彭保星 張 倩 陳巖玉 應(yīng)國(guó)明 胡 超

( 鄱陽(yáng)縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 江西 鄱陽(yáng) 333100 )

腦外傷后患者血清的外泌體表達(dá)明顯升高,因此,外泌體可作為新型的腦挫裂傷的預(yù)后指標(biāo),對(duì)腦外傷的診斷、損傷嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估具有較高價(jià)值[1-3]。 為探究外泌體miRNAs 聯(lián)合模型預(yù)測(cè)腦挫裂傷患者預(yù)后的臨床意義,本次研究選取我院2020年1 月—2022 年3 月收治的腦挫裂傷患者200 例。本次研究詳細(xì)報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取我院2020 年1 月—2022 年3 月收治的腦挫裂傷患者200 例,分別檢測(cè)入院時(shí)和1 周后采集患者外周血,經(jīng)外泌體提取,采用RT -PCR 檢測(cè)外泌體miRNAs(miR -21、miR -124、miR -335)的表達(dá)水平;根據(jù)傷后3 個(gè)月的GOS 評(píng)分分為預(yù)后良好組(GOS 4 ～5 分)與預(yù)后不良組(GOS 1 ～3 分)。 收集患者的臨床診療和影像學(xué)資料。 上述患者須征求患者家屬同意。 同時(shí),本課題研究?jī)?nèi)容已得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào):PYPH202107)。一般資料對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)表1。 本研究的診斷與治療標(biāo)準(zhǔn):《腦挫裂傷診療指南》和《中國(guó)顱腦創(chuàng)傷外科手術(shù)指南—專(zhuān)家共識(shí)(2015版)》[4]。 (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①有明顯的外傷史,急診CT有腦挫裂傷征象,按上述診斷標(biāo)準(zhǔn)確診腦挫裂傷;②年齡18 ～70 歲,入院時(shí)患者生命體征相對(duì)穩(wěn)定,無(wú)合并其他臟器損傷;③受傷后4 小時(shí)內(nèi)入院。 (2)排除標(biāo)準(zhǔn):①患有惡性腫瘤者;②因頭暈等所致的頭部外傷或因腦卒中致外傷者;③患有原發(fā)性腦干損傷者;④開(kāi)放性顱腦損傷者;⑤入院后需急診開(kāi)顱手術(shù)者;⑥血液系統(tǒng)疾病,近期有感染性疾病;⑦嚴(yán)重復(fù)合傷,頭部或身體其他部位有開(kāi)放性傷口者。

表1 2 組一般資料對(duì)比(n=100)

1.2 方法

方法如下:收集2 組患者一般臨床資料、神經(jīng)影像學(xué)資料。 ①一般臨床資料:性別、年齡、家族史、教育水平、既往病史(高血壓、高血脂、糖尿病、冠心病等)、病程、個(gè)人生活習(xí)慣(吸煙、嗜酒、不合理飲食、缺乏鍛煉和社會(huì)退縮)等[5-8]。 ②神經(jīng)影像學(xué)資料:采用磁共振成像系統(tǒng)(MRI)(德國(guó)SIEMENS 公司生產(chǎn),設(shè)備型號(hào)SOMATOM Definition AS)和或電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)(德國(guó)SIEMENS 公司生產(chǎn)64 排CT)予以患者進(jìn)行檢查,入院時(shí)GCS 評(píng)分、挫裂傷部位、出血量、中線移位距離、腦挫裂傷體積、合并顱骨骨折例數(shù)、是否應(yīng)用抗凝藥物等。 (2)外周血采集與預(yù)處理。 患者入院后分別于第2 天和第7 天清晨采集患者空腹血3 mL,裝入無(wú)菌EDTA 試管內(nèi),以每分鐘2 500 轉(zhuǎn)的速度進(jìn)行離心2 分鐘,取血清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中。 (3)外泌體提取。 上述方法分離血清。①立即血清離心純化:3 000 g,10 分鐘,取上清液。②按比例加入提取試劑,按照外泌體提取試劑盒操作(上海聯(lián)邁生物),混勻,靜置30 分鐘。 ③再次離心:1 500 g,30 分鐘, 去上清液。 ④純化離心:1 500 g,5 分鐘,去上清液。 ⑤加入無(wú)RNA 酶的水,吹打,放于-80℃凍存,備檢測(cè)用。 (4)外泌體miRNAs 的檢測(cè)方法。 ①引物設(shè)計(jì)與訂制:由上海生工合成,外泌體總RNA 提取:Trizol 法提取外泌體中總RNA,經(jīng)檢測(cè)RNA 質(zhì)量檢測(cè),再RNA 濃度測(cè)定,備目標(biāo)基因檢測(cè)。 ②熒光RT-PCR 檢測(cè):先采用RT reagent kit 逆轉(zhuǎn)錄RNA 為cDNA,反應(yīng)條件:42 ℃15 分鐘,85 ℃5 秒。 采用SYBR 熒光RT -PCR 技術(shù),按25 uL 反應(yīng)體系,使用熒光PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃10 分鐘,95 ℃15 秒,60 ℃60 秒,40 個(gè)循環(huán)。 采用U6 作為內(nèi)參,健康體檢者血清為對(duì)照,用2-ΔΔCt 表示各組血清外泌體miR-21、miR-124、miR-335 的相對(duì)表達(dá)量,反應(yīng)重復(fù)操作3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 工具進(jìn)行處理,計(jì)量資料用()表示,組間對(duì)比采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用(n,%)表示,組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn),采用Logistic 回歸模型分析外泌體miRNAs 與腦挫裂傷患者預(yù)后不良的相關(guān)性,選取LASSO 法結(jié)合相關(guān)因子構(gòu)建預(yù)測(cè)模型,再繪制受試者工作特征(ROC)曲線計(jì)算該聯(lián)合模型預(yù)測(cè)的敏感度和特異度,利用MedCalc 軟件工作繪制森林圖,P＜0.05則提示對(duì)比具有明顯差異。

2 結(jié)果

2.1 2 組影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室資料對(duì)比

2 組患者入院時(shí)GCS 評(píng)分、出血量、中線移位、腦挫裂傷體積、miR -21、miR -124、miR -335 對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),2 組合并顱骨骨折例數(shù)、是否應(yīng)用抗凝藥物對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)表2。

表2 2 組的影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室資料對(duì)比(,分,n=100)

表2 2 組的影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室資料對(duì)比(,分,n=100)

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2.2 變量及賦值及多因素分析

結(jié)果表明,出血量＞12 mL、中線移位＞5 mm、腦挫裂傷體積＞20 cm2、miR -21 ＞2.5、miR -124 ＞3、miR-335 ＞2.5 是預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素,入院時(shí)GCS 評(píng)分＞8 分是預(yù)后良好的保護(hù)因素。 賦值。見(jiàn)表3。 多因素分析。 見(jiàn)表4

表3 變量及賦值

表4 多因素回歸分析

2.3 森林圖

利用MedCalc 軟件工作繪制森林圖,OR 值森林圖它的中心小方塊是OR 值,左右兩側(cè)的代表OR 值的波動(dòng)范圍,然后豎虛線可以直觀地看出OR 值的95%CI 是否包含1,顯然這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)是包含1的,即對(duì)應(yīng)的因素不顯著。 出血量＞12 mL、中線移位＞5 mm、腦挫裂傷體積＞20 cm2、miR -21 ＞2.5、miR-124 ＞3、miR -335 ＞2.5 是預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素,入院時(shí)GCS 評(píng)分＞8 分是預(yù)后良好的保護(hù)因素。 見(jiàn)圖1。

圖1 森林圖

2.4 ROC 曲線圖分析及ROC 曲線圖

三者聯(lián)合對(duì)預(yù)后良好具有較高預(yù)測(cè)價(jià)值, 靈敏度、特異度、 準(zhǔn)確度分別為100.00%、96.00%、98.00%。 見(jiàn)表5、圖2。

圖2 ROC 曲線圖

表5 ROC 曲線圖分析(%)

3 討論

外泌體是細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡,其內(nèi)含雙鏈DNA、編碼及非編碼RNA 等遺傳信息和功能分子,能夠通過(guò)血腦屏障,參與細(xì)胞間的通訊[9]。 國(guó)內(nèi)有的學(xué)者[10]指出:外泌體可用于創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)的輔助診斷以及預(yù)后的監(jiān)測(cè)。

目前,研究證實(shí)針對(duì)血漿和血清外泌體miRNAs可作為T(mén)BI 的診斷指標(biāo),研究中確認(rèn)了10 個(gè)能夠?qū)p度、中度和重度TBI 進(jìn)行診斷的miRNAs 序列,包括:miR-151 - 5 p、miR -195、miR -20 a、miR -328、miR-362 -3 p、miR - 30 d、miR -451、miR -486、miR-505 以及miR-92 a[11]。 有的學(xué)者總結(jié)評(píng)估TBI 患者損傷程度和預(yù)測(cè)預(yù)后有潛在價(jià)值的新型生物標(biāo)志物-外泌體miRNA 后指出,miRNA -21 與miRNA-210 具有促進(jìn)血管生成的作用,當(dāng)組織發(fā)生缺血缺氧時(shí),組織細(xì)胞會(huì)分泌miRNA -21 與miRNA-210,其主要作用為減少缺血缺氧部分腦細(xì)胞的凋亡和減輕其炎癥反應(yīng)[12-13]。 此外,在局部腦組織受到損傷后,神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)一系列細(xì)胞因子及體液介導(dǎo),誘導(dǎo)受損部位產(chǎn)生免疫和炎癥反應(yīng),而miRNA-21、miR-124 具有調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能的潛力,調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和調(diào)亡[14-15]。 在外泌體與神經(jīng)炎癥的研究中,新型miR-335 參與腦缺血再灌注和腦細(xì)胞凋亡的炎癥反應(yīng)[16]。 目前,新型miR -335 在腦損傷中的研究較少,具有探索的價(jià)值。 本次研究中,2 組患者入院時(shí)GCS 評(píng)分、出血量、miR -21、miR-124、miR-335、中線移位、腦挫裂傷體積對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),2 組合并顱骨骨折例數(shù)、是否應(yīng)用抗凝藥物對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 Cox 回歸分析,出血量＞12 mL、中線移位＞5 mm、腦挫裂傷體積＞20 cm2、miR -21 ＞2.5、miR-124 ＞3、miR-335 ＞2.5 是預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素,入院時(shí)GCS 評(píng)分＞8 分是預(yù)后良好的保護(hù)因素。miR-21 ＞2.5、miR -124 ＞3、miR -335 ＞2.5 是預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素,原因在于,miR-21 ＞2.5、miR-124 ＞3、miR -335 ＞2.5 的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致患者腦部聯(lián)絡(luò)纖維、投射纖維、聯(lián)合纖維損傷,減慢其神經(jīng)信號(hào)傳遞速度,使患者各腦區(qū)域的信息聯(lián)絡(luò)出現(xiàn)障礙,增強(qiáng)認(rèn)知功能障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。 腦內(nèi)微出血會(huì)進(jìn)一步損傷腦組織,微出血數(shù)量越多,患者的腦組織損傷就越嚴(yán)重,對(duì)其神經(jīng)元生物電活動(dòng)產(chǎn)生干擾,導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列認(rèn)知功能障礙。 中線移位＞5 mm、腦挫裂傷體積＞20 cm2是預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素,因此,在腦部影像學(xué)檢查中,臨床必須加強(qiáng)此類(lèi)患者的認(rèn)知功能評(píng)估、影像學(xué)復(fù)查等,以對(duì)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生做到早期、準(zhǔn)確識(shí)別,并實(shí)施針對(duì)性干預(yù)措施,以改善其預(yù)后。

綜上所述,外泌體miRNAs 對(duì)于預(yù)后具有重要意義,對(duì)于指導(dǎo)臨床治療具有重要作用。 外泌體miRNAs 與腦損傷密切相關(guān),不僅是腦損傷預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物,而且還是腦損傷治療的靶點(diǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。