劉 楊,李 強(qiáng),雷 容,陳永進(jìn),趙雅娟

口頜肌功能紊亂是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders,TMD)臨床分類之一,通常表現(xiàn)為慢性癥狀且反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者的正常生活[1-2]。研究顯示,TMD患者的焦慮或抑郁水平顯著高于正常人群;較高心理壓力或伴有焦慮等癥狀的人群更易出現(xiàn)口頜肌的緊張與疲勞,引發(fā)或加重肌肉與顳下頜關(guān)節(jié)的疼痛[3-6]。因此,心理應(yīng)激導(dǎo)致口頜肌的緊張度升高與肌疲勞被認(rèn)為是TMD的重要誘發(fā)因素。

肌電活動變化是評價口頜肌功能狀態(tài)、評估TMD發(fā)展與治療效果的重要檢測指標(biāo)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),TMD患者咬肌在下頜靜止?fàn)顟B(tài)的肌電水平要明顯高于正常人群[9]。咬肌運(yùn)動的中樞調(diào)控區(qū)域位于三叉神經(jīng)運(yùn)動核(trigeminal motor nucleus,Vmo)[10]。Vmo位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦干,并與腦內(nèi)其他核團(tuán)存在諸多神經(jīng)纖維聯(lián)系[11]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),Ⅰ型、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporter 1/2,VGLUT1/2)是谷氨酸能神經(jīng)終末的標(biāo)志物[12]。研究證實,VGLUT1與VGLUT2陽性的神經(jīng)終末在Vmo中廣泛分布,來自中樞的谷氨酸能投射可影響Vmo神經(jīng)元興奮性,從而在咀嚼運(yùn)動中起到重要調(diào)控作用[13]。然而,在心理應(yīng)激狀態(tài)下咬肌肌電的相關(guān)變化及機(jī)制還未見研究報道。因此,本研究擬采用經(jīng)典束縛應(yīng)激方式建立小鼠慢性束縛應(yīng)激動物模型,探討心理應(yīng)激誘發(fā)口頜肌功能紊亂過程中的中樞神經(jīng)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

雄性SPF級C57BL/6小鼠32只(空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供),體質(zhì)量18～22 g,8周齡。飼養(yǎng)溫度(22±1)℃,濕度(60±5)%,12 h光/暗循環(huán),隨意進(jìn)食飲水。所有動物實驗經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2020倫審字081號)。

1.2 試劑和儀器

自制束縛器;曠場實驗系統(tǒng)(RD 1412-OF)、高架十字迷宮系統(tǒng)(RD1208-EP)(上海移數(shù)公司,中國);定制肌電采集電極(蘇州科斗腦機(jī)科技有限公司,中國);MP46型2導(dǎo)生理記錄儀(BIOPAC,美國);振動切片機(jī)(VT100S)、冰凍切片機(jī)(CM1800)(Leica,德國);膜片鉗放大器(Axopatch 200B,美國);pClampfit 10.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Axon,美國);FV1000激光共聚焦顯微鏡、紅外顯微鏡(Olympus,日本);山羊抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Millipore,美國);兔抗VGLUT1、兔抗VGLUT2(Synaptic systems,德國);驢抗兔IgG (A594、A488),驢抗鼠IgG(A647)(Thermo Fisher Scientific,美國);Picrotoxin(MCE,美國)。

1.3 小鼠慢性束縛應(yīng)激模型建立

將小鼠隨機(jī)分為對照組和應(yīng)激組,每組16只。對應(yīng)激組動物采用連續(xù)14 d的束縛應(yīng)激,每天束縛時間為4 h。參照文獻(xiàn)[14],束縛器用50 mL離心管制成,管壁上帶有數(shù)個通風(fēng)孔。每日早上8點(diǎn)開始,將每只應(yīng)激組小鼠置于束縛器中,束縛過程中,小鼠可以從俯臥位向仰臥位任意旋轉(zhuǎn),但不能從頭部向尾部旋轉(zhuǎn)。束縛過程中禁食禁水。對照組小鼠正常飼養(yǎng)。

1.4 行為學(xué)測試

束縛應(yīng)激結(jié)束后次日,采用曠場實驗與高架十字迷宮實驗來驗證小鼠的焦慮水平[15-16],每組8只。

1.4.1 曠場實驗(open field test,OF) 曠場為一個長50 cm、寬50 cm、高45 cm無蓋、有四壁的暗箱。曠場上方中央裝有昏暗熒光燈并架置攝像頭,將小鼠放置在曠場中,通過自動分析系統(tǒng)記錄小鼠15 min的活動。采用中央?yún)^(qū)活動時間及活動路程作為評估焦慮水平的參數(shù)。

1.4.2 高架十字迷宮實驗(elevated plus maze text, EPM) 由兩個相對的張開臂(30 cm × 5 cm)、兩個相對的閉合臂(30 cm × 5 cm × 25 cm)和中央活動區(qū)域(5 cm × 5 cm)組成,距離地面50 cm。測試時,將小鼠放置在中央?yún)^(qū)域,通過上方攝像頭記錄其5 min的活動。通過自動分析系統(tǒng),將進(jìn)入張開臂次數(shù)百分比和滯留時間百分比作為評估焦慮水平的參數(shù)。

1.5 咬肌肌電水平檢測

采用定制電極采集兩組小鼠咬肌肌電活動水平,每組5只小鼠。定制電極制作方法:絕緣軟導(dǎo)線(長2.5 cm,直徑0.5 mm)一端焊接一根2 mm長的不銹鋼金屬微針(直徑0.15 mm),另一端焊接于2×3的圓孔排母接口,排母上焊接一根銀絲做地線。

實驗開始前,將電極埋置于小鼠左側(cè)咬肌。參照文獻(xiàn)[17]方法,小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(35 mg/kg),剃除小鼠左側(cè)面頰、頸部及顱頂毛發(fā),用碘伏消毒后,于左側(cè)下頜及顱頂各做一切口,暴露左側(cè)咬肌及顱頂。將定制電極微針插入左側(cè)咬肌肌腹深部,并縫合固定微針,縫合面頰皮膚。將絕緣導(dǎo)線經(jīng)耳后及顱頂皮下走行,于顱頂切口處穿出,另一端排母接口暴露在切口外,采用牙科自凝塑料將其固定于顱頂骨上,再次用碘伏對術(shù)區(qū)消毒。小鼠術(shù)后恢復(fù)一周后開始進(jìn)行實驗。

束縛應(yīng)激開始前,分別采集兩組小鼠的咬肌肌電活動水平。14 d束縛應(yīng)激結(jié)束后,再次采集兩組小鼠的咬肌肌電活動水平。采集方法:采用連接線將小鼠顱頂排母接口與MP46型2導(dǎo)生理記錄儀相連,置于容器內(nèi)放置30 min,待其對連接線適應(yīng)后,使用AcqKnowledge軟件采集小鼠清醒狀態(tài)下咬肌肌電信號,每只小鼠采集30 min,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到每只小鼠咬肌的咬肌累積肌電(integral electromyography,iEMG)及振幅均方根(root mean square,RMS)。

1.6 Vmo神經(jīng)元電生理檢測

束縛應(yīng)激結(jié)束后,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測兩組小鼠Vmo神經(jīng)元的電生理特性,每組3只小鼠。兩組小鼠戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉后(60 mg/kg)脫頸處死,立即取出大腦并置于95% O2、5% CO2混合氣飽和的冰浴人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜[18],將腦組織修整至Vmo附近(Bregma尾側(cè)4.84～5.34 mm)。振動切片(片厚300 μm),將腦片轉(zhuǎn)移至室溫下95% O2、5% CO2混合氣飽和的ACSF中孵育1 h。后將切片移至膜片鉗記錄槽,在紅外顯微鏡下選擇Vmo部位神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。

在電流鉗模式下,向細(xì)胞輸入20～100 pA、時程為400 ms 的正電流,誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生連續(xù)放電,用pClamp 10.0 實驗程序采集數(shù)據(jù)并處理,記錄兩組Vmo神經(jīng)元動作電位的放電次數(shù)。在電壓鉗模式下,向灌流液中加入GABAA受體阻斷劑Picrotoxin,用pClamp 10.0 實驗程序采集細(xì)胞的自發(fā)性興奮性突觸后電流(spontaneous excitatory postsynaptic current,sEPSC)。采用Mini Analysis 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到每個細(xì)胞sEPSC的頻率與幅度。

1.7 免疫組織熒光染色

采用乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyl transferase,ChAT)標(biāo)記Vmo中運(yùn)動神經(jīng)元,采用VGLUT1、VGLUT2來顯示Vmo神經(jīng)元受到的興奮性神經(jīng)投射。免疫熒光染色方法檢測VGLUT1、VGLUT2的表達(dá)水平,每組5只小鼠。

戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉后(60 mg/kg),小鼠經(jīng)心臟灌流100 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4),200 mL 4%多聚甲醛進(jìn)行灌注固定,取出腦組織進(jìn)行后固定及蔗糖脫水。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜[18],修整腦組織塊至Vmo(Bregma尾側(cè)4.84～5.34 mm)部位,冰凍切片(厚30 μm),0.01 mol/L PBS漂洗,10%驢血清室溫孵育 30 min,加入一抗山羊抗ChAT(1∶500)、兔抗VGLUT1(1∶500)、兔抗VGLUT2(1∶500)孵育過夜,0.01 mol/L PBS漂洗,加入二抗驢抗兔IgG(1∶500)、驢抗鼠IgG(1∶500),避光孵育4 h,0.01 mol/L PBS漂洗,裱片,室溫晾干,熒光封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照,采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)計算各組VGLUT1、VGLUT2的免疫熒光平均強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。行為學(xué)結(jié)果、電生理中sEPSC的頻率與幅度結(jié)果、免疫熒光染色結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行分析;咬肌肌電結(jié)果、電生理中動作電位放電次數(shù)結(jié)果采用Two-way ANOVA檢驗,并采用Bonferroni’s事后檢驗進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

曠場實驗結(jié)果顯示(圖1A～C),應(yīng)激組小鼠的中央活動時間(P=0.000 4)、中央活動路程(P=0.000 4)低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。高架十字迷宮結(jié)果顯示(圖1D～F),應(yīng)激組小鼠的進(jìn)入張開臂次數(shù)百分比(P=0.000 2)、滯留張開臂時間百分比(P=0.001 3)均顯著低于對照組 。

A:各組曠場活動軌跡圖;B:曠場中央活動時間; C:曠場中央活動路程;D:各組高架十字迷宮活動軌跡圖;E:高架十字迷宮張開臂進(jìn)入次數(shù)百分比;F:高架十字迷宮張開臂滯留時間百分比;OA:張開臂;CA:閉合臂;與對照組相比,**:P<0.01;***:P<0.001

2.2 咬肌肌電水平檢測

兩組小鼠咬肌肌電結(jié)果如圖2所示。應(yīng)激開始前,兩組小鼠咬肌iEMG(P=0.877 9)與RMS(P>0.999 9)結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義;應(yīng)激結(jié)束后,應(yīng)激組小鼠咬肌iEMG(P=0.000 4)與RMS(P=0.000 1)結(jié)果均顯著高于對照組。

A:應(yīng)激前對照組肌電圖;B:應(yīng)激后對照組肌電圖;C:應(yīng)激前后咬肌iEMG比較;D:應(yīng)激前應(yīng)激組肌電圖;E:應(yīng)激后應(yīng)激組肌電圖;F:應(yīng)激前后咬肌RMS比較;**:P<0.01;***:P<0.001

對照組在應(yīng)激前后,小鼠咬肌iEMG(P=0.798 9)與RMS結(jié)果(P>0.999 9)無明顯差異;應(yīng)激組小鼠在應(yīng)激結(jié)束后,其咬肌iEMG(P=0.001 1)與RMS(P=0.001 9)結(jié)果顯著高于應(yīng)激前。

2.3 Vmo神經(jīng)元電生理檢測結(jié)果

兩組小鼠Vmo神經(jīng)元的動作電位發(fā)放曲線如圖3所示。在電流鉗模式下,當(dāng)輸入60、80、100 pA的電流時,應(yīng)激組小鼠Vmo神經(jīng)元的放電頻率顯著高于對照組(P=0.004 0、P=0.006 0、P=0.001 7)。

A:對照組神經(jīng)元放電次數(shù)曲線;B:應(yīng)激組神經(jīng)元放電次數(shù)曲線;C:兩組神經(jīng)元放電次數(shù)比較;**:與對照組相比,P<0.01

兩組小鼠Vmo神經(jīng)元的sEPSC記錄結(jié)果如圖4所示。在電壓鉗模式下,應(yīng)激組小鼠Vmo神經(jīng)元的sEPSC頻率(P=0.003 0)與幅度(P=0.000 2)顯著高于對照組。

A:對照組神經(jīng)元sEPSCs曲線;B:應(yīng)激組sEPSCs曲線;C:兩組神經(jīng)元放電頻率比較;D:兩組神經(jīng)元放電幅度比較;與對照組相比,**:P<0.01;***:P<0.001

2.4 Vmo中VGLUT1、VGLUT2表達(dá)水平

兩組Vmo部位免疫熒光結(jié)果顯示,藍(lán)色熒光標(biāo)記神經(jīng)元為ChAT陽性,表明其為Vmo運(yùn)動神經(jīng)元。VGLUT1與VGLUT2陽性終末(紅色熒光標(biāo)記)分布在Vmo神經(jīng)元胞體周圍。VGLUT1陽性終末主要分布在Vmo核團(tuán)背外側(cè)區(qū);VGLUT2陽性終末在Vmo核團(tuán)整個范圍內(nèi)均有分布。VGLUT1與VGLUT2免疫熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示,應(yīng)激組Vmo部位的VGLUT1(P=0.001 0)與VGLUT2 (P=0.001 3)熒光強(qiáng)度顯著高于對照組(圖5)。

A:對照組VGLUT1染色;B:應(yīng)激組VGLUT1染色;C:兩組VGLUT1免疫熒光強(qiáng)度比較; D:對照組VGLUT2染色; E:應(yīng)激組VGLUT2染色;F:兩組VGLUT2免疫熒光強(qiáng)度比較;紅色熒光:VGLUT1;綠色熒光:VGLUT2;藍(lán)色熒光:ChAT;**:與對照組相比,P<0.01

3 討 論

目前,大多數(shù)研究認(rèn)為心理社會因素如焦慮、抑郁等負(fù)性情緒狀態(tài)與TMD的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系[3-4],甚至有學(xué)者認(rèn)為TMD是一種心身疾病[19]。因此,深入研究心理因素在誘發(fā)或加重TMD過程中的具體作用機(jī)制,可為臨床上TMD的病情評估、針對性治療等提供重要的指導(dǎo)依據(jù)。

束縛應(yīng)激被廣泛用于焦慮或抑郁等負(fù)面情緒相關(guān)研究中[15,20],本研究采用了經(jīng)典的束縛應(yīng)激動物模型來誘發(fā)小鼠的情緒行為改變。研究發(fā)現(xiàn),每天4 h、連續(xù)14 d的慢性束縛應(yīng)激能夠造成小鼠在曠場中央活動時間與距離明顯減少;高架十字迷宮中進(jìn)入開放臂的次數(shù)與滯留時間也明顯低于對照組,本實驗動物模型構(gòu)建成功,與以往的研究結(jié)果相一致[20-21]。

在口頜肌中,咬肌位置表淺易觸及、肌纖維方向較為明確、對外界的刺激反應(yīng)敏感度較強(qiáng),其緊張度的變化與口頜肌疲勞疼痛、副功能運(yùn)動等臨床癥狀密切相關(guān)[7,22]。臨床研究證實,心理應(yīng)激狀態(tài)下正常人的咬肌活動水平會明顯增加[5-6];而咬肌的肌緊張度增高與TMD的癥狀表現(xiàn)存在密切聯(lián)系[9]。本課題組前期研究證實,慢性應(yīng)激可導(dǎo)致咬肌組織中乙酰膽堿酯酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶等反映肌肉活動水平的酶類增加;同時自由基增多造成肌組織損傷和肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷[16,23]。因此應(yīng)激引起咬肌緊張度升高,副功能運(yùn)動增加,導(dǎo)致肌疲勞、代謝產(chǎn)物堆積,繼而出現(xiàn)疼痛、痙攣等癥狀[24]。但心理應(yīng)激與咬肌肌電活動是否存在直接因果關(guān)系目前尚不可知,本實驗對此進(jìn)行了研究。

目前臨床上常用的肌電檢測方法主要有兩種:一種為表面肌電,即把電極貼附在皮膚上導(dǎo)出較為淺表的肌肉活動電位;另一種為針電極測量,即把電極針刺入待測肌肉并導(dǎo)出局部電位。但在應(yīng)用于動物實驗過程中,表面肌電因動物的配合問題難以開展, 因此,本課題組根據(jù)小鼠口頜部解剖特點(diǎn),并參照相關(guān)文獻(xiàn)[17],定制了植入式針式電極,將其植入小鼠的咬肌內(nèi),并在顱骨部位進(jìn)行固定,較好地解決了長時間采集清醒狀態(tài)下咬肌肌電活動的問題。本研究結(jié)果顯示,慢性束縛應(yīng)激可直接引起咬肌肌電水平的顯著升高,咬肌的肌緊張度增高,提示心理應(yīng)激導(dǎo)致的咬肌緊張度升高很可能是心理應(yīng)激與TMD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的內(nèi)在關(guān)鍵機(jī)制。

三叉神經(jīng)運(yùn)動支來源于腦干Vmo中的運(yùn)動神經(jīng)元,支配口頜肌的運(yùn)動[10]。與其他軀干、四肢等肌肉的運(yùn)動支配不同,咬肌等口頜肌運(yùn)動的直接支配神經(jīng)元位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦部),而非外周神經(jīng)系統(tǒng)(脊髓)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的復(fù)雜神經(jīng)纖維聯(lián)系,導(dǎo)致了Vmo神經(jīng)元的興奮性更易受到腦內(nèi)其他低級或高級神經(jīng)核團(tuán)的影響[11]。因此,為了證實束縛應(yīng)激造成的咬肌肌電水平升高是否與中樞Vmo神經(jīng)元的變化有關(guān),本實驗采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄了Vmo神經(jīng)元的激發(fā)放電情況,發(fā)現(xiàn)在給予60、80、100 pA的電流時,應(yīng)激組小鼠Vmo神經(jīng)元的放電頻率顯著高于對照組,證實應(yīng)激造成Vmo神經(jīng)元的興奮性顯著升高。同時,本實驗記錄了穿過Vmo神經(jīng)元整個細(xì)胞膜的興奮性突觸后電流,發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組Vmo神經(jīng)元的sEPSC頻率與幅度顯著高于對照組,表明應(yīng)激可導(dǎo)致Vmo神經(jīng)元受到的興奮性神經(jīng)傳遞顯著增加。以上結(jié)果提示,束縛應(yīng)激可導(dǎo)致Vmo神經(jīng)元興奮性升高,同時Vmo神經(jīng)元受到來自中樞的興奮性投射增加,這可能是應(yīng)激后咬肌肌電水平升高的中樞調(diào)控機(jī)制之一。

谷氨酸是中樞神經(jīng)內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在神經(jīng)元內(nèi)合成后,需經(jīng)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至軸突末端,以囊泡的形式分泌至突觸間隙,引起下一級神經(jīng)元的興奮。VGLUT1與VGLUT2是兩種主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,是谷氨酸能神經(jīng)終末的標(biāo)記蛋白[12]。以往的研究證實,在Vmo核團(tuán)內(nèi),VGLUT1與VGLUT2均有表達(dá)[13]。因此,本研究選擇觀察兩組小鼠Vmo內(nèi)VGLUT1與VGLUT2的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組Vmo部位的VGLUT1與VGLUT2熒光強(qiáng)度均顯著高于對照組,進(jìn)一步證實受到束縛應(yīng)激后,Vmo神經(jīng)元收到來自其他核團(tuán)的谷氨酸能投射顯著增加。據(jù)文獻(xiàn)報道,在較低位中樞腦干,Vmo接受來自三叉上核、小細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、三叉神經(jīng)中腦核等神經(jīng)投射,直接或間接調(diào)控了Vmo神經(jīng)元的興奮性[16,25-26];而位于較高級神經(jīng)中樞的情緒相關(guān)核團(tuán),如中央杏仁核、外側(cè)下丘腦等區(qū)域,不僅與心理應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān),并且被證實發(fā)出直接或間接的神經(jīng)投射,與Vmo、三叉神經(jīng)中腦核以及小細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等部位存在神經(jīng)纖維聯(lián)系[27-28]。因此,本研究觀察到束縛應(yīng)激導(dǎo)致的Vmo神經(jīng)元興奮性升高,可能是由于應(yīng)激直接造成的情緒相關(guān)核團(tuán)的變化,通過腦內(nèi)的神經(jīng)聯(lián)系,最終導(dǎo)致向Vmo神經(jīng)元的興奮性投射增多而導(dǎo)致的。

綜上所述,慢性束縛應(yīng)激能夠造成小鼠的焦慮樣情緒改變,且咬肌的肌電活動水平升高;而在受到應(yīng)激后,支配咬肌運(yùn)動的Vmo神經(jīng)元興奮性升高,且接受來自腦內(nèi)其他核團(tuán)的興奮性投射增加,這可能就是束縛應(yīng)激導(dǎo)致咬肌肌電活動水平升高的中樞機(jī)制之一。本研究結(jié)果提示心理因素可能通過提高支配咬肌活動的Vmo神經(jīng)元興奮性,導(dǎo)致咬肌緊張度升高,進(jìn)而誘發(fā)或加重TMD,為深入探討心理因素與TMD的內(nèi)在聯(lián)系提供了實驗基礎(chǔ)。