周巧，劉健，忻凌，郭錦晨，黃旦，齊亞軍，4，胡月迪，4

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230012

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 安徽合肥 230061

3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

4 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院風(fēng)濕病研究所 安徽合肥 230031

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis， RA）特點(diǎn)是滑膜慢性炎癥[1]。骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）的特征是關(guān)節(jié)組織發(fā)生病變[2]。RA 影響全球人口的0.5%～1%[3]，而有超過5 億人（約占全球人口的7%）患有OA[4]。許多治療藥物（如非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑）有各種不良反應(yīng)，中醫(yī)藥可以作為RA 和OA 的補(bǔ)充和替代藥物[5]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA 和OA 都屬于“痹證”范疇，本團(tuán)隊(duì)在新安醫(yī)學(xué)“固本培元、扶正祛邪”治痹思想指導(dǎo)下，提出“脾虛致痹”“從脾治痹”學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，創(chuàng)制新安健脾通痹方新風(fēng)膠囊（Xinfeng capsule，XFC）[6]。XFC可以改善RA 患者關(guān)節(jié)癥狀體征、疾病活動(dòng)性指標(biāo)和焦慮抑郁，提高生活質(zhì)量[7]。且XFC 治療 OA 安全有效，在改善 WOMAC 指數(shù)總分、疼痛等方面優(yōu)于氨基葡萄糖組[8]。目前對(duì)于XFC 治療RA 與OA 的共同機(jī)制的研究相對(duì)不足。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在已有數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和多分子藥理學(xué)相結(jié)合，為探索中藥方劑治療疾病的機(jī)制和協(xié)同作用提供了一種新的途徑[9]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接，探索XFC治療RA 與OA 的共同機(jī)制，為中醫(yī)“異病同治”的深入研究提供依據(jù)。

資料和方法

1 XFC 化學(xué)成分篩選

由TCMSP （https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）管理的計(jì)算機(jī)集成 ADME（吸收、分布、代謝和排泄）模型用于藥物研究。應(yīng)用口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）（OB ≥30）和藥物相似性（Drug-likeness，DL）（DL ≥0.18）來識(shí)別生物活性化合物[10]。XFC主要中藥成分黃芪、薏苡仁、蜈蚣和雷公藤。

2 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得藥物的靶標(biāo)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/），限定物種是Homo sapiens，進(jìn)行校正，收集XFC 活性成分靶點(diǎn)基因。以“Rheumatoid Arthritis” “Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGkb、TTD 數(shù)據(jù)庫，篩選條件為relevance score ≥10，收集與RA、OA 的靶點(diǎn)基因。對(duì)XFC 活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行Venn 分析，篩選交集靶點(diǎn)。

3 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析

Cytoscape3.8.2 軟件可視化XFC 治療OA 和RA的藥物- 成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該軟件Analyze Network模塊進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算度值（Degree）及介數(shù)中心性（Betweenness Centrality），并以節(jié)點(diǎn)度值大小為依據(jù)構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂诵陌悬c(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING（https://string-db.org/），構(gòu) 建PPI 網(wǎng) 絡(luò)。Cytoscape 3.2.1 軟 件 中Betweenness， Closeness， Degree， Eigenvector， LAC，Network 參數(shù)篩選核心靶基因[11]。

5 富集分析

應(yīng)用R 3.6.0 軟件進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，確定XFC 治療的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。P值＜0.05和q值＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制XFC 治療RA和OA 通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

6 分子對(duì)接

PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）獲得靶點(diǎn)基因3D 結(jié)構(gòu)?；衔锏?D 構(gòu)象異構(gòu)體從PubChem數(shù)據(jù)庫 （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取。Autodock Vina 軟件來評(píng)估化合物-靶標(biāo)關(guān)系的結(jié)合親和力[12]。PyMol 軟件可視化結(jié)合模型。

結(jié) 果

1 XFC 活性成分組成及成分篩選

搜索XFC 的中藥成分，得到各藥材的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量等信息，設(shè)定閾值后篩選的結(jié)果見表1。

表1 XFC 中各藥材的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量

2 成分靶點(diǎn)收集篩選及疾病交集靶點(diǎn)

XFC 中活性化合物共有1180 個(gè)靶點(diǎn)。去重、校正和轉(zhuǎn)化后，確定217 個(gè)的靶基因。不同數(shù)據(jù)庫分別收集到RA 相關(guān)靶點(diǎn)基因2810、12、204、13、158 個(gè)。OA 相關(guān)靶點(diǎn)基因849、6、150、9、32 個(gè)。通過基因矯正、去重后獲得204 個(gè)RA，849 個(gè)OA 相關(guān)靶基因。對(duì)XFC 活性成分和疾病靶點(diǎn)取交集，繪制Venn 圖，獲得111 個(gè)交集基因。見圖1。

圖1 A 圖為OA 疾病交集靶點(diǎn)，B 圖為RA 疾病交集靶點(diǎn)，C 圖為OA 和RA 交集靶點(diǎn)Venn 圖

3 構(gòu)建“中藥-化合物-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

節(jié)點(diǎn)越多，代表靶基因相連的成分越多，見圖2。藍(lán)色正方形代表靶基因，紅色橢圓形代表黃芪活性成分，綠色橢圓形代表雷公藤活性成分，黃色橢圓形代表薏苡仁活血成分，紫色橢圓形代表蜈蚣活性成分。分析表明，槲皮素、蜈蚣素、山柰酚、谷甾醇α1、芒柄花黃素、雷公藤甲素、豆甾醇、山海棠二萜內(nèi)酯A 等11個(gè)化合物與≥30 個(gè)靶基因相關(guān)聯(lián)。這些化合物和基因可能是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

圖2 XFC-化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

4 PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾敖徊姘悬c(diǎn)的篩選

構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（A），使用Cytoscape 3.8.0軟件模塊分析，得到由96 個(gè)節(jié)點(diǎn)和422 個(gè)邊組成的網(wǎng)絡(luò)（B）。再用 CytoNCA 插件的拓?fù)鋮?shù)分析，條件為Betweenness＞61.841，Closeness＞0.393，Degree＞7，Eigenvector＞0.0519，LAC＞3，Network＞4.159，得到24個(gè)節(jié)點(diǎn)和137 個(gè)邊的網(wǎng)絡(luò)（C），二次篩選以Betweenness＞293.012，Closeness＞0.459，Degree＞18，Eigenvector＞0.170，LAC＞7.525，Network＞10.211，構(gòu)建有9 個(gè)節(jié)點(diǎn)和34 條邊的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（D）。其中節(jié)點(diǎn)代表目的基因，邊代表連接節(jié)點(diǎn)的線，同一個(gè)節(jié)點(diǎn)多條線通過，說明越重要。節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺代表degree 值，邊的粗細(xì)及透明度代表靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性。拓?fù)浞治龀? 個(gè)核心靶點(diǎn)信息，分別為STAT3、MAPK14、NR3C1、JUN、FOS、MYC、TNF、RELA、MAPK1。見圖3。

5 富集分析

共揭示了2476 個(gè)GO 生物工程和175 條KEGG通路。GO 富集分析包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）3 個(gè)分支。按照p 值升序排列，將BP、CC、MF 各前10 條GO 富集結(jié)果（圖4A），縱坐標(biāo)是GO 的名稱，橫坐標(biāo)是基因的比例，圓圈的大小代表富集在每個(gè)GO 上基因的數(shù)目，圓圈顏色代表富集的顯著性。生物過程中表明靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)（GO:0000302）、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)（GO:0002237）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（GO:0006979）。細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞膜（GO:0045121）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（GO:0005667）等。分子功能涉及核受體活性（GO:0004879）、轉(zhuǎn)錄因子活性（GO:0098531）、細(xì)胞因子活性（GO:0005125）等。

KEGG 通路富集分析顯示：縱坐標(biāo)是通路的名稱，橫坐標(biāo)是基因的數(shù)目，顏色代表富集的顯著性，可知基因主要集中在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（hsa05323）、IL-17 信號(hào)通路（hsa04657）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（hsa04668）、細(xì)胞凋亡（hsa04210）、NF-κB 信號(hào)通路（hsa04064）、破骨細(xì)胞分化（hsa04380）等，見圖4B。桑葚圖展示KEGG 通路途徑基因表達(dá)情況（圖4C），左側(cè)代表每個(gè)通路中包含的基因，右側(cè)為常規(guī)的氣泡圖，氣泡大小表示通路所屬的基因個(gè)數(shù)，氣泡顏色表示p 值。這些與通路相關(guān)基因是XFC 治療RA 和OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。干擾這些途徑的某些靶點(diǎn)可能是XFC治療RA 和OA 的潛在策略。

XFC 治療RA 和OA 的主要通路及靶點(diǎn)涉及免疫炎癥、血管生成因子、骨代謝、細(xì)胞凋亡通路等。選取KEGG 中與RA 及OA 相關(guān)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（圖5A）和破骨細(xì)胞分化（圖5B）通路繪制圖形。紅色標(biāo)注代表XFC 參與疾病顯著的基因。

圖5 XFC 參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路（A）和破骨細(xì)胞通路（B）

6 交集靶點(diǎn)與XFC 活性成分的分子對(duì)接驗(yàn)證

將XFC 活性成分與9 個(gè)交叉靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能＜0 提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定，所需結(jié)合能越低，≤-5.0kcal/mol 說明有較好結(jié)合活性，≤-7.0kcal/mol 說明有強(qiáng)的結(jié)合活性。本研究在對(duì)接結(jié)果中，大多數(shù)結(jié)合能＜-7.0kcal/mol。選取結(jié)合能＜-9.0kcal/mol 的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化，展示小分子配體-蛋白質(zhì)相互作用圖，以及相互之間蛋白質(zhì)、疏水相互作用、氫鍵、金屬離子等關(guān)系（表2，圖6）。分別是山海棠二萜內(nèi)酯A（Hypodiolide A）與NR3C1結(jié)合能為-10.60 kcal/mol，槲皮素（Quercetin）與FOS為-9.70 kcal/mol，雷公藤甲素（Triptolide）與STAT3為-9.20 kcal/mol，谷甾醇α1（Sitosterol alpha1）與MAPK1 為-9.10 kcal/mol 和TNF 與蜈蚣素（Scolopendrine）為-9.0kcal/mol。以槲皮素為例，與FOS 形成ASN147（2.9 A，4.0 A），ASN271（3.4 A），ARG155（3.6 A，2.6 A），ARG279（3.1 A），ARG281（4.1 A）7 個(gè)氫鍵。2 個(gè)氫鍵相互作用被認(rèn)為是強(qiáng)相互作用，距離分別為ASN147（4.0A）和ARG281（4.1A）?？傮w而言，我們發(fā)現(xiàn)氫鍵和靜力是主要相互作用形式，相互作用形式的多樣性決定其結(jié)合親和力的能力。綜合分析，山海棠二萜內(nèi)酯A、槲皮素、雷公藤甲素、谷甾醇α1、蜈蚣素可能是XFC 治療RA 和OA 的關(guān)鍵活性成分。

圖6 XFC 活性成分和核心靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果三維圖（結(jié)合能≤-9.0kcal /mol），注：A-E 分別為NR3C1 與Hypodiolide A、FOS 與Quercetin、STAT3 與Triptolide、MAPK1 與Sitosterol alpha1、TNF 與Scolopendrine 的分子對(duì)接圖

表2 核心靶點(diǎn)與其映射的XFC 活性成分的結(jié)合能

討 論

“異病同治”是在辨證論治原則指導(dǎo)下產(chǎn)生的。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎都屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇。本團(tuán)隊(duì)提出“脾虛濕盛”“從脾治痹”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)[6，13]。新風(fēng)膠囊（XFC，由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成）應(yīng)用于臨床多年，療效確切[7-8]。

本研究篩選產(chǎn)生了103 種XFC 活性化合物，217個(gè)靶點(diǎn)，Venn 分析獲得111 個(gè)交集基因。槲皮素、蜈蚣素、山柰酚、谷甾醇α1、芒柄花黃素、雷公藤甲素、豆甾醇、山海棠二萜內(nèi)酯A 等11 個(gè)化合物與≥30 個(gè)靶基因相關(guān)聯(lián)。核心靶點(diǎn)分別為STAT3、MAPK14、NR3C1、JUN、FOS、MYC、TNF、RELA、MAPK1。 這些化合物和基因可能是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。山奈酚是黃芪、雷公藤的主要成分，可以抑制炎癥細(xì)胞因子激活、TGF-β1 表達(dá)和氧化應(yīng)激[14]。雷公藤甲素可以抑制細(xì)胞因子、粘附分子和趨化因子的分泌，可以調(diào)控JAK2/STAT3 信號(hào)通路，抑制RA 成纖維滑膜細(xì)胞炎癥和細(xì)胞遷移[15]。雷公藤甲素可以通過介導(dǎo)circ0003353/miR-31-5p/CDK1 軸的表達(dá)來抑制RA 成纖維滑膜細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和炎癥反應(yīng)[16]。槲皮素通過沉默調(diào)節(jié)蛋白1/單磷酸腺苷活化蛋白激酶（SIRT1/AMPK）信號(hào)通路抑制雌激素受體應(yīng)激，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)膝關(guān)節(jié)軟骨退化[17]。β-谷甾醇抗炎機(jī)制可能是通過抑制表皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥小體 NLRP3 的表達(dá)[18]。β-谷甾醇具有雌激素樣作用，可能是調(diào)節(jié)骨代謝的重要的物質(zhì)之一[19]?？偟膩碚f，這些活性成分從各個(gè)方面表現(xiàn)出抗風(fēng)濕作用，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、減少骨侵蝕和破壞以及減輕氧化損傷。證實(shí)了XFC 治療 RA 和OA 中成分的集體有效性和多樣性。

KEGG 通路富集分析表明，某些類型的病毒感染和癌癥也可能在網(wǎng)絡(luò)中至關(guān)重要。病毒感染與RA 密切相關(guān)（如Epstein-Barr 病毒感染），并且 RA 患者患癌風(fēng)險(xiǎn)增加[20]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IL-17 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、NF-κB 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化等可能是關(guān)鍵信號(hào)通路。IL-17 信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路被認(rèn)為是經(jīng)典的免疫信號(hào)通路，可以激活RA[21]、OA[22]發(fā)病的細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)。KOA 的發(fā)病機(jī)制可能與 IL-17A （rs2275913）基因呈正相關(guān)[23]。Toll 樣受體參與免疫起始環(huán)節(jié)，可通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式激活相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致RA 和OA 的發(fā)生[24-25]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)、自身免疫和細(xì)胞增殖、凋亡中的重要轉(zhuǎn)錄因子[26]。

在可視化的通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中（圖4C），RELA、MAKT1、MAPK14、JUN、IKBKB、FOS、MAPK8、NFKBIA、IKBKB、AKT 等參與了許多通路，表明XFC 可能多通路和多靶點(diǎn)聯(lián)合相互作用發(fā)揮作用。通路圖直觀顯示XFC 治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和破骨細(xì)胞分化通路的代謝途徑。圖5A 中所示，RA 的發(fā)病機(jī)制可能涉及多種免疫和炎癥細(xì)胞，如樹突細(xì)胞（DC）、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，包括軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、FLS 和血管細(xì)胞。T 細(xì)胞受體信號(hào)通路參與了自身反應(yīng)性Th1 細(xì)胞從DC 分化。Th17 細(xì)胞的分化和IL-17 的分泌被認(rèn)為是T 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期激活因子。這三個(gè)途徑代表了RA 發(fā)生的早期啟動(dòng)子。JAKSTAT、PI3K-AKT 和MAPK 信號(hào)通路參與破骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致骨和關(guān)節(jié)破壞。FLS 可通過TNF 信號(hào)通路和Toll 樣受體信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)炎癥。此外，VEGF 信號(hào)通路可能參與白細(xì)胞遷移和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。圖5B 可見，破骨細(xì)胞通路涉及破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th1 細(xì)胞，涉及的信號(hào)通路有JAK-STAT、PI3KAKT、MAPK、NF-κB。紅色標(biāo)注代表XFC 參與疾病顯著的基因。

分子對(duì)接分析研究候選化合物和靶標(biāo)的相互作用。對(duì)結(jié)合能小于-9.0kcal/mol 的進(jìn)行可視化，分別是山海棠二萜內(nèi)酯A 與NR3C1，槲皮素與FOS，雷公藤甲素與STAT3，谷甾醇α1 與MAPK1 和TNF 與蜈蚣素。表明XFC 是通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)來發(fā)揮作用的。

本研究結(jié)果表明，新風(fēng)膠囊通過調(diào)節(jié)多種途徑發(fā)揮其在OA 和RA 中的藥理作用，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫調(diào)節(jié)等?；钚猿煞郑ㄈ玳纹に?、山海棠二萜內(nèi)酯A、雷公藤甲素、谷甾醇α1 和蜈蚣素）可能是通過調(diào)節(jié)STAT3、MAPK14、NR3C1、JUN、FOS、MYC、TNF、RELA、MAPK1 目標(biāo)基因，以及調(diào)節(jié)JAKSTAT、PI3K-AKT、MAPK、NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎抗免疫作用，達(dá)到治療疾病的目的。然而，本研究也有一定的局限性，由于各平臺(tái)數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的分析算法和軟件功能的限制，另外這些結(jié)果需要實(shí)驗(yàn)研究。