曲軍,陳科,陳宋林,馮湖文,謝亞彬

海南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科 ?？谑?570311

據(jù)統(tǒng)計,前列腺癌是全球第二大致命的男性惡性腫瘤,也是全球第五大癌癥死亡原因[1]。由于前列腺癌具有早期不易察覺,預(yù)后性差等特點,其死亡率一直居高不下[2],因此探索前列腺癌的發(fā)病機制,尋找有效的分子標記物或藥物治療的靶點對于前列腺癌的治療至關(guān)重要。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞 (tumor-associated macrophages,TAM) 可以通過多種途徑促進腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移,約占前列腺腫瘤總免疫浸潤細胞的30 %[3],通過發(fā)揮其免疫抑制作用,驅(qū)動腫瘤細胞耐藥性并促進其逃逸、轉(zhuǎn)移、侵襲和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。一般來說,前列腺癌組織中的TAM 密度越高,預(yù)后越差并且患者的總生存期越差[5]。研究表明,在前列腺癌組織中存在大量的M2 型TAM 浸潤,可能與抑制腫瘤免疫微環(huán)境、促進腫瘤耐藥有關(guān)[6]。STAT6 是M2 型巨噬細胞活化過程中的關(guān)鍵因子[7],Tariq 等[8]發(fā)現(xiàn),STAT6 磷酸化介導(dǎo)TAM 的M2 型極化在促進肺癌細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,抑制STAT6 的磷酸化將抑制腫瘤的生長。

PD-1/PD-L1 通路是目前腫瘤免疫治療的研究熱點,與腫瘤的免疫逃逸有關(guān),研究表明PD-1 可以影響免疫細胞在腫瘤中的浸潤從而影響腫瘤的發(fā)展[9]。但是通過抑制PD-1 是否改變TAM 極化,從而影響前列腺癌的發(fā)展目前仍不清楚,STAT6 磷酸化在TAM 極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,抑制PD-1 是否改變STAT6 的活化狀態(tài)尚待闡明。在本研究中,我們旨在研究PD-1、STAT6 與M2 型TAM 標志物CD206 在前列腺癌組織中的表達,并進一步探索抑制PD-1 對于腫瘤免疫微環(huán)境的影響,為將來進一步探索前列腺癌的治療方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集了2020 年7 月至2022 年5 月在我院就診的25 例前列腺腫瘤患者的癌組織及其癌旁組織(距腫瘤邊緣≥3 mm),患者此前均未接受放療和化療。取樣后立即放在凍存管并置于液氮中。所有患者術(shù)前均已簽署知情同意書。本研究在海南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的監(jiān)督下獲得批準和實施。

1.2 細胞和主要試劑

人前列腺癌細胞DU145、THP-1 細胞購自中科院上海細胞庫;AS1517499 與Camrelizumab 購自美國MedChemexpress 公司;CD206、STAT6 和GAPDH 抗體購自proteintech 公司;胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基均購自美國Giboco 公司;IL4、佛波酯(PMA) 購自sigma 公司;qRT-PCR 試劑盒(RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 試劑)、IL-13、TGF-β 和iNOS ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所;CCK8 試劑盒購自Vazyme 公司;Transwell 小室購自Corning 公司;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、PD-1、CD206 和STAT6 引物由上海生工生物工程有限公司合成;臺式低溫高速離心機購于美國Thermo Fisher Scientific 公司;ATC 實時熒光定量自動化PCR 儀購于美國Applied Biosystems 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 在37 ℃、5 % CO2恒溫的濕潤細胞培養(yǎng)箱中,使用含10 % 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基對人THP 細胞進行培養(yǎng)。每3 天更換一次新鮮的培養(yǎng)基,并根據(jù)細胞生長密度和培養(yǎng)基的顏色變化及時更換新鮮的培養(yǎng)基,以確保細胞得到充足的營養(yǎng)和細胞毒性物質(zhì)的清除。每日觀察細胞生長狀態(tài)是否正常,當細胞的生長密度達到70 %～80 %時進行傳代培養(yǎng),實驗時選取對數(shù)生長期的細胞。

1.3.2 THP-1 細胞分化和給藥 將THP-1 接種至6 孔細胞培養(yǎng)板,按照1 mL 細胞懸液含4 ×105個THP-1 細胞,添加20 μL PMA (100 ng/mL),將經(jīng)PMA 刺激貼壁轉(zhuǎn)化后的細胞根據(jù)后續(xù)實驗要求更換培養(yǎng)基。以上細胞分別加入Camrelizumab (50 nmol/L) 共孵育,同時加入IL-4 (45 ng/mL) 刺激48 h,分組為M0 組、M0+Camrelizumab 組、TAM 組、TAM+Camrelizumab 組;以上細胞分別加入AS1517499 (200 nmol/L) 共孵育,同時加入IL-4 (45 ng/mL) 刺激48 h,分組為M0 組、M0 +AS1517499 組、TAM 組、TAM+AS1517499 組。

1.3.3 qRT-PCR 檢測mRNA 的表達 依照產(chǎn)品說明書,分別采用Trizol 試劑從前列腺癌患者的腫瘤、癌旁組織以及細胞中提取總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照SYBR qPCR 檢測試劑盒說明書指示,制備qRT-PCR 預(yù)混液。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成,引物序列如下: GAPDH-F,5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′,GAPDH-R,5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′;PD-1-F,5′-TGGATTTCCAGTGGCGAGAG-3′,PD-1-R,5′-TGACCTTGGGACCGTAGGAT-3′;CD206-F,5′-GCAGAAGGAGTAACCCACCC-3′,CD206-R,5′-TGGCAAATGAAGGCGTTTGG-3′;STAT6-F,5′-CTCGCTGGACAGAGCTACAGA-3′,STAT6-R,5′-CAACCCCTCACCTCGGCAA-3′。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白的表達 使用RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白質(zhì),接著使用10 %的SDS-PAGE 預(yù)制膠對蛋白質(zhì)進行電泳分離,電泳條件: 120 V 恒壓,60 min,提前使用甲醇活化PVDF 膜,使用恒流300 mA,50 min 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。為了消除非特異性結(jié)合,對PVDF 膜采用5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗CD206(1 ∶1 000),STAT6 (1 ∶1 000),GAPDH (1 ∶2 500) 置于4 ℃冰箱中孵育過夜。第二天,使用TBST 緩沖液清洗PVDF,隨后加入羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫下孵育1 h。再用TBS 清洗PVDF 膜,加入增強型化學(xué)發(fā)光(ECL) 試劑,在室溫下避光孵育3 min,然后將PVDF 膜放入成像系統(tǒng)中采集圖片信息。最后,使用Image J 軟件計算PVDF 膜上蛋白質(zhì)帶的灰度值。

1.3.5 ELISA 檢測細胞因子的表達 取處理后的M0 組、M0+Camrelizumab 組、M0+AS1517499組、TAM 組、TAM+Camrelizumab 組、TAM +AS1517499 組,吸取細胞培養(yǎng)液,離心并收集,按分別按照人ELISA 檢測試劑盒說明書檢測IL-13、TGF-β 水平。

1.3.6 CCK8 實驗檢測細胞增殖水平 將對數(shù)期生長的DU145 細胞分別與M0 組、M0+Camrelizumab 組、M0+AS1517499 組、TAM 組、TAM +Camrelizumab 組、TAM +AS1517499 組巨噬細胞共孵育12 h。隨后將DU145 細胞接種于96 孔板,每孔細胞數(shù)為1 ×104個,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h。向孔內(nèi)添加10 μL CCK-8 溶液進行共孵育,2 h后使用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度值。

1.3.7 Transwell 實驗 使用8 μm 規(guī)格的Transwell 小室進行細胞侵襲實驗研究。提前24 h 將基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱內(nèi)取出,置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜。次日,取50 μL 基質(zhì)膠緩慢加入Transwell 小室,靜置1 h。取對數(shù)生長期的細胞5 ×103個,接種Transwell 小孔上室,在下室為1 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清),置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,讓細胞逐漸侵入Transwell 孔板下室。將Transwell 孔板從培養(yǎng)箱中取出,用無菌棉簽輕輕地擦去上室的細胞,PBS 緩沖液清洗2 次后,向下室加入1 mL 4 %的多聚甲醛室溫固定細胞1 h,結(jié)晶紫染色30 min 后,使用顯微鏡觀察細胞并進行細胞計數(shù)。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 21.0 和Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行比較,兩組之間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,若P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌中PD-1、CD206 和STAT6 表達水平相關(guān)性比較

qRT-PCR 結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,癌組織中PD-1、CD206 和STAT6 表達水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (圖1A)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,PD-1 和CD206 以及CD206和STAT6 的表達水平呈正相關(guān)(圖1B)。

2.2 PD-1 抑制劑對TAM 極化和相關(guān)細胞因子產(chǎn)生的影響

qRT-PCR 和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示,與M0組相比,TAM 組CD206 和STAT6 表達水平升高(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM +Camrelizumab組STAT6 和CD206 表達水平降低(P＜0.05) (圖2)。ELISA 結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組IL-13、TGF-β 分泌水平增加,iNOS 分泌水平減少(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM+Camrelizumab 組IL-13、TGF-β 分泌水平減少,iNOS 分泌水平增加(P＜0.05) (圖3)。

2.3 PD-1 抑制劑對前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響

CCK8 結(jié)果顯示,與M0 組 相比,TAM 組DU145 細胞增殖水平升高,在72 h 時表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM +Camrelizumab 組DU145 細胞增殖水平降低,在72 h 時表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05) (圖4A)。

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組DU145 細胞侵襲能力增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (圖4B)。

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示,與TAM 組相比,TAM+Camrelizumab 組DU145 細胞侵襲能力降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (圖4B)。

2.4 STAT6 對TAM 極化和相關(guān)細胞因子產(chǎn)生的影響

STAT6 抑制處理組結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組CD206 表達水平升高(P＜0.05);與TAM組相比,TAM+AS1517499 組CD206 表達水平降低(P＜0.05) (圖5)。

圖5 抑制STAT6 降低巨噬細胞向TAM 極化

ELISA 結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組IL-13、TGF-β 分泌水平增加,iNOS 分泌水平減少(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM+AS1517499 組IL-13、TGF-β 分泌水平減少,iNOS 分泌水平增加(P＜0.05) (圖6)。

2.5 STAT6 對前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響

CCK8 結(jié)果顯示,與M0 組 相比,TAM 組DU145 細胞增殖水平升高,在72 h 時表現(xiàn)出顯著性差異 (P＜0.05);與TAM 組相比,TAM +AS1517499 組DU145 細胞增殖水平降低,在72 h時表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05) (圖7A)。

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組DU145 細胞侵襲能力增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (圖7B)。

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示,與TAM 組相比,TAM+AS1517499 組DU145 細胞侵襲能力降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (圖7B)。

3 討論

目前在臨床上,前列腺癌治療方式主要包括根治性前列腺手術(shù)切除、放/化療法、內(nèi)分泌療法。此外,臨床常用雄激素剝奪療法,但容易發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌,并與患者較差的預(yù)后情況相關(guān)[10]。隨著近年來對腫瘤形成分子機制和腫瘤免疫微環(huán)境的深入研究,免疫治療取得了突破進展。免疫療法可以重新調(diào)動免疫系統(tǒng),恢復(fù)其識別和殺傷腫瘤細胞的能力。因此,探究新型腫瘤免疫標志物與治療靶點對于前列腺癌的免疫治療至關(guān)重要。

最近幾年研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1 信號通路可以介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,PD-L1 是免疫球蛋白基因家族的跨膜糖蛋白成員,主要在活化的T 和B 淋巴細胞中表達,在多種人體腫瘤細胞中表達[11],目前認為,PD-1/PD-L1 抑制劑通過拮抗PD-1/PD-L1,調(diào)動免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性,尤其是阻斷腫瘤細胞對于T 細胞的負向調(diào)控作用,重新恢復(fù)效應(yīng)T 細胞的腫瘤殺傷功能,阻斷腫瘤細胞免疫逃逸[12]。本實驗發(fā)現(xiàn),與前人的研究結(jié)果相一致,相比于前列腺癌旁組織,癌組織中PD-L1 的表達顯著增加。

腫瘤微環(huán)境 (tumor microenvironment,TME)被認為是許多癌癥(包括前列腺癌) 發(fā)展的關(guān)鍵因素[13]。其中,TAM 作為先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分,在慢性炎癥中起關(guān)鍵作用,是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細胞,占腫瘤質(zhì)量的50 %[14]。TAM 可通過釋放多種細胞因子和基質(zhì)蛋白酶直接促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,或通過介導(dǎo)腫瘤血管生成和免疫抑制間接促進腫瘤進展,TAM 已成為癌癥治療的重要靶點[15]。TAM 具有很強的環(huán)境依賴性和可塑性,分為兩種主要表型;經(jīng)典激活的M1 型通常被認為具有抗腫瘤活性,而激活的M2型巨噬細胞通過抑制腫瘤微環(huán)境中的炎癥和誘導(dǎo)血管生成以支持腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,前者主要分泌iNOS,后者主要分泌IL-13、TGF-β[16]。前列腺癌患者體內(nèi)TAM 的積累通常與預(yù)后不良、治療耐藥和疾病復(fù)發(fā)有關(guān)。Zhang 等[17]的研究表明,前列腺癌患者的腫瘤組織中存在大量的M2 型TAM,可能與腫瘤免疫抑制有關(guān)。與前人研究結(jié)果一致,本實驗研究表明,在前列腺癌組織中CD206 水平升高,而CD206 主要在M2 型巨噬細胞中表達,提示腫瘤組織中M2 型巨噬細胞浸潤可能增加。近期研究表明,與局部前列腺癌相比,轉(zhuǎn)移性前列腺癌中CD206+巨噬細胞的比例更高[18]。結(jié)合本實驗發(fā)現(xiàn)的癌組織中CD206 水平增加,提示TAM 極化的失調(diào)可能影響了前列腺癌的轉(zhuǎn)移。另外,通過Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),PD-1 和CD206 表達水平呈正相關(guān),說明PD-1 可能與TAM 的極化相關(guān)。有研究表明PD-L1 可能參與巨噬細胞介導(dǎo)的免疫抑制[19],下調(diào)PD-L1 可能會影響THP-1 巨噬細胞分化和極化,本實驗發(fā)現(xiàn)PD-1 抑制劑可以抑制CD206 的表達與IL-13、TGF-β 分泌水平,增加iNOS 分泌水平,即抑制PD-1 可抑制M2 型TAM 極化,并抑制前列腺癌細胞增殖和侵襲。

STAT6 屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族。之前研究發(fā)現(xiàn),STAT6 通過控制早期EGR2 和IL-13誘導(dǎo)的MHCⅡ類的表達來促進IL-4 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細胞分化,這對于巨噬細胞M2 型極化是必不可少的[20],此外,STAT6 調(diào)節(jié)巨噬細胞M2 型相關(guān)特定基因的表達,例如Arg1 和Mrc1 等[21]。因此STAT6 可能在癌癥中充當重要的免疫調(diào)節(jié)因子。Huang 等[22]研究發(fā)現(xiàn),促進STAT6 磷酸化信號通路可以促進M2 型巨噬細胞極化,STAT6 參與調(diào)節(jié)M2 型巨噬細胞相關(guān)基因表達,本實驗發(fā)現(xiàn),CD206 和STAT6 的表達水平呈正相關(guān),表明M2 型TAM 極化可能受STAT6 信號通路的調(diào)節(jié)。通過使用STAT6 的抑制劑可以抑制M2 型TAM 極化,并抑制前列腺癌細胞增殖和侵襲,說明抑制PD-1 可能通過抑制STAT6 信號通路,改變腫瘤微環(huán)境中TAM 的極化從而影響癌癥的發(fā)展。

綜上所述,本實驗發(fā)現(xiàn),PD-1 抑制劑通過抑制巨噬細胞向M2 型TAM 極化從而降低前列腺癌細胞的增殖和侵襲,其作用機制可能是通過抑制巨噬細胞STAT6 信號通路,這可為進一步探討前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移機制提供新的思路。