朱云娜，楊景輝，王 斌，王玉昆，周裕榮，盧威宇，劉建國(guó)

（廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

【研究意義】菜心（BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）又名菜薹，屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種［1］，是我國(guó)華南地區(qū)種植面積最大的一種薹莖類(lèi)蔬菜。菜心因其生長(zhǎng)周期短、適應(yīng)能力強(qiáng)、復(fù)種指數(shù)高、口感脆嫩、風(fēng)味獨(dú)具一格、營(yíng)養(yǎng)豐富等眾多優(yōu)點(diǎn)，受到消費(fèi)者喜愛(ài)［2］。然而，像其他綠葉蔬菜一樣，菜心對(duì)氮肥需求量大，提高其氮利用率則對(duì)菜心生產(chǎn)具有重要意義［1,3］。已有研究表明，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受蛋白磷酸化調(diào)控，蛋白磷酸化在氮信號(hào)、氮代謝等方面發(fā)揮重要作用［4-5］。因此，揭示蛋白磷酸化機(jī)理對(duì)生產(chǎn)中調(diào)控菜心氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等過(guò)程具有重要的指導(dǎo)意義。CIPK23 激酶已成為根系響應(yīng)各種環(huán)境脅迫的主要樞紐，在提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)方面具有巨大潛力［6-7］。【前人研究進(jìn)展】鈣調(diào)磷酸酶B 類(lèi)似蛋白的互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）是植物特有的一類(lèi)絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，含有N-端激酶催化域和NAF 結(jié)構(gòu)域兩個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域［8］。早在1998 年，Zhu 等［9］采用遺傳篩選和圖位克隆方法大規(guī)模篩選擬南芥鹽過(guò)敏感（Salt overly sensitive）表型突變體時(shí)就發(fā)現(xiàn)了CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)的相關(guān)基因，并命名為SOS1（Na+/H+antiporter）、SOS2（CIPK24）和SOS3（CBL4），三者形成SOS3-SOS2-SOS 復(fù)合體，從而介導(dǎo)植物非生物脅迫應(yīng)答［9-11］。后續(xù)研究證實(shí)了擬南芥中存在一種同源基因，與動(dòng)物與酵母中的CNB（B subunit of calcineurin）和NCS（Neuronal calcium sensor）具有較高相似性，且能夠通過(guò)介導(dǎo)Ca2+來(lái)應(yīng)答鹽等脅迫，因此將該類(lèi)基因命名為CBL（Calcineurin B-like）基因［12-13］。相關(guān)基因家族分析表明，擬南芥中分別有25 個(gè)CIPK和10 個(gè)CBL成員［14］；水稻中分別有30 個(gè)CIPK和10 個(gè)CBL成員［14-15］。此后，在玉米、葡萄、大豆、高粱等物種中也報(bào)道過(guò)不同數(shù)量的CIPK和CBL家族成員［16-19］。除參與高鹽、低溫、干旱等逆境脅迫［20-21］，植物CIPK 成員在調(diào)控礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)方面也具有重要作用［6-7］。前人研究表明，擬南芥CIPK23、CBL1/9受低濃度NO3-誘導(dǎo)表達(dá)，形成CBLCIPK 復(fù)合體調(diào)控硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NPF6.3/NRT1.1（PTR family 6.3/Nitrate transporter 1.1）磷酸化水平，從而促進(jìn)NO3-的吸收與運(yùn)輸［5］；而在高NH4+條件下，擬南芥CBL1 與CIPK23 形成復(fù)合體，通過(guò)調(diào)控銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AMT1.1 和AMT1.2（Ammonium transporter）磷酸化水平，從而影響植株根系對(duì)NH4+的吸收與運(yùn)輸［22］。外界NH4+濃度變化會(huì)引起胞漿游離Ca2+含量變化，影響CBL 蛋白活性，激活的CBL 與激酶CIPK23結(jié)合形成復(fù)合體，將CIPK23 轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，從而調(diào)控AMT1 三聚體的磷酸化水平，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞對(duì)NH4+的吸收［23］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtCIPK23 與菜心BcAMT1.1、BcAMT1.2存在互作［24］；且菜心BcCBL1和BcCBL9表達(dá)受不同氮素形態(tài)響應(yīng)［25］。【本研究切入點(diǎn)】目前，在菜心中關(guān)于CIPK23基因和其功能的研究尚未有相關(guān)報(bào)道，且菜心CIPK23對(duì)不同氮素的響應(yīng)也尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文從菜心中克隆CIPK23，并對(duì)其編碼蛋白的生物學(xué)信息進(jìn)行分析，研究其組織表達(dá)特性以及對(duì)氮源的響應(yīng)，以期為研究菜心CIPK23的生物學(xué)功能以及對(duì)氮素的吸收與運(yùn)輸?shù)忍峁┮欢ǖ睦碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菜心品種為‘油綠501’（來(lái)自廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院），于2021 年3—5 月種植于韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院生態(tài)園玻璃溫室內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織特異性分析 菜心種子用NaClO 消毒后，用無(wú)菌水沖洗干凈，在育苗海綿塊中育苗，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)移栽，待植株種子結(jié)莢后，分別取其根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果等組織［25］。每種組織均設(shè)3 次重復(fù)，所有樣品均用液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 缺氮、供氮處理 菜心移苗后預(yù)培養(yǎng)4 d，用去離子水沖洗植株根系，分別對(duì)植株進(jìn)行缺氮、供氮處理。缺氮處理：將植株移至不含任何氮源的改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液［24］中培養(yǎng)48 h；供氮處理：缺氮處理后，再移栽到0.1、1、4、8 mmol/L NaNO3/NH4Cl 不同氮源營(yíng)養(yǎng)液中處理2 h 后，分別取菜心葉片、根系。所有樣品均設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4～6 株。樣品經(jīng)液氮速凍后，放在-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 總RNA 提取與cDNA 合成 參考Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取樣品總RNA。參考PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑說(shuō)明書(shū)步驟合成cDNA。

1.3 測(cè)試項(xiàng)目及方法

1.3.1 基因克隆 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索擬南芥AtCIPK23基因序列，將該序列在白菜（Brassica rapa）基因組進(jìn)行blast 比對(duì)，獲得同源性最高的CIPK基 因BrCIPK23（XM_009104459.3）序列設(shè)計(jì)引物（CIPK23-F：ATGGCTTCTCGA TCAACAC；CIPK23-R：TCAAGAAGCAGCCACTG CACC），以菜心cDNA 為模板克隆BcCIPK23的CDS 全長(zhǎng)序列。使用TaKaRa 公司的高保真酶Prime STAR Max Premix 克隆目的基因片段，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，與pMD20-T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 利用ExPASY（https://web.expasy.org/）在線網(wǎng)站分析菜心CIPK23編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)，利用SWISS-MODEL 分析其蛋白三維結(jié)構(gòu)，利用NCBI 網(wǎng)站上CDD 在線工具分析其保守結(jié)構(gòu)域，利用STRING（https://string-db.org/）分析其互作蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.3.3 qRT-PCR 檢測(cè) 將各組織或處理的cDNA用RNase-Free ddH2O 稀釋5 倍作為模板，以序列（F: CGCAAGGGTCAGTTAGCAGTT，R: ATCA AGAAGCAGCCACAGTA）為引物，參考TB GreenRPremix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)，利用Bio-RAD 公司的CFX connect TM 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行qRTPCR 檢測(cè)。以GADPH和Actin2作為內(nèi)參基因［25］，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜心BcCIPK23 基因克隆

采用同源克隆方法，以菜心cDNA 為模板，以CIPK23-F、CIPK23-R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到CDS 片段長(zhǎng)度為1 450 bp 左右，電泳圖如圖1 所示。將回收的PCR 產(chǎn)物與T 載體連接進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，所得到的片段長(zhǎng)度為1 449 bp。將該序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該CDS 片段與擬南芥（NM_001332883）、甘藍(lán)（XM_013743437）、白菜（XM_009104459）、甘藍(lán)型油菜（NM_001315872.1）CIPK23核苷酸序列相似，相似率分別為88.41%、96.84%、98.14%和96.82%，表明所克隆的基因?yàn)椴诵腃IPK23，將其命名為BcCIPK23。

2.2 菜心BcCIPK23 編碼氨基酸的生物信息學(xué)分析

2.2.1 菜心BcCIPK23序列及蛋白理化性質(zhì)分析對(duì)所克隆的菜心BcCIPK23序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該基因序列的最大開(kāi)放閱讀框?yàn)? 449 bp，編碼482 個(gè)氨基酸序列。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，BcCIPK23 與白菜、甘藍(lán)型油菜CIPK23 的相似度較高，分別為98.55%、98.76%，而與擬南芥CIPK23 序列的相似性較低、為92.50%（圖2）。

圖2 BcCIPK23 編碼的氨基酸序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of amino acids sequences encoded by BcCIPK23

利用Expasy 在線工具（http://web.expasy.org/）分析結(jié)果表明，BcCIPK23 的分子量為53.41 kD，原子組成為C2379H3824N642O717S16，理論等電點(diǎn)（pI）為9.28，脂肪酸系數(shù)為80.91，不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為32.52，平均親水率為-0.38。這表明菜心BcCIPK23 蛋白是穩(wěn)定的親水性蛋白。利用CELLO v.2.5 在線網(wǎng)站（http://cello.life.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)菜心BcCIPK23 的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，該蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中；通過(guò)TMHMM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0）對(duì)該蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 菜心BcCIPK23 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction transmembrane domain of BcCIPK23 from flowering Chinese cabbage

2.2.2 菜心BcCIPK23 次級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性與磷酸化位點(diǎn)分析 利用SOPMA 對(duì)BcCIPK23 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白包含α-螺旋（Alpha helix）、β-折疊（Extended strand）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）和隨機(jī)卷曲（Random coil），占比分別為39.42%、15.15%、9.96%和35.48%（圖4A）。該蛋白序列主要為α-螺旋和隨機(jī)卷曲，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角散布于蛋白結(jié)構(gòu)。使用SWISSMODEL 在線軟件預(yù)測(cè)菜心BcCIPK23的三級(jí)結(jié)構(gòu)，同源建模結(jié)果顯示如圖4B，結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)類(lèi)似。利用Protscale 預(yù)測(cè)菜心BcCIPK23 的親疏水性，結(jié)果表明該蛋白為親水性蛋白（圖4C）。利用SignalP 5.0 預(yù)測(cè)菜心BcCIPK23 氨基酸序列，結(jié)果表明該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽，為非分泌型蛋白。利用NetPhos 3.1 對(duì)BcCIPK23 潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析表明，該序列包含有多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，最多的磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser）、達(dá)27 個(gè)，其次是蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr）、為19 個(gè)，而酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Tyr）為5 個(gè)（圖4D），這表明BcCIPK23 能夠被絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸激酶磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)其功能調(diào)控。

圖4 菜心BcCIPK23 的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatic analysis of BcCIPK23 from flowering Chinese cabbage

2.2.3 菜心BcCIPK23 保守結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI 網(wǎng)站CCD 在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析BcCIPK23 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖5）顯示，在該蛋白的33～288 位氨基酸區(qū)域是蛋白激酶超家族的STKc-SnRK3 保守結(jié)構(gòu)域；337～452 位氨基酸區(qū)域是CBL 互作蛋白激酶CIPK-C 末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域〔C-terminal regulatory domain of calcineurin B-Like(CBL)-interacting protein kinases〕，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是CIPK 家族蛋白與CBL 蛋白相互作用的部位，屬于腺苷酸激活蛋白激酶超基因家族成員。因此，推測(cè)本研究克隆的菜心BcCIPK23所編碼蛋白具有CIPK 蛋白功能。

圖5 BcCIPK23 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Analysis of conserved domains of BcCIPK23 protein sequences

2.3 菜心BcCIPK23 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將菜心BcCIPK23 與擬南芥、白菜、水稻等植物中的CIPK 家族成員的蛋白序列進(jìn)行Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果（圖6）顯示，菜心CIPK23 與擬南芥、白菜、水稻等物種的CIPK23 成員聚類(lèi)在同一分支中，其中菜心BcCIPK23 與白菜BrCIPK23、擬南芥AtCIPK23 的遺傳距離較近，該分支不包含CIPK家族其他成員，表明植物CIPK23 成員間的進(jìn)化關(guān)系較近、保守性較強(qiáng)。

圖6 菜心BcCIPK23 和其他物種CIPK 成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic analysis of BcCIPK23 in flowering Chinese cabbage and CIPKs in other species

2.4 BcCIPK23 在菜心不同組織器官的表達(dá)分析

由圖7 可知，菜心BcCIPK23在菜心各器官中均有表達(dá)，且在菜心葉、葉柄、薹莖等組織中高表達(dá)，顯著高于在其他組織中的表達(dá)量，但3個(gè)組織間無(wú)明顯差異；該基因在菜心根、莖、花蕾、花、莢果等組織器官中的表達(dá)量較低，僅為葉片表達(dá)量的18.95%～311.93%，菜心BcCIPK23在這些組織中的表達(dá)量無(wú)明顯差別。

圖7 BcCIPK23 在菜心不同組織器官的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of BcCIPK23 in different tissues of flowering Chinese cabbage

2.5 菜心BcCIPK23 對(duì)不同氮源的響應(yīng)

由圖8 可知，無(wú)論在菜心根系還是葉片，BcCIPK23表達(dá)量均受氮源種類(lèi)及濃度的影響。隨著NO3-濃度的增加，BcCIPK23在菜心根系中的表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)，與0.1 mmol/L NO3-處理相比，1～8 mmol/L NO3-處理顯著降低了菜心BcCIPK23表達(dá)量，僅為0.1 mmol/L NO3-處理下表達(dá)量的47.72%～87.43%，但4、8mmol/LNO3-處理之間無(wú)顯著差異（圖8A）；菜心根系中BcCIPK23對(duì)不同濃度NH4+的響應(yīng)呈現(xiàn)出不同趨勢(shì)，與0.1 mmol/L NH4+處理相比，BcCIPK23表達(dá)水平隨NH4+濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，其中BcCIPK23在1 mmol/L NH4+處理下表達(dá)量最高、為0.1 mmol/L NH4+處理的1.14 倍，4、8 mmol/L NH4+處理的菜心BcCIPK23表達(dá)量分別為0.1 mmol/L NH4+處理的75.26%、63.07%（圖8A）。

在菜心葉片中，BcCIPK23表達(dá)量也明顯受不同氮源水平的影響。與0.1 mmol/L NO3-處理相比，1～8 mmol/L NO3-處理可不同程度地降低菜心BcCIPK23的表達(dá)水平，降幅為6.14%～28.40%，其中4 mmol/L NO3-處理與0.1 mmol/L NO3-處理之間差異不顯著（圖8B）；隨著NH4+濃度的增加，BcCIPK23在菜心葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，1～8 mmol/L NO3-處理的菜心BcCIPK23表達(dá)量?jī)H為0.1 mmol/L NO3-處理的39.32%～51.31%（圖8B）。由此可見(jiàn)，菜心BcCIPK23表達(dá)受不同氮水平及氮源種類(lèi)的影響，暗示菜心BcCIPK23基因可能與菜心氮素吸收利用相關(guān)。

2.6 菜心BcCIPK23 互作蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

選用模式植物擬南芥為受體物種，利用STRING 在線軟件繪制了菜心BcCIPK23 蛋白的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果（圖9）表明，菜心BcCIPK23 不僅可與植物類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白（CBL1、CBL2、CBL3、CBL8、CBL9、CBL10）存在互作，還可與鉀離子通道蛋白AKT1、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白POT5、硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NPF6.3、銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AMT1-1 等蛋白存在互作。

3 討論

本研究通過(guò)同源克隆從菜心獲得一個(gè)完整的BcCIPK23基因，其CDS 序列全長(zhǎng)為1 450 bp，編碼482 個(gè)氨基酸殘基。菜心BcCIPK23 具有N-端激酶催化域和NAF 結(jié)構(gòu)域兩個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域，屬于CIPK基因家族成員。這與前人在甘蔗、玉米、葡萄、大豆、高粱中報(bào)道的CIPKs基因結(jié)果［16-19］一致。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析，所有植物CIPK23 成員均聚類(lèi)在同一分支，且該分支不包含CIPK 家族的其他成員，表明植物CIPK23 成員具有較高的保守性，菜心BcCIPK23 與擬南芥AtCIPK23、白菜BrCIPK23 親緣關(guān)系較近，同源性均在92.50%以上。

前人研究表明，多數(shù)CIPKs基因在植物不同組織器官中表達(dá)水平不同，甘蔗SsCIPK23基因在根系中表達(dá)量較高，在葉、莖中表達(dá)量較低［27］；玉米ZmCIPK24-2基因在雄蕊、葉、莖中高表達(dá)，而在玉米其他部位低表達(dá)［28］。本研究中，BcCIPK23在菜心根、莖、葉、葉柄、薹莖、花蕾、花、莢果等組織中均有表達(dá)，但其在菜心葉片、葉柄、薹莖等綠色組織中的表達(dá)量顯著高于根、莖、花蕾、花、莢果等非綠色組織器官，暗示著B(niǎo)cCIPK23可能在菜心組織發(fā)育中發(fā)揮作用。

CIPK 是植物信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵蛋白激酶，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和干旱、鹽脅迫和營(yíng)養(yǎng)脅迫等逆境脅迫應(yīng)答［7,20-21］。據(jù)研究，擬南芥AtCIPK23 與CBL1/9 形成CBL-CIPK 復(fù)合體參與擬南芥氮信號(hào)通路調(diào)控［22］。本研究結(jié)果表明，菜心BcCIPK23基因表達(dá)水平明顯受NO3-濃度影響，總體表現(xiàn)為：在低氮（0.1～1 mmol/L）條件下，無(wú)論根系還是葉片，菜心BcCIPK23基因表達(dá)量均最高，隨著供氮水平的增加，其表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)，尤其是8 mmol/L NO3-處理的菜心根系中BcCIPK23表達(dá)量?jī)H為0.1 mmol/L NO3-水平下的47.76%。前人研究表明，在低氮條件下，CIPK23 通過(guò)調(diào)控NRT1.1/NPF6.3 蛋白Thr-101 磷酸化水平，將NO3-由低親和性轉(zhuǎn)化為高親和性，從而促進(jìn)植物根系對(duì)低氮的吸收［5,7,29］。利用STRING 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)菜心BcCIPK23與NRT1.1/NPF6.3 蛋白也存在互作關(guān)系，故而推測(cè)CIPK23 在菜心中也可能通過(guò)與NRT1.1/NPF6.3蛋白互作來(lái)調(diào)控NO3-的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

在植物中，CIPK23表達(dá)水平除受外界NO3-水平的影響外，還受NH4+水平的影響［22］。本研究中，菜心BcCIPK23基因表達(dá)水平明顯受不同濃度NH4+的影響，除1 mmol/L NH4+處理下菜心根系BcCIPK23基因表達(dá)量高于0.1 mmol/L NH4+處理外，無(wú)論在根系還是葉片中，BcCIPK23基因表達(dá)水平均隨著NH4+濃度的增加呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)。在擬南芥中，向缺氮4 d 的幼苗供2 mmol/L NH4+，AtCIPK23表達(dá)隨著供NH4+時(shí)間的延長(zhǎng)而上調(diào)表達(dá)，但在供NH4+2 h 時(shí)，其表達(dá)水平才與缺氮4 d 時(shí)的表達(dá)水平存在顯著差異［22］。

已有研究指出，蛋白激酶CIPK23 本身不具有活性，需要與CBL 結(jié)合形成CBL-CIPK 復(fù)合體才具有活性，從而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫、礦質(zhì)元素吸收等過(guò)程［30］。本研究結(jié)果表明，菜 心BcCIPK23 與CBL1、CBL2、CBL3、CBL4、CBL9、CBL10 等CBL基因家族成員存在互作。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)菜心BcCBL1、BcCBL9表達(dá)水平也明顯受不同氮素水平影響，其中BcCBL1表達(dá)隨NH4+濃度的增加而下降，BcCBL9隨NH4+濃度的增加而顯著增加［25］，這與擬南芥AtCBL1、AtCBL9的研究結(jié)果并不一致，在擬南芥中，隨著NH4+處理時(shí)間延長(zhǎng)，前者表達(dá)水平急劇上調(diào)然后下降，后者表達(dá)水平僅呈現(xiàn)小幅增加［22］，可能是由于本研究未考慮相同氮濃度處理不同時(shí)間對(duì)其表達(dá)水平的影響。擬南芥突變體cipk23植株在供NH4+后仍能檢測(cè)到一定程度的蛋白磷酸化水平，AMT 蛋白可能還受到其他激酶的調(diào)控［22］。研究表明，除CIPK23 外，CIPK15 也可作為NH4+受體蛋白參與調(diào)控AMT 蛋白的磷酸化水平，從而影響NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，以避免高NH4+環(huán)境對(duì)植物所造成的毒害［31］。

由此可見(jiàn)，對(duì)NH4+、NO3-兩種氮源而言，菜心BcCIPK23表達(dá)均受氮素水平的明顯影響，可能參與不同氮素條件下氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程，但在高NH4+條件下，可能還存在其他CIPK 蛋白激酶調(diào)節(jié)AMT 復(fù)合體的磷酸化水平，從而影響根系對(duì)NH4+的吸收。

4 結(jié)論

本研究從菜心中克隆得到1 個(gè)新的全長(zhǎng)基因BcCIPK23，屬于CIPK基因家族成員，其表達(dá)量在一定程度上與生長(zhǎng)活躍的器官同步變化，暗示菜心BcCIPK23可能在菜心不同組織發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用；菜心BcCIPK23表達(dá)受到不同氮源形態(tài)及濃度的影響。菜心BcCIPK23基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和氮代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可為揭示菜心BcCIPK23在菜心氮代謝途徑中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。