCL18） on the clinical prognosis of glioblastoma （GBM） and its effects on the proliferation and migration of U87MG cells. Methods The differential expression of CCL18 gene in GBM and normal brain tissue was analyzed based on the GBM data from Cancer Genome Atlas （TGGA） database and the normal brain tissue data from Genotype-Tissue Expression （GTEx） database. Immunohistochemical staining was used to verification. Kaplan-Meier survival analysis， univariate and multivariable Cox regression analysis were used to evaluate the impact of CCL18 expression on the prognosis in GBM patients. A nomogram was established based on the results of multivariate Cox analysis. The calibration curve and receiver-operating characteristic （ROC） curve were draw for validation. Human glioblastoma U87MG cells were divided into the siRNA-CCL18 group， the siRNA-NC group and the Mock-siRNA group. qPCR was used to detect the content of CCL18 mRNA in the different U87MG cell groups. The CCK-8 assay and cell scratch test were used to detect the cell proliferation and migration ability of U87MG cells in each group. Results CCL18 was significantly upregulated in GBM tissue （P＜0.05）. The immunohistochemistry results suggested that CCL18 protein was significantly increased in GBM tissue （P＜0.05）. Survival analysis indicated that high expression of CCL18 was associated with poor prognosis in GBM patients （P＜0.05）. Multivariate Cox regression analysis revealed that IDH wild-type and high level of CCL18 expression were the two major risk factors affecting the poor prognosis of GBM （P＜0.05）. The calibration curve showed that the actual survival rate of patients was consistent with the predicted survival rate. The ROC curve demonstrated that the model had a good predictive for predicting the survival of GBM patients. siRNA reduced the expression of CCL18 in human U87MG cells. The results of CCK-8 assay showed that the proliferation of U87MG cells was significantly inhibited （P＜0.05）， and the wound healing scratch ability of U87MG cells with low expression of CCL18 decreased （P＜0.01）. Conclusion CCL18 is over-expressed in GBM tissue， and high CCL18 expression is associated with poor prognosis in GBM patients．CCL18 promotes GBM cell proliferation and migration and may act as a relevant predictive biomarker for GBM.

Key words： glioblastoma; chemokine CCL18; cell proliferation; cell movement; prognosis

多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腦腫瘤，其惡性程度和復發(fā)率較高，患者生存期短［1］。傳統(tǒng)的手術切除結合術后同步放化療及替莫唑胺輔助化療方案對改善GBM患者預后效果不佳，其中位生存期僅15個月［2］。有研究表明，GBM進展迅速，且異質(zhì)性顯著［3］，趨化因子與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關［4］。GBM的腫瘤微環(huán)境中有大量的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞浸潤，能進一步增強GBM的侵襲性以及促進抑制性免疫微環(huán)境的形成［5］。C-C趨化因子配體18（chemokine CC-motif ligand 18，CCL18）是趨化因子配體家族成員之一，主要由腫瘤相關巨噬細胞分泌，可促進腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）和自我更新能力，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［6］。研究表明，CCL18在乳腺癌［6］、肺癌［7］、口腔鱗癌［8］等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，但關于CCL18在GBM中表達及其對GBM細胞增殖和侵襲的影響尚鮮見報道。本研究通過生物信息學方法和免疫組織化學染色檢測分析CCL18在GBM中的表達及其對U87MG細胞增殖和遷移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫資料和分組 利用UCSC XENA（https：//xenabrowser.net/datapages/）從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov）數(shù)據(jù)庫和基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）中提取有關GBM的基因表達譜（RNA-Seq）數(shù)據(jù)。經(jīng)Toil流程［9］標準化處理后分別得到168例GBM患者的RNA-Seq數(shù)據(jù)和臨床資料以及1 157例正常腦組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)。GBM患者納入標準：（1）病理學診斷為GBM；（2）具有CCL18基因數(shù)據(jù)的樣本。排除臨床資料不全者。

患者臨床信息資料，包括性別、年齡、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）狀態(tài)、Karnofsky功能狀態(tài)評分（Karnofsky performance scale，KPS）［10］等?？偵嫫冢╫veral survival，OS）指從患者病理確診之日起至患者死亡或末次隨訪的生存時間；無進展生存期（progression free survival，PFS）是指患者接受治療開始到出現(xiàn)腫瘤復發(fā)或死亡的時間。

1.2 臨床標本資料 選擇2020年1月—2021年8月于貴陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科行手術治療的GBM患者（GBM組）45例，其中男25例，女20例，年齡29～79歲，平均年齡（56.06±10.05）歲；另選擇2021年1—5月同科收治的重型顱腦損傷患者15例為對照組，其中男9例，女6例，年齡30～76歲，平均年齡（53.43±9.35）歲；2組患者性別（χ²=0.090）和年齡（t=0.974）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。GBM組納入標準：（1）有完整的臨床病史記錄、影像學及圍手術期資料。（2）行常規(guī)開顱顯微手術切除腫瘤，腫瘤切除程度有明確的手術記錄。（3）根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤第五版分類標準［11］診斷為GBM，并經(jīng)術后病理確診。（4）術前均未接受過放化療和靶向治療。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準（批準號：2021倫審第53號），獲患者或法定代理人知情同意并簽署知情同意書。

1.3 材料、試劑和儀器 人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG購自中國科學院上海細胞庫；兔抗人CCL18單克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；標準胎牛血清、胰酶、乙二胺四乙酸購自美國Gibico公司；RNA提取試劑盒、SYBR Green熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博生物科技有限公司；CCL18小干擾RNA（CCL18-siRNA）、陰性對照RNA由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。紫外分光光度計、CO2培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技有限公司；全自動輪轉(zhuǎn)式切片機購自德國Leica公司；酶標分析儀（ELx808）購自美國BioTek公司；qPCR儀購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡（CKX41）購自日本奧林巴斯公司；臺式低速離心機購自德國Sigma公司。

1.4 免疫組織化學染色檢測CCL18在GBM中的表達 膠質(zhì)母細胞瘤標本于腫瘤處取材，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)二甲苯、無水乙醇脫蠟，PBS沖洗3次，切片置于檸檬酸修復液（pH=6.0）中修復，3%H2O2封閉20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗玻片3次，每次5 min。加入CCL18抗體（1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG二抗（1∶500稀釋），室溫孵育1 h，DAB顯色3 min，蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復染1 min，流水反藍10 min，中性樹脂封片，顯微鏡下拍照。結果判定：陽性染色以細胞膜或細胞漿中出現(xiàn)褐色或棕黃色顆粒為準，400倍鏡下隨機讀取3個視野計數(shù)陽性表達細胞數(shù)。染色程度評分由弱到強分為陰性（0分）、弱陽性（1分）、陽性（2分）和強陽性（3分），染色范圍評分為0（0分）、1%～25%（1分）、26%～50%（2分）、51%～75%（3分）和76%～100%（4分），染色程度評分和染色范圍評分兩者相加得到CCL18表達評分。CCL18表達評分0～5分為低表達，5分以上為高表達。

1.5 細胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 U87MG細胞從液氮中取出，于37 ℃水浴中快速解凍，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的單層細胞，接種至24孔板，接種密度為1×105個/mL，加入胰酶消化細胞和傳代培養(yǎng)，收集生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。當細胞正常生長且匯合度達60%～70%即進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)說明書配制轉(zhuǎn)染混合液，將配制好的riboFECTTM CP混合液加入465.75 μL無雙抗完全培養(yǎng)基（v1）中，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96 h。實驗分為Mock-siRNA組（U87MG細胞轉(zhuǎn)染Mock-siRNA，Mock序列為無義序列）、siRNA-NC組（細胞轉(zhuǎn)染CCL18 siRNA control）、siRNA-CCL18組（細胞轉(zhuǎn)染CCL18 siRNA），各組siRNA序列見表1。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測CCL18 mRNA表達 根據(jù)Trizol法提取各組U87MG細胞的總RNA，用分光光度計檢測RNA濃度和純度。參照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qPCR。qPCR反應體系為25 μL：qPCR SYBR? Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物（0.2 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O調(diào)整至25 μL。qPCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。每個循環(huán)結束時采集熒光強度，根據(jù)熔解曲線讀取參數(shù)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表2。采用2-ΔΔCt法計算CCL18 mRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖 將各組siRNA轉(zhuǎn)染細胞24 h后，棄上清液，PBS清洗，加入胰酶進行消化，離心（800 r/min，5 min）；制成細胞懸液，調(diào)整為5×104個/mL。取96孔板，以100 μL/孔加入細胞懸液（即5 000個細胞/孔），每組不少于5個復孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，取96孔板，更換新鮮培養(yǎng)基，按照實驗分組將配制好的轉(zhuǎn)染混合液加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入10 μL CCK-8工作液孵育1～2 h，采用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度值。

1.8 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 將對數(shù)生長期的各組細胞以1×105個/mL接種于6孔板。37 ℃恒溫孵育過夜。細胞匯合度達100%時，吸棄培養(yǎng)基，使用20 μL的移液槍頭對準標尺劃痕，均勻用力保證劃痕寬度一致。用無菌PBS洗細胞3次，沖洗不貼壁的細胞碎屑，加入無血清培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)0、6、12、24 h，相差顯微鏡下測量細胞遷移的相對距離并拍照。采用Image J軟件分析細胞遷移率。遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.9 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20.0軟件、R語言統(tǒng)計軟件（v 3.6.3）及Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ²檢驗或連續(xù)校正χ²檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P₂₅，P₇₅）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。應用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較不同CCL18表達組患者的生存情況。采用單因素Cox回歸分析影響患者生存的因素，選擇單因素分析結果有意義者進行多因素Cox回歸分析?；诙嘁蛩胤治鼋Y果，通過R軟件rms程序包構建1年、2年和3年生存時間的預測模型，計算模型一致性指數(shù)（C-index），C-index＞0.6，則預測性能良好；并繪制校準曲線和受試者工作特征（ROC）曲線評估模型的預測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCL18在膠質(zhì)母細胞瘤組織中的表達 TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，GBM組CCL18基因表達水平高于對照組（Z=18.619，P＜0.01），見圖1A。免疫組織化學染色結果顯示，GBM組CCL18陽性表達率高于對照組［62.2%（28/45）vs. 6.7%（1/15），χ²=8.789，P＜0.05］，見圖1B—D。

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫中CCL18表達與GBM患者預后的關系 以CCL18相對表達量的中位數(shù)（0.63）為界，將TCGA數(shù)據(jù)庫168例GBM患者均分為CCL18高表達組和低表達組。Kaplan-Meier生存分析顯示，CCL18高、低表達組患者的中位OS分別為12.2個月、16.0個月，中位PFS分別為4.83個月、8.61個月，高表達組患者OS、PFS均較低表達組短（Log-rank χ²分別為7.310、14.611，P＜0.01），見圖2。以患者是否死亡（是=1，否=0）為因變量，以年齡（＞60歲=1，≤60歲=0）、性別（男=1，女=0）、KPS評分（≥80分=1，＜80分=0）、IDH狀態(tài)（突變型=1，野生型=0）、CCL18表達（高表達=1，低表達=0）為自變量，單因素Cox回歸分析結果顯示，IDH狀態(tài)和CCL18表達是GBM患者預后的影響因素，見表3。多因素Cox回歸分析結果顯示，IDH野生型和CCL18高表達是GBM患者死亡的獨立危險因素，見表4。

2.3 列線圖模型建立和驗證 基于多因素Cox回歸分析得出2個獨立危險因素，構建影響患者生存預后的列線圖預測模型，見圖3。采用Bootstrap法對列線圖進行內(nèi)部驗證，該模型C-index為0.793（95%CI：0.777～0.803）。Calibration校準曲線顯示列線圖預測GBM患者1年、2年和3年生存概率與實際觀測結果具有較好一致性；列線圖預測GBM患者1年、2年和3年生存概率的ROC曲線下面積（AUC）均大于0.6，見圖4、表5。

2.4 CCL18-siRNA抑制U87MG細胞中CCL18基因表達 siRNA-CCL18組CCL18 mRNA表達水平（0.10±0.04）低于siRNA-NC組（0.60±0.18）和Mock-siRNA組（1.02±0.26），組間差異有統(tǒng)計學意義（F=18.360，P＜0.01）。

2.5 抑制CCL18表達對U87MG細胞增殖和遷移能力的影響 CCK-8實驗結果顯示，siRNA-CCL18組48 h、72 h和96 h的細胞增殖能力均低于siRNA-NC組和Mock-siRNA組（P＜0.05），見圖5。劃痕愈合實驗顯示，siRNA-CCL18組24 h時的細胞遷移能力低于siRNA-NC組和Mock-siRNA組（P＜0.05），12 h時的細胞遷移能力與siRNA-NC組和Mock-siRNA組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6、表6。

3 討論

趨化因子是腫瘤微環(huán)境中的重要調(diào)節(jié)因子，可通過各種機制影響惡性腫瘤的細胞增殖，或間接調(diào)節(jié)血管生成和免疫細胞募集，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［12］。CCL18是趨化因子的重要組成部分，與腫瘤侵襲、遷移和EMT等惡性生物學行為關系密切，在腫瘤進展中起重要作用［13］。Zeng等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，CCL18可通過PITPNM3激活核因子活化B細胞κ輕鏈增強子信號轉(zhuǎn)導，增加白細胞介素（IL）-6和IL-8產(chǎn)生，誘導腫瘤細胞干細胞富集和介導化療耐藥，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另有研究表明，CCL18在膀胱癌中呈高表達，其可通過激活G蛋白偶聯(lián)受體CCR8在腫瘤的依賴性遷移和EMT中發(fā)揮重要作用［15］。另有研究者對胸腺瘤免疫相關microRNA進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，CCL18與miR-425-5p、miR-1370-3p表達呈正相關，且可與CD8、CD68協(xié)同作用影響患者預后［16］。

本研究采用生物信息學分析顯示，GBM組織中CCL18 mRNA水平高于正常腦組織，免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)GBM組織中CCL18表達水平高于正常腦組織，提示CCL18在GBM中發(fā)揮促癌作用。Gao等［17］研究結果表明，CCL18表達與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關，其可作為判斷GBM預后及惡性生物學行為的標志物。本研究通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，CCL18高表達組患者預后較低表達組差；基于TCGA數(shù)據(jù)庫的多因素Cox回歸分析結果顯示，IDH野生型和CCL18高表達是GBM患者死亡的獨立危險因素。有研究證實，缺氧可上調(diào)GBM腫瘤微環(huán)境中PITPNM3受體及CCL18表達，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移［18］。GBM微環(huán)境中，腫瘤組織廣泛缺氧，容易導致化療耐藥，筆者推測缺氧可能是引起CCL18表達升高，導致GBM患者預后較差的原因之一。

本研究根據(jù)篩選出IDH突變狀態(tài)和CCL18表達2個獨立影響因素，構建GBM患者生存預后的列線圖模型，結果顯示C-index為0.793（95%CI：0.777～0.803），校準曲線的預測值與實測值基本一致，列線圖模型的時間依賴ROC曲線AUC值均大于0.6，表明構建的列線圖具有較好的區(qū)分度和精準度，進一步表明CCL18是GBM患者預后的重要影響因素，且其可能為GBM的危險因子之一。

另外，本研究通過體外實驗證實抑制膠質(zhì)母細胞瘤U87MG細胞系CCL18的表達能降低GBM細胞的增殖和遷移能力，與Ma等［19］研究結果類似。膠質(zhì)瘤相關小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞釋放的CCL18在GBM進展過程中起關鍵作用，通過上調(diào)CCL18表達，能激活腫瘤細胞的CCR8受體，介導酸性磷酸酶5信號轉(zhuǎn)導，促進GBM細胞的生長和侵襲［20］。以上結果進一步表明CCL18可調(diào)節(jié)GBM細胞的侵襲及增殖，在GBM進展中發(fā)揮重要作用。

綜上，CCL18在GBM中表達上調(diào)，可促進GBM腫瘤細胞增殖和遷移；CCL18高表達和IDH野生型是GBM患者死亡的獨立危險因素。本研究為GBM的靶向治療提供了新方向。但也存在一些局限性，如生物信息學分析不夠深入，納入影響因素和臨床樣本有限，且未明確CCL18在GBM發(fā)生發(fā)展過程的具體作用機制，有待今后深入探討。

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（2022-11-07收稿 2023-04-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）