江四華，代卓青，劉 田，宋國林

1 貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550000； 2 貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003

膿毒癥是指因宿主對感染的反應失調進而導致危機生命的器官功能障礙。流行病學調查顯示，膿毒癥心功能不全者病死率達70%～90%［1-3］。四逆湯源自《傷寒論》，由炙甘草、附子及干姜組成，四逆湯具有強心擴冠、抗休克、改善心肌能量代謝障礙、調節(jié)免疫等作用［4-5］。自噬是細胞自我吞噬，將壞死的蛋白質、殘留的細胞器、細胞內細菌病毒進行降解和回收的一個循環(huán)過程。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥的病理生理過程中可以觀察到自噬水平發(fā)生變化，自噬在膿毒癥心功能障礙的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，目前對自噬的檢測主要推薦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62/SQSTM1等蛋白指標。

1 材料

1.1 動物SPF 級SD 大鼠，雌性，體質量200～250 g，由湖南長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物實驗合格證號：SCXK（湘）2014-0011。檢疫后送貴州中醫(yī)藥大學花溪校區(qū)動物試驗中心飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑6-氨基-3-甲基嘌呤（批號：5152-23-4）、一抗（批號：bsm-33309m）均由鼠抗MCE 公司提供。二抗：山羊抗兔IgG（北京中杉公司，批號：ZB-2301）。中藥材產地：制白附子四川、干姜貴州、甘草甘肅；制白附子、干姜由貴陽濟仁堂中藥飲片廠提供，甘草由四川千方中藥股份有限公司提供。

1.3 主要器材Vevo 2100 心臟超聲機（Visualsonics）。

1.4 中藥制備四逆湯中附子（先煎）45 g，干姜27 g，甘草18 g，按照5∶3∶2比例配置，加水500 mL，煎煮150 mL（藥物濃度0.5 g/mL）［7-8］。

1.5 實驗方法

1.5.1 大鼠膿毒癥模型制備方法［9］采用盲腸結扎穿刺法造模。大鼠腹腔內注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉成功后將SD 大鼠仰面固定在鼠板上，沿腹壁正中（3 cm×3 cm）處刮毛、消毒、鋪巾，腹壁正中切開2 cm，拉出盲腸后在盲腸總長度50%處結扎，用國產25 號針頭在結扎線下5 mm處貫穿盲腸1次，造成2個漏口，回納盲腸后關腹，術后皮下注射生理鹽水（5 mL/100 g）復蘇。造模成功標準：大鼠出現(xiàn)精神萎靡不振、豎毛、嗜睡、眼鼻滲血、拉稀等膿毒癥表現(xiàn)。見圖1。

圖1 SD大鼠造模情況

1.5.2 分組與給藥 將150 只SD 大鼠隨機選取30 只作為空白組，其余120 只按盲腸結扎穿刺法造模，將造模成功90 只大鼠按隨機數(shù)字表方法分為實驗組、對照組、阻斷組各30 只。再將每組隨機分為8、16、24 h各10只。

實驗組按1 mL/100 g 灌胃四逆湯，每隔8 h灌胃1 次（如取材時間與服藥時間重復，則服藥時間提前2 h）。空白組、對照組：按1 mL/100 g 灌胃生理鹽水，每隔8 h 1 次。阻斷組：四逆湯灌胃劑量、方法同實驗組，再按15 mg/kg 腹腔注射3-MA［10］。

1.5.3 心臟超聲數(shù)據(jù)采集 將SD 大鼠腹腔內注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg）麻醉成功后使用電動剃毛刀刮去SD 大鼠胸前區(qū)（8 cm×8 cm）毛發(fā)，再涂上脫毛膏，3～5 min 后用紗布擦凈脫毛膏，并將SD 大鼠固定在鼠板上，使胸前區(qū)充分暴露于心臟探頭下，打開Vevo 2100 心臟超聲機，使用心臟探頭檢測大鼠8、16、24 h心臟不同切面數(shù)據(jù)。評價左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）、左心室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）、心輸出量（cardiac output，CO）、左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5.4 心肌自噬蛋白P62、LC3-I、LC3-Ⅱ檢測 分別于干預8、16、24 h 取出各組大鼠心肌組織，采用BCA 法進行蛋白定量分析，每孔取50 μg 蛋白上樣，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕式電轉移法將目的蛋白轉移至PCDF 膜上，5%脫脂奶粉溫室封閉4 h，洗膜后加入一抗（稀釋1∶1000）室溫下3 h。再次洗膜，加辣根過洗膜后于暗室內加入顯影劑并曝光掃描，采用凝膠成象系統(tǒng)分析圖象（Blo-RAO Gel Doc 2000），計算光密度值（OD值），重復3次。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用單因數(shù)方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LVEDV、LVESV、CO與LVEF1）干預8 h：LVEDV、LVESV、CO、LVEF 實驗組均高于對照組（P＜0.05）；對照組與阻斷組比較，LVEDV 無顯著性差異，LVESV、CO 低于對照組（P＜0.05），LVEF高于對照組（P＜0.05）。2）干預16 h：LVEDV、LVESV、CO、LVEF實驗組均高于對照組（P＜0.05）；對照組與阻斷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3）干預24 h：各組大鼠LVEDV、LVESV、LVEF 差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組CO 高于對照組（P＜0.05），對照組CO與阻斷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1 各組SD大鼠不同時間左心室心功能比較（xˉ±s）

圖2 各組SD大鼠心臟彩超

2.2 心肌自噬蛋白表達

2.2.1 LC3-I與LC3-Ⅱ 實驗組干預8、16 h自噬蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ表達強于對照組（P＜0.05），對照組與阻斷組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；24 h 各組LC3-I、LC3-Ⅱ表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠不同時間心肌組織LC3-I、LC3-Ⅱ與P62/SQSTM1表達（xˉ±s） μg/mL

2.2.2 P62 實驗組干預8 h P62 表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），阻斷組P62表達高于對照組（P＜0.05）；干預16 h，P62蛋白表達實驗組低于對照組（P＜0.05），對照組高于阻斷組（P＜0.05）；干預24 h，P62 蛋白表達實驗組高于對照組（P＜0.05），對照組高于阻斷組（P＜0.05），見表2。

2.2.3 自噬蛋白表達與四逆湯干預 實驗組大鼠心肌自噬蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ在16 h表達最強，24 h 后降低，對照組、阻斷組總的趨勢是逐漸下降。實驗組大鼠心肌自噬蛋白P62 總的趨勢是先下降后上升，在16 h 蛋白表達最低，對照組、阻斷組16 h蛋白表達最強，24 h后降低。從試驗結果可以看出，在四逆湯的干預下，自噬蛋白表達符合正常自噬調控時間由線，見圖3—4。

圖3 自噬蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ與P62表達

圖4 四逆湯干預下自噬蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ與P62表達

3 討論

膿毒癥導致的多器官功能障礙是死亡的主要原因之一，尤其心功能障礙中左心室功能障礙占大多數(shù)，然而，膿毒癥合并左心室功能障礙的機制仍不清楚，對其治療仍有不足。

目前，評價左心室功能運用最廣泛的是超聲心動圖，不僅可評價左室整體收縮功能，還可評價左室舒張功能和局部心肌運動［11］，其中LVESV、LVEDV、CO、LVEF 是評估左心室收縮功能的常見指標。干預8、16 h實驗組LVESV、LVEDV、CO、LVEF等均優(yōu)于對照組、阻斷組。說明四逆湯能夠緩解膿毒癥SD大鼠左心室收縮功能。干預24 h，除CO外其余指標各組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而實驗組CO 高于對照組、阻斷組（P＜0.05），這可能與膿毒癥SD大鼠每搏量及心率變化有關。

自噬是是維持細胞內環(huán)境自穩(wěn)的一種自我保護機制。據(jù)相關研究顯示，檢測自噬蛋白P62、LC3-Ⅰ/Ⅱ表達可以反映自噬參與膿毒癥與心功能障礙的調控水平［12-13］。

LC3 又被稱為微管相關蛋白1 輕鏈3，主要功能是促進自噬小體體積增大，識別并包裹自噬底物，因此作為自噬起始標志物，最具代表性［14］。研究發(fā)現(xiàn)盲腸結扎穿刺法誘導的膿毒癥小鼠中自噬LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白在造模后4～6 h 開始增加，在CLP 術后12～18 h 自噬被充分激活，達到最高峰，24 h 自噬恢復最初水平；也有研究顯示在盲腸結扎穿刺術后24 h 自噬未完全消失，說明自噬調控具有時間性，出現(xiàn)這兩種不同結果的原因可能是組織標本采集時間不一［15-17］，本研究結果基本符合自噬調控時間曲線。

在自噬過程中，P62 不僅是自噬蛋白，還是自噬底物，能使LC3 與多聚泛素化蛋白連接，通過泛素信號通路將受損的細胞器或蛋白轉運到自噬體中，最終被降解［18］，當自噬激活時，P62 在細胞內持續(xù)降解，其表達量相應減少，自噬抑制時P62 逐漸在細胞內累積，其表達量增加［19］，故自噬蛋白P62 表達量與自噬活性呈負相關［20］。理論上24 h自噬消失，實驗組、阻斷組、對照組自噬P62 蛋白表達一致，而本研究實驗組表達最強，對照組、阻斷組表達最低，可能與自噬滯留有關，因為自噬是一個復雜過程，受多種信號通路調控，24 h 對照組、阻斷組可能存在自噬滯留現(xiàn)象，故出現(xiàn)對照組、阻斷組自噬蛋白P62 表達降低現(xiàn)象。本研究結果顯示，P62蛋白的表達基本符合自身調控規(guī)律。

綜上所述，四逆湯可通過自噬途徑調控膿毒癥SD大鼠左心室功能，而且在16 h自噬活性最高，該結果可為臨床四逆湯何時介入治療提供參考。