帕熱哈提江·依孜木,麥伍蘭江·阿卜杜熱西提,阿布都克尤木·阿布都吉力力

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科 烏魯木齊市,830001

腦膜瘤(meningioma) 起源于覆蓋大腦和脊髓的軟腦膜的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞,約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30 %,是成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤,發(fā)病率為8.14/100 000[1]。根據(jù)WHO 的分類,大多數(shù)腦膜瘤屬于良性的Ⅰ級,而高達(dá)20 %的腦膜瘤為Ⅱ級或Ⅲ級腦膜瘤,它們更具侵襲性,切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險和并發(fā)癥風(fēng)險更高,導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加[2-3]。為了對腦膜瘤的治療引入新的醫(yī)學(xué)選擇,迫切需要更好地了解驅(qū)動腦膜瘤惡性進(jìn)展和復(fù)發(fā)的分子機制。

隨著腫瘤組織的不斷生長,腫瘤微環(huán)境逐漸變得缺氧。腫瘤內(nèi)低氧水平/缺氧與腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移能力和治療抗性有著密切的關(guān)系。缺氧誘導(dǎo)因子1 (hypoxia-inducible factor 1,HIF-1) 是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的主要調(diào)節(jié)因子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[4],在腫瘤組織中調(diào)控與血管生成、細(xì)胞增殖和存活等病理生理過程相關(guān)的基因的表達(dá)[5-6]。同時,腫瘤將通過過度分泌促血管生成因子,如胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGF1) 促進(jìn)腫瘤血管生成以應(yīng)對缺氧微環(huán)境[7]。

在惡性腦膜瘤組織中,HIF-1 和IGF1/IGF1R是否參與其血管發(fā)生,尚未有深入研究。本次研究擬測定良性腦膜瘤(WHOⅠ級) 和復(fù)發(fā)性腦膜瘤(WHOⅡ～Ⅲ級) 組織中HIF-1α 和IGF1R 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。隨后在間變性腦膜瘤細(xì)胞中探討HIF-1α 對IGF1/IGF1R 軸的直接作用關(guān)系以及其對腦膜瘤血管發(fā)生的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

間變性腦膜瘤細(xì)胞系CRL-3370 細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 購自武漢普諾賽生物(中國)。pGL3-basic 載體購自南京金斯瑞生物(中國),HIF-1α shRNA 及shRNA NT 也委托其代為設(shè)計和合成。ChIP-beads (26159) 購自Thermo Fisher (美國)。兔抗人HIF-1α 單抗(可用于ChIP 實驗)(ab51608),IgG 抗體 (用于 ChIP 實驗)(ab172730),p-IGF1Rβ 多抗(ab5681),IGF1Rβ 單抗(ab182408),VEGFR2 單抗(ab134191) 購自Abcam (美國)。IGF1 (CSB-E04580h) 和VEGF(CSB-E04760h) ELISA 測定試劑盒購自華武漢美生物(中國)。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣本收集 本研究腦膜瘤組織樣本收集自2019 年6 月至2022 年3 月期間來我院治療的37 例腦膜瘤患者手術(shù)切除獲得的瘤組織樣本。所有樣本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查,由兩名經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家按照Willis 等[8]描述的方法進(jìn)行雙盲腦膜瘤分級。證實病例分別屬于: 良性腦膜瘤WHOⅠ級的病例共24 例,其中腦膜內(nèi)皮型腦膜瘤8 例、纖維性腦膜瘤10 例,分泌型腦膜瘤6 例;復(fù)發(fā)病例共13 例,包括屬于WHOⅡ級(共12 例) 的脊索樣腦膜瘤5 例和透明細(xì)胞型腦膜瘤7 例,以及WHOⅢ級(共1 例) 的間變性腦膜瘤。人類正常胎盤組織作為對照組由我院病理科提供。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn),所有瘤組織和胎盤組織來源患者均獲得知情同意,并且該研究完全符合赫爾辛基宣言的原則。

1.2.2 qPCR 按照常規(guī)方法進(jìn)行qPCR 分析 以GAPDH 作為內(nèi)參,qPCR 特異性引物如下(5′～3′): HIF-1α FP 為TAACTGAGAGGTTGAGGGACG,RP 為TCCGACATTGGGAGCTCATT;IGF1R FP 為GGGAAGGAGCTCGCCGCGGCGG,RP 為CTCCGGGTTTGAAAATGGAGGC。

1.2.3 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)按照常規(guī)實驗流程進(jìn)行染色。其中一抗工作液稀釋度為HIF-1α (1∶1 000),IGF1R (1∶ 1 000),HRP標(biāo)記-山羊抗兔IgG (H +L) 二抗工作液稀釋度為(1∶5 000)。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因分析IGF1 基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)元件位點基于轉(zhuǎn)錄起始位點從-3 000～0 bp 構(gòu)建,位點1 位于-1865 bp、位點2 位于-1697 bp、位點3 位于-1506 bp、位點4 位于-065 bp、位點5 位于-703 bp,位點6 位于-393 bp。為了精確確定IGF1 基因啟動子的哪個位點負(fù)責(zé)與HIF-1α 的直接結(jié)合,從IGF1 基因啟動子中刪除每個結(jié)合位點,以驗證HIF-1α 充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子直接作用的位點。將IGF1 基因調(diào)控區(qū)全長或分別刪除位點1～6 后,將其克隆至pGL3-basic載體中熒光素酶報告基因上游,采用雙熒光素酶報告基因分析測定熒光素酶活性變化。

1.2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP) 向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入1 %的甲醛進(jìn)行交聯(lián),然后加入含蛋白酶抑制劑的核裂解緩沖液裂解并提取核顆粒上清液。隨后,將5 μg 每種一抗,HIF-1α 抗體或IgG 抗體(陰性對照) 與核裂解物上清液(1∶5 稀釋) 在4 ℃下孵育過夜。次日,加入20 μL ChIP-beads,在4 ℃下孵育3 h。免疫沉淀物蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物使用ChIP 洗脫緩沖液中洗脫。使用凝膠提取和純化試劑盒純化ChIP DNA。通過下游qPCR 測定ChIP DNA 的相對含量。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)、缺氧培養(yǎng)與共培養(yǎng) CRL-3370細(xì)胞培養(yǎng)于添加有10 % FBS 的完全DMEM 培養(yǎng)液中,HUVECs 培養(yǎng)于含20 % FBS 和3 ng/mL bFGF的完全DMEM 培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)于濕潤的、通入5 % CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞孵育箱中。缺氧培養(yǎng):在誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)時,兩種細(xì)胞均在低氧條件下培養(yǎng),氣體成分為1 % O2、5 % CO2和94 % N2。共培養(yǎng): 使用24 孔板(下層) 配套細(xì)胞小室(上層) 進(jìn)行共培養(yǎng)。在24 孔板下層培養(yǎng)CRL-3370細(xì)胞,在上層細(xì)胞小室中培養(yǎng)HUVECs。

1.2.7 轉(zhuǎn)染 在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞,誘導(dǎo)HIF-1α 的表達(dá)。采用HIF-1α shRNA 進(jìn)行缺氧條件下HIF-1α 的敲低。HIF-1α shRNA 及對照組shRNA NT 序列為(5′～3′): HIF-1α shRNA 為TTGTTATGGTTCTCACAGATG,shRNA NT 為GTGATATCGACCTCTATACGA。使用Lipofectamine 3000 按照常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.8 ELISA 使用商業(yè)化成品人IGF1 和VEGF ELISA 測定試劑盒進(jìn)行測定,具體操作按照試劑盒說明書中的指導(dǎo)進(jìn)行。

1.2.9 CCK-8 細(xì)胞增殖能力測定 使用24 孔板細(xì)胞小室進(jìn)行本實驗。種CRL-3370 細(xì)胞于24 孔板下層培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行缺氧培養(yǎng)24 h。結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后種HUVECs 至上層細(xì)胞小室,在常氧下繼續(xù)共培養(yǎng)2 種細(xì)胞24 h 后,使用CCK-8 細(xì)胞增殖測定試劑盒對HUVECs 的增殖情況進(jìn)行測定。使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光值。

1.2.10 Transwell 細(xì)胞侵襲實驗 細(xì)胞共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染操作同“1.2.9”。預(yù)先將40 μL Matrigel 加至Transwell 細(xì)胞小室的膜上,在37 ℃恒溫中凝固30 min。種HUVECs 于Matrigel 凝膠層上,繼續(xù)培養(yǎng)12 h。取出細(xì)胞小室,使用結(jié)晶紫染色液染色,然后在200 ×放大下觀察、拍照和計數(shù)每個視野下遷移至膜外的細(xì)胞數(shù)。

1.2.11 劃痕實驗 細(xì)胞共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染操作同“1.2.9”。種HUVECs 至細(xì)胞小室中進(jìn)行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞匯合度達(dá)到約100 %后,使用200 μL移液器吸頭創(chuàng)建細(xì)胞劃痕,并在倒置顯微鏡下拍照記錄,記為0 h。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20 h,再拍照記錄,記為20 h 結(jié)果。使用Image J v2.6 進(jìn)行圖像中劃痕寬度分析。細(xì)胞相對遷移率(%)=(20 h 平均細(xì)胞劃痕寬度-0 h 平均細(xì)胞劃痕寬度) ÷0 h 平均細(xì)胞劃痕寬度×100 %。

1.2.12 蛋白免疫印跡 按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測。抗體工作液稀釋度如下: 兔抗人p-IGF1Rβ (1 ∶1 000),IGF1Rβ (1 ∶1 000),VEGFR2(1∶1 500),山羊抗兔IgG (H+L) 二抗(1∶6 000)。使用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物對目的條帶進(jìn)行顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α 和IGF1 在腦膜瘤組織中的表達(dá)情況測定

與正常人類胎盤組織(正常組) 相比,良性腦膜瘤組織(StageⅠ組) 中HIF-1α mRNA 表達(dá)水平無差異(圖1A),IGF1R mRNA 的表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖1B);與StageⅠ組相比,復(fù)發(fā)腦膜瘤組織(StageⅡ～Ⅲ組) 中HIF-1α mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01) (圖1A),IGF1R mRNA 的表達(dá)水平也顯著上調(diào)(P＜0.01) (圖1B)。免疫組織化學(xué)法測定3 組組織中HIF-1α 和IGF1R 的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在正常組和良性腦膜瘤組織(StageⅠ組) 中,靶蛋白HIF-1α 和IGF1R 為陽性著色,代表HIF-1α 和IGF1R 在此組織中正常表達(dá)。與良性腦膜瘤組織(StageⅠ組) 相比,靶蛋白HIF-1α 和IGF1R 在復(fù)發(fā)腦膜瘤組織(StageⅡ組) 中著色增強至強著色(圖1C)。

圖1 HIF-1α 和IGF1 在腦膜瘤中的表達(dá)情況

2.2 HIF-1α 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)IGF1 表達(dá)的作用方式測定

IGF1 基因調(diào)控元件示意圖見圖2A。與對照組相比,IGF1 組的熒光素酶活性明顯上調(diào) (P＜0.05)。與IGF1 組相比,IGF1 啟動子區(qū)刪除位點4組的熒光素酶活性被明顯抑制(P＜0.05) (圖2B)。ChIP 實驗結(jié)果,IGF1 Site-4 中HIF-1α 組的DNA 含量明顯高于其對應(yīng)IgG 組的DNA 含量(P＜0.05) (圖2C)。

圖2 轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α 上調(diào)IGF1 的表達(dá)

2.3 腦膜瘤細(xì)胞中敲低HIF-1α 對其分泌IGF1 和VEGF的影響

與shRNA NT 組相比,HIF-1α shRNA 組間變性腦膜瘤CRL-3370 細(xì)胞分泌IGF1 和VEGF 明顯降低(P＜0.05);對照組與shRNA NT 組之間CRL-3370 細(xì)胞分泌的IGF1 和VEGF 無明顯差異(圖3A、B)。

與shRNA NT 組相比,HIF-1α shRNA 組間變性腦膜瘤CRL-3370 細(xì)胞p-IGF1Rβ、IGF1Rβ 和VEGFR2 的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05);對照組與shRNA NT 組之間上述蛋白質(zhì)表達(dá)水平則無明顯差異(圖3C、D)。

2.4 腦膜瘤細(xì)胞中敲低HIF-1α 對HUVEC2 增殖和血管發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的影響

CRL-3370 細(xì)胞與HUVEC2 共培養(yǎng)條件下,通過缺氧培養(yǎng)誘導(dǎo)CRL-3370 細(xì)胞表達(dá)并隨后敲低其胞內(nèi)HIF-1α 后,測定HUVEC2 增殖能力,與shRNA NT 組相比,HIF-1α shRNA 組HUVEC2 增殖能力明顯降低(P＜0.05);對照組與shRNA NT 組之間則無明顯差異(圖4A)。

圖4 CRL-3370 細(xì)胞與HUVEC2 共培養(yǎng)體系中HUVEC2 的增殖及胞內(nèi)血管發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)情況測定

測定HUVEC2 胞內(nèi)血管發(fā)生相關(guān)基因VEGF、ANGP1 和MMP2 mRNA 表達(dá)水平,與shRNA NT 組相比,HIF-1α shRNA 組HUVEC2 胞內(nèi)VEGF、ANGP1 和MMP2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低 (P＜0.05);對照組與shRNA NT 組之間則無明顯差異(圖4B)。

2.5 腦膜瘤細(xì)胞中敲低HIF-1α 對HUVEC2 遷移和侵襲能

CRL-3370 細(xì)胞與HUVEC2 共培養(yǎng)條件下,通過缺氧培養(yǎng)誘導(dǎo)CRL-3370 細(xì)胞表達(dá)并隨后敲低其胞內(nèi)HIF-1α 后,再通過劃痕實驗對HUVEC2 遷移能力進(jìn)行測定,與shRNA NT 組相比較,HIF-1α shRNA 組HUVEC2 的遷移能力明顯的降低(P＜0.05);對照組與shRNA NT 組之間則無明顯差異(圖5A、B)。

劃痕實驗測定HUVEC2 侵襲的能力,與shRNA NT 組相比較,HIF-1α shRNA 組HUVEC2 的侵襲能力明顯降低(P＜0.05);對照組與shRNA NT組之間則無明顯差異(圖5C、D)。

3 討論

HIF-1 是由α 和β 亞基組成的異源二聚體,前者受O2調(diào)控,后者是組成型表達(dá)。在哺乳動物細(xì)胞中,在常氧條件下,HIF-1α 亞基通過泛素-蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)缺氧發(fā)生后,HIF-1α 的穩(wěn)定性和活性將大大增強,它與共激活因子一起,調(diào)控缺氧應(yīng)答和血管發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá),其中包括VEGF、NOS、TGF-β 和IGF1 等[9-10]。腫瘤微環(huán)境通常為低氧條件。HIF-1α 是發(fā)生在低氧癌細(xì)胞中代謝重編程和腫瘤血管發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[4]。在低氧條件下,HIF-1α 上調(diào)線粒體核糖體蛋白L52的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),隨后通過ROS/Notch1/Snail 信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。HIF-1α 和Keap1-Nrf2 分別作為低氧和氧化應(yīng)激/應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在胰腺癌細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。

IGF1 在諸如內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育、遷移和管形成等生物學(xué)過程中起重要作用[13-14]。IGF1 在乳腺癌中激活S100A7/RAGE 通路促進(jìn)血管生成[15]。IGF1 上調(diào)PI3K-AKT 和Hedgehog 通路促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、腫瘤干細(xì)胞干性和血管發(fā)生[16]。但HIF-1α 和IGF1-IGF1R 的表達(dá)與轉(zhuǎn)移性腦膜瘤進(jìn)展的關(guān)系,尚未有深入研究。在該研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)隨著腦膜瘤由良性(WHOⅠ級) 向復(fù)發(fā)性腦膜瘤 (WHO Ⅱ～Ⅲ級) 進(jìn)展,HIF-1α 和IGF1R 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)增強,說明在腦膜瘤向高級別進(jìn)展過程中HIF-1α 和IGF1R 發(fā)生表達(dá)上調(diào)并參與腫瘤組織應(yīng)對缺氧微環(huán)境。隨后,通過該研究對HIF-1α 和IGF1 的表達(dá)調(diào)控關(guān)系的探討,發(fā)現(xiàn)HIF-1α 能夠直接與IGF1 啟動子區(qū)位點4 區(qū)域DNA 結(jié)合并調(diào)控IGF1 的轉(zhuǎn)錄。這是一項新的發(fā)現(xiàn),首次明確了在腦膜瘤CRL-3370 細(xì)胞中HIF-1α是作用于IGF1 啟動子區(qū)位點4 區(qū)域DNA[17]。

IGF1/IGF1R 信號在促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展過程中還發(fā)揮其他重要的作用。如靶向抑制HIF-1α/IGFBP2 軸可降低IGF1/AKT 信號通路活性,阻斷復(fù)發(fā)性間變性Wilms 瘤的生長和轉(zhuǎn)移[18]。因此,IGF1/IGF1R 信號是抑制多種惡性腫瘤的潛在的關(guān)鍵治療靶點。

已有大量報道VEGF 是腫瘤血管發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用通路。腫瘤細(xì)胞和周圍基質(zhì)分泌的VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活,導(dǎo)致新血管的形成[22]。靶向VEGF-A 的貝伐單抗(Bevacizumab)已長期、成功地應(yīng)用于包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、卵巢癌和宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥的一線治療[19]。事實證明,靶向腫瘤血管發(fā)生的藥物開發(fā)策略是正確的。在該研究中,敲低HIF-1α 能夠抑制間變性腦膜瘤CRL-3370 細(xì)胞分泌VEGF,并能夠抑制其受體蛋白VEGFR2 在間變性腦膜瘤CRL-3370 細(xì)胞中的表達(dá)。即缺氧刺激HIF-1α 表達(dá)上調(diào),可增強腫瘤細(xì)胞VEGF/VEGFR2 軸的信號。與此同時,敲低CRL-3370 胞內(nèi)的HIF-1α,將降低共培養(yǎng)的HUVEC2 的增殖能力,并抑制其胞內(nèi)血管發(fā)生相關(guān)因子VEGF、ANGP1、MMP2 mRNA 的表達(dá);HUVEC2的遷移和侵襲能力也隨之降低。通過上述一系列的研究結(jié)果可知,腫瘤細(xì)胞缺氧引起HIF-1α 上調(diào),可刺激增強周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、向組織中侵襲和形成新血管的能力?；蛟S開發(fā)和使用HIF-1α 抑制劑治療轉(zhuǎn)移性腦膜瘤將會開辟巨大的治療前景[20-21]。

盡管尚未進(jìn)一步探究HIF-1α 抑制劑在復(fù)發(fā)性腦膜瘤中的治療效果。但基于該研究結(jié)果可知,隨著腦膜瘤由良性(WHOⅠ級) 向復(fù)發(fā)性腦膜瘤(WHOⅡ～Ⅲ級) 的進(jìn)展,HIF-1α 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸上調(diào),并隨之增強血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、向組織中侵襲和形成新血管的能力,在腦膜瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮促血管生成的關(guān)鍵作用。