謝 震,趙 健,吳 娟,王雅麗,馬麗霞,趙彩粉

0 引 言

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMS)是一種慢性婦科疾病,其特征是存在植入子宮外的子宮內(nèi)膜樣組織,最常見(jiàn)于盆腔腹膜和卵巢。這些雌激素依賴性異位植入物是一種良性炎癥性疾病,但影響全球高達(dá)10%的育齡婦女,可導(dǎo)致痛經(jīng)和不孕等癥狀[1-3]。目前,EMS的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō),其中月經(jīng)逆行學(xué)說(shuō)被普遍認(rèn)為是導(dǎo)致EMS形成的主要原因,即子宮內(nèi)膜碎片通過(guò)月經(jīng)逆行在盆腔或盆腔外不同的表面植入并異位生長(zhǎng)。然而,有證據(jù)表明約90%的女性會(huì)發(fā)生月經(jīng)逆行現(xiàn)象,但大約只有10%的女性會(huì)患有EMS,表明其還需要其他致病因素如炎癥、氧化應(yīng)激和表觀遺傳變化的參與,而這些因素會(huì)影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、粘附和侵襲[4]。MicroRNA (miRNA)是一種內(nèi)源性小的單鏈非編碼RNA,長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸,可與靶mRNA的互補(bǔ)序列結(jié)合,以阻斷翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性[5]。MiR-151在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程扮演抑癌基因的作用,Zhang等[6]研究顯示,miR-151-3p可抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT);Chen等[7]研究稱,miR-151-3p可抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲[7]。眾所周知,細(xì)胞遷移和侵襲在EMS發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[8],但具體作用機(jī)制尚不明確,而miR-151-3p在EMS患者子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)水平以及其對(duì)宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells,ESCs)的遷移和侵襲還有待于研究。為此,本研究檢測(cè)EMS患者子宮內(nèi)膜組織中miR-151-3p表達(dá)情況,并分析了miR-151-3p對(duì)ESCs細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的影響,旨在為臨床治療EMS提供更多的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集2018年3月至2020年12月在本院婦科行手術(shù)治療的EMS患者組織87份,根據(jù)發(fā)病部位分為在位子宮內(nèi)膜組(eEMS組)和異位子宮內(nèi)膜組(nEMS組),同時(shí)選取47份因子宮肌瘤等良性婦科疾病進(jìn)行手術(shù)治療的患者正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑引物序列、mimics NC、miR-151-3p mimics、inhibitors NC和miR-151-3pinhibitors均由蘇州金唯智公司設(shè)計(jì)和合成;DMEM/F12和Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海新貝生物科技有限公司;miRNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;I型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;GAPDH、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;二抗購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;人波形蛋白、人角蛋白單克隆抗體和熒光二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 ESCs細(xì)胞提取、分離、培養(yǎng)及鑒定取子宮內(nèi)膜組織清洗剪碎,加入含有I型膠原酶(1 mg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育消化50 min。使用400目濾膜過(guò)濾分離的ESCs細(xì)胞,隨后離心收集細(xì)胞,加入含有10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱。將ESCs細(xì)胞接種于放有蓋玻片的六孔板中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基,加入4%甲醛固定30 min,再加1% NP-40處理5 min,用5% BSA室溫孵育1 h,接著加人波形蛋白(vimentin)和人角蛋白(keratin)單抗,4 ℃過(guò)夜。次日,加入相應(yīng)的熒光二抗,室溫孵育1 h。最后加入80 μL DAPI,孵育20 min。滴加放淬滅劑封片,放于倒置熒光顯微鏡觀察拍照,以人波形蛋白陽(yáng)性且人角蛋白陰性的細(xì)胞鑒定為ESCs細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組將ESCs細(xì)胞以3×105個(gè)/每孔接種到6孔板上,每孔加2 mL含10% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),將ESCs細(xì)胞進(jìn)行分組:mimics NC組、miR-151-3p mimics組、inhibitors NC組和miR-151-3pinhibitors組。待細(xì)胞豐度達(dá)到80%時(shí),依照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,將miR-151-3p mimics、mimics NC、miR-151-3p inhibitors和inhibitors NC轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的細(xì)胞中,48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)采用TRIzol法提取子宮內(nèi)膜組織及各組細(xì)胞內(nèi)總RNA,然后用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,隨后依照miRNA熒光定量PCR試劑盒反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所用引物序列如下:miR-151-3p上游5′-GGATGCTAGACT GAAGCTCCT-3′,下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游5′-CTCGCTTC GGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-151-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后ESCs細(xì)胞以5×103個(gè)/每孔接種到96孔板中,分別培養(yǎng)24、48和72 h后,每孔加10 μL CCK-8溶液,接著培養(yǎng)4 h 。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的A值,并以A450值表示細(xì)胞增殖活性。

1.7 Transwell檢測(cè)遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染后ESCs細(xì)胞,用無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸,其密度為1×105個(gè)/mL,加200 μL細(xì)胞懸液至Transwell小室的上層,同時(shí)加500 μL含10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基至小室下層,培養(yǎng)24 h。取出小室,多聚甲醛固定下層細(xì)胞,結(jié)晶紫染色,用載玻片固定小室中的膜后,顯微鏡觀察,每組隨機(jī)選取5個(gè)視野拍片,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn):提前將用無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)基稀釋的Matrigel膠(1 mg/mL)加到小室上層,隨后步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)提取各組總蛋白并用考馬斯亮藍(lán)法定量。取等量蛋白用10% SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,以1∶1000的稀釋比例加入GAPDH、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin抗體4 ℃過(guò)夜,再加二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,最后加ECL曝光顯色。以GAPDH為內(nèi)參,用Image J軟件對(duì)各蛋白進(jìn)行定量分析。

1.9 生物信息學(xué)分析使用miRDB(http://mirdb.org/)、TargetScan7.1(https://www.targetscan.org/vert_71/)及mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/)等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-151-3p下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并使用String(http://string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異基因的PPI分析,篩選出關(guān)鍵靶基因。

2 結(jié) 果

2.1 EMS患者子宮內(nèi)膜組織中miR-151-3p表達(dá)水平變化qRT-PCR 結(jié)果顯示,與對(duì)照組中miR-151-3P表達(dá)水平(1.02±0.17)相比,eEMS組(0.79±0.21)和nEMS組(0.62±0.15)均明顯降低(P<0.05);與eEMS組相比,nEMS組中miR-151-3P表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組ESCs細(xì)胞中miR-151-3p表達(dá)水平ESCs細(xì)胞分離培養(yǎng),其鑒定結(jié)果顯示,人波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比率>95%,人角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比率<5%,ESCs細(xì)胞分離培養(yǎng)成功。轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,與mimics NC組ESCs細(xì)胞中miR-151-3p表達(dá)水平(1.00±0.02)比較,miR-151-3p mimics組(3.62±0.29)顯著上升(P<0.05),而與inhibitors NC組ESCs細(xì)胞中miR-151-3p表達(dá)水平(0.99±0.09)比較,miR-151-3p inhibitors組(0.17±0.05)顯著降低(P<0.05),細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組ESCs細(xì)胞增殖水平細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h,增殖結(jié)果顯示,與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細(xì)胞增殖水平顯著降低(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,miR-151-3p inhibitors組ESCs細(xì)胞增殖水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖1 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性Figure 1 CCK-8 was used to detect cell proliferation activity in each group

2.4 miR-151-3p表達(dá)水平對(duì)ESCs細(xì)胞遷移和侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,miR-151-3pinhibitors組ESCs細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3。

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細(xì)胞遷移情況;b:各組細(xì)胞遷移數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況Figure 2 Transwell assay was used to detect cell migration in each group

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細(xì)胞侵襲情況;b:各組細(xì)胞侵襲數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析與mimics NC組比較:*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲情況Figure 3 Transwell assay was used to detect cell invasion in each group

2.5 miR-151-3p表達(dá)水平對(duì)ESCs細(xì)胞中MMPs和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,miR-151-3pinhibitors組ESCs細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),miR-151-3pinhibitors組ESCs細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平;b:各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平定量分析與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平Figure 4 Western blot analysis of MMP-2 and MMP-9 protein expression levels in cells of each group

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平;b:各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平定量分析與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平Figure 5 Western blot analysis of the expression levels of E-cadherin, N-cadherin and Vimentin in cells of each group

2.6 miR-151-3p靶基因的預(yù)測(cè)與分析通過(guò)miRDB、TargetScan7.1和mirDIP3大數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的miR-151-3p潛在靶基因分別有220、114和159個(gè),其中三者交集有34個(gè)靶基因。隨后,使用String在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶基因進(jìn)行PPI分析,篩選出RC3H1、AGO2、AGO3和FXR1等4個(gè)關(guān)鍵靶基因。見(jiàn)圖6。

a:在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-151-3p下游靶基因;b:PPI分析圖6 生物信息學(xué)篩選miR-151-3p下游靶基因Figure 6 Bioinformatics screening of downstream target genes of miR-151-3p3

3 討 論

EMS是育齡婦女的一種慢性疾病,其特點(diǎn)是子宮腔外子宮內(nèi)膜樣組織異位生長(zhǎng),導(dǎo)致慢性盆腔疼痛和不孕,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量并給其帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。近年來(lái),已報(bào)道多種miRNA在EMS中表達(dá)異常,并參與子宮內(nèi)膜的異位植入及生長(zhǎng)[9-10]。miR-151-3p參與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,其作為腫瘤抑制因子抑制前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[7,11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-151-3p在EMS患者的eEMS組織和nEMS組織中均低表達(dá),并且在nEMS組織中表達(dá)最低,這提示miR-151-3p的表達(dá)水平可能與EMS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

本研究通過(guò)分離培養(yǎng)ESCs細(xì)胞,將miR-151-3p mimics和miR-151-3p inhibitors轉(zhuǎn)染ESCs細(xì)胞,進(jìn)一步研究miR-151-3p對(duì)ESCs細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的影響。miR-151-3p過(guò)表達(dá)明顯抑制ESCs細(xì)胞的增殖活性,降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力;而抑制miR-151-3p表達(dá)明顯增強(qiáng)ESCs細(xì)胞的增殖活性,促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移。結(jié)果提示,miR-151-3p可能通過(guò)影響ESCs細(xì)胞增殖、侵襲與遷移來(lái)參與EMS的進(jìn)展。

EMS是一種炎癥性疾病,而炎癥的標(biāo)志是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的過(guò)度激活。MMPs作為一類蛋白水解酶,可分解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM),并在生理或病理?xiàng)l件下觸發(fā)ECM重塑過(guò)程。MMPs通過(guò)降解ECM促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲,并廣泛參與血管重塑,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞異位植入和EMS形成。此外研究報(bào)道,MMP-2和MMP-9在EMS患者病變組織和患者的在位子宮內(nèi)膜中表達(dá)上調(diào)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-151-3p過(guò)表達(dá)顯著降低ESCs細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平;而抑制miR-151-3p表達(dá)顯著升高ESCs細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平。

EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成間質(zhì)表型的生物學(xué)過(guò)程,在此過(guò)程中上皮細(xì)胞獲得遷移、侵襲和重新定位的能力,其異常激活是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程的關(guān)鍵因素[8,14-15]。研究報(bào)道,EMT現(xiàn)象普遍存在于EMS病變中,并在子宮內(nèi)膜細(xì)胞異位植入中發(fā)揮重要作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-151-3p過(guò)表達(dá)明顯上調(diào)ESCs細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平,降低N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平;而抑制miR-151-3p表達(dá)明顯降低ESCs細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平,上調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示,miR-151-3p可能通過(guò)影響MMPs和EMT進(jìn)而影響ESCs細(xì)胞的侵襲與遷移。

本研究基于在線miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)miR-151-3p下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并結(jié)合PPI分析篩選關(guān)鍵靶基因,得到RC3H1、AGO2、AGO3和FXR1這4個(gè)關(guān)鍵靶基因。經(jīng)查閱文獻(xiàn),Huang等[17]報(bào)道,LncRNA SNHG11通過(guò)調(diào)節(jié)hsa-miR-184/AGO2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與遷移;Pan等[18]研究顯示,AGO3通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲;Cao等[19]研究發(fā)現(xiàn),FXR1通過(guò)調(diào)節(jié)FBXO4影響前列腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲。因此,miR-151-3p是否通過(guò)這些關(guān)鍵靶基因影響ESCs細(xì)胞的遷移和侵襲還有待于后期研究。

綜上所述,miR-151-3p在EMS患者的eEMS組織和nEMS組織中均低表達(dá),并且在nEMS組織中表達(dá)最低。過(guò)表達(dá)miR-151-3p可以抑制ESCs細(xì)胞的遷移和侵襲。這提示miR-151-3p可能為EMS治療提供新的思路。