崔芬芬　李元敏

摘要：目的 分析二葉式主動脈瓣及三葉式主動脈瓣患者瓣膜中泛素的表達(dá)水平，探討泛素與二葉式主動脈瓣之間的相關(guān)性。方法 收集確診為二葉式主動脈瓣患者15例，同期選擇三葉式主動脈瓣患者15例作為對照組。分別用Western blot及實(shí)時熒光定量PCR檢測2組患者瓣膜中泛素蛋白及mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 Western blot結(jié)果提示2組患者瓣膜組織均未顯示任何陽性信號帶，但2組患者瓣膜中均存在泛素mRNA的表達(dá)，且二葉式主動脈瓣患者泛素mRNA的表達(dá)水平降低（P＜0.01）。結(jié)論 二葉式主動脈瓣中泛素mRNA表達(dá)下調(diào)，推斷泛素可能在二葉式主動脈瓣的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

關(guān)鍵詞：泛素；主動脈疾病；主動脈瓣關(guān)閉不全；二葉式主動脈瓣；三葉式主動脈瓣

中圖分類號：R654.27文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221322

Expression and clinical significance of ubiquitin in patients with bicuspid aortic valve

CUI Fenfen， LI Yuanmin

Department of Cardiovascular Surgery， the First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China

Corresponding Author E-mail： ldyylym@163.com

Abstract： Objective To analyze the expression of ubiquitin in patients with bicuspid aortic valve （BAV） and tricuspid aortic valve， and to explore the correlation between ubiquitin and BAV. Methods Fifteen patients with BAV were collected， and 15 cases with tricuspid aortic valve were used as controls. The protein and mRNA expression of ubiquitin in valves of the two groups were examined by Western blot assay and real-time fluorescence quantitative PCR. Results Western blot assay indicated that there was no positive signal band in valve tissue in patients of the two groups. However， the mRNA expression of ubiquitin was found in valve of patients with BAV and tricuspid aortic valve. The mRNA expression of ubiquitin was significantly lower in patients with BAV than that of the control group （P＜0.01）. Conclusion Ubiquitin mRNA expression is significantly down-regulated in BAV， which suggests that ubiquitin might play a role in the development and progression of BAV.

Key words： ubiquitin; aortic diseases; aortic valve insufficiency; bicuspid aortic valve; tricuspid aortic valve

二葉式主動脈瓣（bicuspid aortic valve，BAV）是較常見的先天性瓣膜病，發(fā)病率占總?cè)丝诘?%～2%，常見于男性患者，易并發(fā)主動脈瓣狹窄及關(guān)閉不全、感染性心內(nèi)膜炎、升主動脈瘤及主動脈夾層等［1-2］。目前BAV的診斷及外科治療方法已經(jīng)明確，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）作為真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，不僅清除損傷或陳舊的蛋白質(zhì)，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，UPS在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如心肌?。?-4］、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。?］、肺動脈高壓［6］、心力衰竭［7-8］、高血壓［9］等。目前有關(guān)BAV患者泛素水平變化少見相關(guān)報道。本研究通過檢測BAV患者瓣膜組織中泛素的表達(dá)水平，旨在探討泛素與BAV之間的相關(guān)性及BAV可能的發(fā)病機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 選取2022年3月—2023年2月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院心血管外科確診為BAV的患者15例為BAV組。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）影像學(xué)（超聲心動圖檢查或者其他影像學(xué)資料）和（或）手術(shù)確診為BAV。（2）無其他器官或系統(tǒng)畸形。選取同期經(jīng)我科證實(shí)為三葉式主動脈瓣（trilobated aortic valve，TAV）患者15例為TAV組。合并主動脈疾病定義為：主動脈直徑≥40 mm。BAV組男12例，女3例，年齡16～64歲，主動脈瓣狹窄（aortic valve stenosis，AS）4例，主動脈瓣關(guān)閉不全（aortic valve insufficiency，AI）11例，合并主動脈疾病者11例。TAV組男11例，女4例，年齡36～64歲，AS 4例，AI 11例，合并主動脈疾病者8例。2組患者年齡［52（36，58）歲vs. 57（53，63）歲，Z=1.662，P＞0.05］、性別（P=1.000）以及是否合并AS（P=1.000）、AI（P=1.000）、主動脈疾?。≒=0.450）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以上主動脈瓣組織由行主動脈瓣置換手術(shù)的患者中獲得，于-80 ℃冰箱中凍存。研究經(jīng)倫理委員會審查（倫理號：LDYYLL2021-237），患者或其監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 RIPA裂解液、50×Cocktail蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜0.45 μm、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒β-actin鼠源多克隆抗體、兔抗鼠IgG二抗、RNA提取液等試劑及抗體孵育盒（型號G9055-4）、分析軟件（型號AIWBwellTM）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司，鼠抗人泛素單克隆一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。臺式高速冷凍型微量離心機(jī)（型號D3024R）購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司，熒光定量PCR儀（型號CFX）購自美國Bio-Rad公司，超微量分光光度計（型號NanoDrop2000）購自美國賽默飛公司，PCR儀（型號東勝龍ETC811）購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 Western blot檢測瓣膜組織泛素蛋白的表達(dá) 取出凍存組織，預(yù)冷的4 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，加入蛋白酶抑制劑及裂解液，勻漿、震蕩、離心，取上清液，BCA蛋白檢測試劑盒測定濃度。10% SDS-PAGE，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗（1︰1 000）及相應(yīng)二抗（1︰5 000），37 ℃孵育2 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，AIWBwellTM分析軟件計算灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）檢測泛素mRNA表達(dá) 采用RNA提取液提取凍存組織中總RNA，取10 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，選甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系（15 μL）：2× qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物（上游+下游）1.5 μL，cDNA2.0 μL，Water Nuclease-Free 4 μL。泛素引物：上游5′-GTGACCCTCCAGCACAATG-3′，下游5′-GGGGTCATCTGGGTTTGG-3′，產(chǎn)物大小311 bp。GAPDH引物：上游5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，下游5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′，產(chǎn)物大小168 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以2-ΔΔCt法計算泛素mRNA相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，滿足正態(tài)分布的計量資料用x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布的采用M（P₂₅，P₇₅）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用例表示，組間比較采用確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者心臟瓣膜中泛素蛋白的表達(dá)水平 Western blot結(jié)果提示2組患者心臟瓣膜中均未顯示任何陽性信號帶，見圖1。

2.2 2組患者心臟瓣膜中泛素mRNA的表達(dá)水平 BAV組與TAV組相比，主動脈瓣膜中泛素mRNA水平下降［0.47（0.17，0.61）vs. 1.15（0.78，1.35），n=15，Z=3.505，P＜0.01］。

3 討論

BAV是最常見的先天性瓣膜疾病，具有顯著的形態(tài)學(xué)表型異質(zhì)性，典型的二葉瓣是由2個大小不等的瓣葉組成，較大的瓣葉由于瓣葉接合處融合而形成的嵴線，與其他瓣膜疾病相比，BAV極易合并瓣膜狹窄、關(guān)閉不全、感染性心內(nèi)膜炎及二瓣化主動脈疾病。本研究結(jié)果證實(shí)，BAV以男性多見，且易合并主動脈瓣功能異常及主動脈疾病，與國內(nèi)外研究結(jié)果相仿［1-2，10-11］。BAV不僅是瓣膜發(fā)生起源異常，更是一種復(fù)雜的心臟大血管遺傳性疾病。

UPS是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與許多的生物活動，如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、損傷修復(fù)、異常蛋白代謝、抗原提呈及細(xì)胞受體功能等。相對于其他領(lǐng)域，UPS的心臟調(diào)節(jié)功能更具復(fù)雜性。如美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)UPS功能異常可引起健康豬的心功能障礙［12］。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)在注射鏈霉素導(dǎo)致的糖尿病性心肌損傷小鼠中，心肌UPS出現(xiàn)異常［13］。圣保羅大學(xué)的研究者指出，在膿毒癥導(dǎo)致的嚴(yán)重心肌損傷中，UPS活性受到抑制［14］。但目前有關(guān)心臟瓣膜疾病中泛素水平的變化尚不清楚。本研究試圖探討人心臟瓣膜組織中是否存在泛素表達(dá)，首先使用Western blot技術(shù)對主動脈瓣組織進(jìn)行泛素蛋白表達(dá)水平的測定，結(jié)果顯示2組主動脈病變患者均未見任何陽性帶信號。筆者認(rèn)為該結(jié)果可能為泛素蛋白含量極低造成，故筆者采用更靈敏的方法，即在轉(zhuǎn)錄水平上尋找泛素的表達(dá)情況，結(jié)果顯示主動脈瓣膜病變患者中存在泛素mRNA的表達(dá)。

目前，BAV的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能涉及多基因遺傳、外界環(huán)境及其他隨機(jī)因素。本研究試圖通過分析泛素mRNA與BAV之間的相關(guān)性，進(jìn)一步探討B(tài)AV可能的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BAV組泛素mRNA的表達(dá)水平較TAV組下降，提示泛素的表達(dá)下調(diào)可能在BAV的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。胚胎時期心房、心室及流出道處的細(xì)胞外基質(zhì)增厚形成原始心內(nèi)膜墊并伴隨心內(nèi)膜細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而后在神經(jīng)嵴細(xì)胞的參與下，心內(nèi)膜墊流出道發(fā)育成主動脈瓣及肺動瓣，若干擾上述過程，瓣葉基質(zhì)不能正常分隔則會形成BAV［15］。盡管關(guān)于泛素與BAV之間的相關(guān)性研究相對較少，但作為UPS的其他參與組分，E3泛素連接酶SMURF1參與哺乳動物的心臟發(fā)育過程，而且在流出道間充質(zhì)中高度表達(dá)［16］。另一個相關(guān)基因泛素融合降解１樣基因在胚胎時期的心臟流出道中表達(dá)異常，同時在外胚層衍生結(jié)構(gòu)（包括神經(jīng)嵴細(xì)胞）的發(fā)育中起著重要作用［17］。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)下調(diào)與BAV的產(chǎn)生有關(guān)［18-19］。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推斷泛素可能會影響流出道及神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控BAV的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，BAV中泛素mRNA表達(dá)降低，泛素可能在BAV的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。同時本研究也提示針對人體瓣膜組織泛素表達(dá)水平的檢測，若泛素蛋白檢測陰性，加做泛素mRNA檢測可大大增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

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（2022-09-06收稿 2023-04-24修回）

（本文編輯 李鵬）