廖 娟，殷智華，李嘉宇，楊 濤,

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004；2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410004）

米糠是稻谷加工美白、拋光過(guò)程中的主要副產(chǎn)物[1]。米糠營(yíng)養(yǎng)均衡，含有多種天然活性成分，在降血糖、降血脂，抗炎、抗氧化，預(yù)防心血管疾病上具有重要作用[2]。但因其油脂含量較高，極易氧化酸敗，產(chǎn)生不良風(fēng)味，影響了米糠產(chǎn)品在食品工業(yè)中的開(kāi)發(fā)和利用[3]，常被用作飼料和發(fā)酵培養(yǎng)基，或被直接丟棄，造成資源浪費(fèi)。改良米糠風(fēng)味對(duì)于促進(jìn)米糠的加工利用具有重要意義[4]。目前米糠的加工方式主要分為理化加工和生物加工。微生物發(fā)酵是最常用的米糠生物加工技術(shù)，指利用微生物的代謝作用來(lái)分解原料中的有機(jī)物，形成多種具有特殊香氣的小分子物質(zhì)如醇類、酯類等，從而改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

微生物發(fā)酵被廣泛應(yīng)用在提高稻谷營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性中。Zhao 等[5]研究發(fā)現(xiàn)使用乳酸菌發(fā)酵米糠可以增加膳食纖維、降低植酸的含量，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Astuti 等[6]發(fā)現(xiàn)少孢根霉固態(tài)發(fā)酵使米糠揮發(fā)性化合物增加了4 種，使米糠產(chǎn)生了發(fā)酵味，增強(qiáng)了酸敗、煙熏和霉味。Nealon 等[7]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵的米糠可以調(diào)節(jié)對(duì)腸道和整體健康重要的多種代謝途徑。Kim 等[8]發(fā)現(xiàn)米糠經(jīng)酵母菌發(fā)酵后具有降血壓和抗疲勞等功效。馮海燕[9]利用高產(chǎn)纖溶酶的枯草芽抱桿菌對(duì)米糠進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，提高了纖溶酶的產(chǎn)量，并降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸的含量，整體提高米糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而在已有的微生物發(fā)酵米糠研究中，主要集中在提高米糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上，而對(duì)米糠風(fēng)味的改善方面提及較少，且一些微生物發(fā)酵過(guò)程中容易產(chǎn)生異味從而影響米糠的口感和風(fēng)味。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)相比于根霉、乳酸菌發(fā)酵，酵母發(fā)酵更適合用于改善米糠風(fēng)味。本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)過(guò)穩(wěn)定化處理的米糠為原材料，通過(guò)酵母對(duì)米糠進(jìn)行發(fā)酵，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)米糠發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)組成和含量進(jìn)行分析，結(jié)合正交偏最小二乘分析確定影響米糠發(fā)酵前后風(fēng)味的關(guān)鍵性揮發(fā)性物質(zhì)。最后對(duì)發(fā)酵米糠粉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)驗(yàn)證和營(yíng)養(yǎng)組成變化的探究，為酵母發(fā)酵米糠風(fēng)味研究以及米糠深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮米糠 湖南省金健米業(yè)有限責(zé)任公司；酵母菌粉 安琪酵母股份有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GC2030 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；JH-H5 快速水份測(cè)定儀 泰州市宜信得儀器儀表有限公司；YXQ-LS-75G 高壓滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；B01-10NA 型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠樣品制備 按照石海鴿等[10]的方法，將新鮮米糠的水分調(diào)整至24%，平鋪于玻璃培養(yǎng)皿中，800 w 微波75 s。冷卻，過(guò)80 目篩，裝入自封袋中真空備用。

1.2.2 發(fā)酵米糠樣品制備 分別稱取10 g 米糠粉，加入15 mL 水，在115 ℃滅菌30 min，搖散冷卻，接種1%（w/w）酵母菌、30 ℃發(fā)酵0、12、18、24、30 h，取樣。

1.2.3 頂空-固相微萃取操作方法 參考高晨[11]的方法，稱取2 g 樣品裝入20 mL 萃取瓶中，調(diào)節(jié)溫度為60 ℃，將SPME 針頭插入頂空瓶中平衡5 min 后，輕輕推出纖維頭，保持距樣品1 cm 左右提取揮發(fā)性風(fēng)味成分；萃取40 min 后將萃取頭輕輕推回，拔出進(jìn)樣針，插入GC 進(jìn)樣口緩慢推出纖維頭。解析條件為250 ℃，無(wú)裂解模式解析5 min。

1.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：DB-WAX；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min 升到120 ℃，再以5 ℃/min 升到50 ℃，再以15 ℃/min 升到230 ℃，保持3 min。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 電子電離（Electron Ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍33～400 m/z；調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧；數(shù)據(jù)采集為全掃描模式。

1.2.5 感官評(píng)價(jià)定量描述分析 感官評(píng)價(jià)定量描述分析（Quantitative Descriptive Analysis，QDA）是利用統(tǒng)計(jì)方法對(duì)感官測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為一種定性定量相結(jié)合的描述分析檢驗(yàn)方法[12]。由16 名本實(shí)驗(yàn)室（8 名女性，8 名男性）經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的人員組成感官評(píng)價(jià)小組，不同發(fā)酵階段的米糠樣品取相等質(zhì)量于燒杯中，隨機(jī)給樣品編號(hào)，樣品溫度和室溫均在20～25 ℃，對(duì)樣品提出各自的描述詞，經(jīng)討論確定樣品的感官描述詞、定義及參比樣的選擇和濃度，最終參比樣的選擇如表1 所示，對(duì)評(píng)價(jià)得分及香氣特征描述詞進(jìn)行均一化處理，處理結(jié)果采用雷達(dá)圖表示。

表1 QDA 法確定的描述詞及其定義以及參比樣Table 1 Descriptors determined by the QDA method,their definitions and reference samples

1.2.6 米糠水分測(cè)定 使用水分測(cè)定儀對(duì)冷凍干燥后的米糠粉進(jìn)行水分含量的測(cè)定，稱取3.00 g 米糠粉于快速水分測(cè)定儀器皿中，105 ℃干燥至恒重，記錄水分含量。

1.2.7 米糠灰分測(cè)定 采用GB 5009.4-2016 食品中總灰分的測(cè)定[13]。

1.2.8 膳食纖維含量測(cè)定 采用GB 5009.88-2014酶重量法進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.2.9 米糠蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.2.10 米糠淀粉含量測(cè)定 采用GB 5009.9-2016酶水解法進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.2.11 米糠脂肪含量測(cè)定 采用GB 5009.6-2016酸水解法進(jìn)行測(cè)定[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 2019 軟件作圖；TBtools 繪制熱圖；SIMCA14.1 軟件進(jìn)行PLSDA 分析，計(jì)算預(yù)測(cè)變量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP）；并結(jié)合SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因素分析，以P<0.05，VIP≥1 為條件篩選差異揮發(fā)性組分；實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中米糠揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定

為研究酵母發(fā)酵對(duì)米糠揮發(fā)性物質(zhì)的影響，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中米糠揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量進(jìn)行分析鑒定。由表2 可知，共檢測(cè)到75 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醛類化合物14 種、酮類化合物13 種、醇類化合物17 種、酯類化合物7 種、烴類化合物7 種、酸類化合物6 種和其他類化合物11 種。

表2 發(fā)酵過(guò)程中米糠揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對(duì)含量Table 2 Types and relative contents of volatile substances in rice bran during fermentation

由圖1 可知，未發(fā)酵米糠中醛類物質(zhì)的種類和含量最為豐富，共有14 種，相對(duì)含量占總比例的35.99%。其中己醛、壬醛的含量最高。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，醛類物質(zhì)含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，發(fā)酵30 h 時(shí)醛類物質(zhì)占比5.52%。醛類物質(zhì)是由脂質(zhì)氧化而成的。未發(fā)酵米糠中含有大量醛類物質(zhì)，可能是米糠在生產(chǎn)加工時(shí)經(jīng)過(guò)研磨造成米糠發(fā)生一定程度的脂肪氧化[18]，己醛由脂肪氧化產(chǎn)生，常被視為大米陳化指標(biāo)，是導(dǎo)致大米不愉快氣味的主要原因[19]發(fā)酵過(guò)程中由于酵母的代謝影響，醛類物質(zhì)容易發(fā)生還原反應(yīng)形成對(duì)應(yīng)的醇類物質(zhì)，因此醛的相對(duì)含量明顯降低。這一結(jié)果與Yi 等[20]利用植物乳桿菌發(fā)酵米粉30 h 使醛類物質(zhì)由53.6%降低到11.2%相類似，醛類物質(zhì)由于氣味閾值較低，在所有類別中對(duì)香氣貢獻(xiàn)最大。這些醛類物質(zhì)的減少可以有效降低米糠的難聞氣味。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中米糠揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量變化（A）、種類數(shù)量變化（B）Fig.1 Changes in the relative content of volatile substances of rice bran during fermentation (A) and changes in the number of species (B)

在發(fā)酵過(guò)程中醇類物質(zhì)的相對(duì)含量逐漸增加，未發(fā)酵米糠中的醇類物質(zhì)占比為14.21%，發(fā)酵30 h時(shí)米糠中的醇類物質(zhì)占比達(dá)到60.87%。2-甲基-1 丙醇、1-丁醇、1-庚醇、2,3-丁二醇表現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，其中2,3-丁二醇作為一種天然的芳香劑被描述為水果，奶油，黃油味[21]，在未發(fā)酵米糠中未檢出。未發(fā)酵米糠和發(fā)酵米糠中醇類物質(zhì)含量的顯著差異可能是由氨基酸代謝或脂肪酸代謝產(chǎn)生，楊艷麗等[22]認(rèn)為某些類型的醛可以在發(fā)酵過(guò)程中還原為醇或氧化成有機(jī)酸，從而導(dǎo)致醇含量增加。醇類物質(zhì)通常具有較高的閾值，但與香氣成分密切相關(guān)[23]，它們可以與有機(jī)酸形成酯類化合物，有利于改善米糠風(fēng)味特征[24]。

隨著發(fā)酵進(jìn)行酮類物質(zhì)的種類由9 種增加到13 種。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的2,3-戊二酮和2,3-己二酮，可以賦予米糠黃油焦糖風(fēng)味[25]。酮類物質(zhì)主要是脂質(zhì)自動(dòng)氧化和美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，具有令人愉悅的氣味，如水果味、香蕉味、焦糖味和堅(jiān)果味[26]。發(fā)酵過(guò)程中酮的種類數(shù)量和相對(duì)含量提高，可能由醇氧化、酯分解或微生物氧化形成[27]。

發(fā)酵前后米糠酯類含量變化不顯著，但種類增加。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的壬酸乙酯具有果香及玫瑰樣香氣的酒香[28]，可以改善米糠風(fēng)味。酯類物質(zhì)具有果味，主要由醇和脂肪酸酯化形成[29]，可以減輕脂肪酸帶來(lái)的異味。烷烴類物質(zhì)多數(shù)由于石油污染或土壤污染而來(lái)，且香氣強(qiáng)度弱，對(duì)米糠中香氣貢獻(xiàn)少。酸類物質(zhì)本實(shí)驗(yàn)檢出含量少，且多為高沸點(diǎn)直鏈酸，對(duì)米糠香氣貢獻(xiàn)小。

2.2 PLS-DA 模型的建立

為進(jìn)一步分析發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性成分的變化。以75 個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)組分作為因變量，不同發(fā)酵時(shí)間作為自變量，通過(guò)PLS-DA 分析（圖2A），可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間米糠揮發(fā)性成分有效區(qū)分。本次分析中的自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.85，因變量擬合指數(shù)（R2Y）為0.99，模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.937，R2和Q2超過(guò)0.5 表示模型擬合結(jié)果可接受[30]。經(jīng)過(guò)200 次置換檢驗(yàn)（Permutation Test），如圖2B，Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于零，說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合，模型驗(yàn)證有效，認(rèn)為該結(jié)果可用于發(fā)酵過(guò)程中米糠揮發(fā)性成分鑒別分析。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間米糠揮發(fā)性物質(zhì)PLS-DA 得分圖（A）、模型交叉驗(yàn)證結(jié)果（B）Fig.2 PLS-DA scores of rice bran at different fermentation times (A),model cross-validation results (B)

米糠酵母發(fā)酵各個(gè)時(shí)期主要的揮發(fā)性成分在PLS-DA 圖上有明顯的區(qū)分。未發(fā)酵樣品位于第四象限，而發(fā)酵后樣品位于二、三象限。說(shuō)明該模型可以對(duì)發(fā)酵前后米糠揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。因此，本模型對(duì)米糠發(fā)酵不同階段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性。

為了進(jìn)一步表征不同發(fā)酵階段米糠樣品揮發(fā)性化合物之間的差異，計(jì)算并檢驗(yàn)了PLS-DA 模型的變量投影重要性（VIP）得分（見(jiàn)表2），VIP 值越大，說(shuō)明在發(fā)酵不同階段該揮發(fā)性化合物的差異越顯著。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中米糠關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)分析

為了進(jìn)一步分析不同揮發(fā)性成分對(duì)區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間米糠的貢獻(xiàn)率，選擇P<0.05 且VIP>1 的物質(zhì)，篩選出15 種發(fā)酵過(guò)程中米糠的差異揮發(fā)性成分，其中醛類5 種、酮類3 種、醇類4 種、酯類1 種、其他2 種。為了更加直接地區(qū)分不同發(fā)酵階段下米糠特征揮發(fā)性化合物的變化，依據(jù)每種風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量繪制熱圖，將不同發(fā)酵階段下米糠樣品與15 種揮發(fā)性化合物的關(guān)系進(jìn)行可視化。結(jié)果如圖3 所示，苯甲醛主要由苯丙氨酸降解產(chǎn)生，具有一種特殊的苦杏仁味[31]，庚醛有一種強(qiáng)烈的難聞的脂肪氣味，壬醛則呈現(xiàn)脂肪氧化酸敗的哈喇味[32]。苯乙烯、己醛、苯甲醛、庚醛、壬醛這些帶來(lái)不愉快氣味的物質(zhì)[33]，隨著米糠的發(fā)酵，含量明顯降低。2-庚酮、1-壬醇、壬酸乙酯、乙醛、乙偶姻、1-戊醇、2-甲基-1-丙醇、2,3-丁二醇、2,3-戊二酮、2,3-己二酮這些給米糠帶來(lái)米香、奶油、水果、玫瑰等愉悅氣味的物質(zhì)[34]，隨著發(fā)酵的進(jìn)行明顯增加。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間米糠關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖Fig.3 Heat map of clustering of key volatiles of rice bran at different fermentation times

2.4 發(fā)酵對(duì)米糠感官評(píng)價(jià)的影響

對(duì)酵母發(fā)酵米糠不同發(fā)酵時(shí)間段的米糠進(jìn)行QDA 感官評(píng)價(jià)，得到不同發(fā)酵時(shí)間段的米糠風(fēng)味剖面圖，圖4 可知，未發(fā)酵米糠具有較強(qiáng)烈的酸味與哈喇味，異味感較重且無(wú)香氣，綜合評(píng)分很低，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后米糠的酸味、哈喇味減弱，甜香、果香、酒香增強(qiáng)。發(fā)酵18、24、30 h 后的米糠風(fēng)味剖面圖具有一定相似性，體現(xiàn)在甜香、果香、酒香方面得分突出，尤其是發(fā)酵18 h 的米糠在甜香、果香方面最為突出，故發(fā)酵18 h 的米糠在綜合評(píng)分上獲得最高分，其味道可被大部分小組成員接受，這一結(jié)果與米糠中揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果一致，甜味、果香更為突出的發(fā)酵18 h 的米糠其2-庚酮、1-壬醇、壬酸乙酯、乙偶姻的含量都高于其他發(fā)酵時(shí)間米糠。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間米糠感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.4 Radar chart for sensory evaluation of rice bran at different fermentation times

為了進(jìn)一步確定揮發(fā)性物質(zhì)和香氣之間的關(guān)系，使用Pearson 相關(guān)性分析了發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)與香氣之間的相關(guān)性。如表3 所示，米糠關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)和香氣描述之間均有較高相關(guān)性，說(shuō)明米糠關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化對(duì)米糠香氣的影響顯著。其中苯乙烯、己醛、苯甲醛、庚醛與米糠的酸味、哈喇味具有顯著正相關(guān)性，2-庚酮、壬酸乙酯、乙偶姻、2-甲基-1-丙醇、2,3-丁二醇、2,3-己二酮與米糠的甜味、果香具有顯著正相關(guān)。壬醛、壬酸乙酯對(duì)米糠的綜合評(píng)分影響最為顯著。

表3 米糠揮發(fā)性物質(zhì)與香氣描述之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between volatile substances of rice bran and aroma description

2.5 發(fā)酵對(duì)米糠主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響

根據(jù)上述結(jié)論，將發(fā)酵18 h 的米糠與未發(fā)酵米糠主要營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比。表4 為未發(fā)酵和發(fā)酵18 h 米糠的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量比較。從表中可以看出，發(fā)酵米糠粉中的膳食纖維含量較未發(fā)酵米糠提升了18.21%，蛋白質(zhì)含量提升了38.41%，淀粉含量降低了29.67%，脂肪含量降低了26.50%。發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)和膳食纖維含量的提升，這一結(jié)果也與Wu[35]、Sukma 等[36]的研究結(jié)果相符合。酵母發(fā)酵米糠不僅改善了米糠風(fēng)味，且米糠蛋白質(zhì)、膳食纖維含量的顯著提升以及脂肪含量的降低還提高了米糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表4 發(fā)酵前后米糠基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成對(duì)比（%）Table 4 Comparison of basic nutrients in rice bran before and after fermentation (%)

3 結(jié)論

本文研究了酵母發(fā)酵米糠過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、香氣特征以及主要營(yíng)養(yǎng)成分的變化。結(jié)果表明酵母發(fā)酵能夠改變米糠揮發(fā)性物質(zhì)的組成，米糠中醛類物質(zhì)含量降低，醇類物質(zhì)含量增加，發(fā)酵后增加了米糠酒香、果香、甜味等香氣，提高了米糠綜合評(píng)分，改善了米糠的風(fēng)味品質(zhì)。發(fā)酵18 h 的米糠營(yíng)養(yǎng)成分組成比例改變，使米糠更具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。本文還指出了發(fā)酵米糠中揮發(fā)性物質(zhì)與香氣之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了對(duì)米糠風(fēng)味影響顯著的揮發(fā)性物質(zhì)。這對(duì)于從改善米糠風(fēng)味方面來(lái)提高米糠利用價(jià)值具有重要意義。未來(lái)需要對(duì)米糠發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)制進(jìn)一步研究，更好地利用微生物發(fā)酵來(lái)提高谷物的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。