張文娟，李明華，程顯隆，段慶梓，魏鋒，華樺，趙軍寧*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；

2.成都市食品檢驗研究院，四川 成都 611135；

3.四川省中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，四川 成都 610041；

4.四川省中醫(yī)藥科學院，四川 成都 610041

冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis（BerK.）Sacc.是寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，主要分布于3200～5000 m 高寒地區(qū)的高山草甸和峽谷，為貴細傳統(tǒng)中藥材[1-4]。由于近年來過度采挖，其野生資源急劇減少，市場價格畸高，其他外觀相似的蟲草冒充冬蟲夏草的現(xiàn)象比較普遍，常見偽品一般來源于蟲草屬，如古尼蟲草、亞香棒蟲草等。偽品的有效性及安全性尚缺乏全面深入的研究，因此有必要建立相應的真?zhèn)舞b別方法[5-9]。

基于DNA 的分析方法客觀準確，目前被廣泛用于蟲草和其他中藥材的鑒定和真?zhèn)舞b別中。蟲草一般由真菌和蝙蝠蛾幼蟲兩部分組成，因此相關(guān)的鑒別方法研究也多基于這兩部分的不同。真菌的DNA 分析多基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）[10-13]，而蝙蝠蛾幼蟲則多基于蟲體的線粒體基因細胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）[7,14]。可以采用DNA 條形碼鑒定法對蟲草進行鑒定或者鑒別，分析不同蟲草的親緣關(guān)系等；或者采用聚合酶鏈式反應（PCR）、PCR-限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）鑒別法，通過設(shè)計專屬性引物或者依靠專屬性限制性內(nèi)切酶位點，達到鑒別的目的。

本課題組發(fā)現(xiàn)了一種產(chǎn)自四川的特殊蟲草，外觀跟冬蟲夏草非常相似，通常被當作冬蟲夏草使用，但是其微性狀、真菌ITS 序列及蟲體COⅠ序列與冬蟲夏草都具有明顯的區(qū)別，因此認為不應盲目將該蟲草當作冬蟲夏草使用，需要與冬蟲夏草進行鑒別。本研究建立了基于XhoⅠ限制性內(nèi)切酶的PCR-RFLP鑒別法，可以實現(xiàn)冬蟲夏草與該特殊蟲草的客觀準確鑒別，從而為提升冬蟲夏草質(zhì)量控制水平提供有效手段。

1 材料

1.1 樣品

蟲草樣品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院標本館張繼主任藥師鑒定，樣品詳細信息見表1。

表1 蟲草樣品信息

1.2 儀器

VERITI型PCR儀（Thermo Fisher公司）；AB135-S型分析天平（Mettler-Toledo 公司）；EPS-301 型電泳儀（Amersham 公司）；DMC4500 型體視熒光顯微鏡（Leica 公司）；Gel Doc XR+型全自動凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；MM400型球磨儀（Retsch公司）。

1.3 試劑

快捷型植物基因組提取試劑盒（批號：DP321，天根生化科技有限公司）；ExTaq（批號：DRR100B，TaKaRa 公司）；dNTP Mixture（批號：N0447）、XhoⅠ（批號：R0146）均購于Biolabs公司；GelRed（批號：41003，Biotium 公司）；ITS 引物（上游：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，下游：5'-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3'，深圳華大基因科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理與DNA提取

分別取樣品的子座和蟲體部分，用酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛簦栏?；用球磨儀磨成極細粉末，稱取粉末樣品約30 mg 備用?；蚪MDNA 提取按照試劑盒說明書進行操作。

2.2 PCR擴增及序列分析

PCR 反應條件：預變性94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、30 s（35 個循環(huán)）；最后延伸72 ℃、5 min。PCR 反應體系25 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，TaqDNA 聚合酶0.2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.6 μL，反應緩沖液2.5 μL，滅菌超純水20.3 μL。

PCR 樣品送至深圳華大基因科技有限公司進行Sanger 法測序。采用CodonCode Aligner 進行序列拼接、剪切和限制性內(nèi)切酶位點分析；采用MEGA 5.0 進行多序列比對分析，構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)進化樹。

2.3 XhoⅠ酶切反應

反應體系為20 μL，包括PCR產(chǎn)物10 μL、XhoⅠ0.5 μL、反應緩沖液2 μL、滅菌去離子水（ddH2O）7.5 μL。反應條件為37 ℃、15 min。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像

使用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓5 V·cm-1，約40 min；電泳結(jié)束后使用凝膠成像儀拍照并保存結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 冬蟲夏草和特殊蟲草的性狀特征比較

2 種蟲草均由子座部分和蟲體部分組成。與冬蟲夏草相比，特殊蟲草的子座部分較短，蟲體較?。▓D1）。通過體視顯微鏡觀察，特殊蟲草頭部的顏色與冬蟲夏草明顯不同，冬蟲夏草為黃褐色（圖2A），特殊蟲草為紅褐色（圖2B），提示兩者的宿主蝙蝠蛾昆蟲存在不同。

圖1 特殊蟲草與冬蟲夏草的性狀特征

圖2 體式顯微鏡成像顯示冬蟲夏草和特殊蟲草頭部顏色

3.2 冬蟲夏草和特殊蟲草寄生真菌的ITS序列差異

通過對寄生真菌的ITS 序列進行比對分析，冬蟲夏草和特殊蟲草存在7 個差異位點（總長562 bp）（圖3A）；基于ITS 序列的NJ 系統(tǒng)進化樹分析顯示，冬蟲夏草與特殊蟲草各聚為1 支；兩者匯聚后又與偽品蟲草聚為1支（圖3B）。表明特殊蟲草的寄生真菌與冬蟲夏草親緣關(guān)系較近，與常見偽品關(guān)系較遠。

圖3 冬蟲夏草和特殊蟲草的真菌ITS序列分析

3.3 冬蟲夏草和特殊蟲草宿主COⅠ序列差異

對宿主蝙蝠蛾幼蟲的COⅠ序列進行比對分析，冬蟲夏草和特殊蟲草宿主的COⅠ序列存在56 個差異位點（總長659 bp，圖4A）；基于COⅠ序列的NJ系統(tǒng)進化樹分析顯示，特殊蟲草與常見偽品蟲草首先聚為1 支，然后再與冬蟲夏草匯聚，表明特殊蟲草的宿主蝙蝠蛾昆蟲與一些常見偽品具有更近的親緣關(guān)系（圖4B）。

圖4 冬蟲夏草和特殊蟲草的蟲體COⅠ序列分析

3.4 基于真菌ITS 序列限制性內(nèi)切酶位點差異的PCR-RFLP鑒別

用ITS 的通用引物擴增得到冬蟲夏草和特殊蟲草的ITS 區(qū)，并對該區(qū)域進行測序和序列分析。通過進行限制性內(nèi)切酶圖譜的比較分析，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草在該區(qū)域有且只有1 個XhoⅠ的限制性內(nèi)切酶位點，而特殊蟲草在該區(qū)域不存在這一位點（圖5A）。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，冬蟲夏草ITS 擴增產(chǎn)物通過XhoⅠ的限制性內(nèi)切酶作用后被切割為2 個片段，而特殊蟲草的ITS擴增產(chǎn)物不會被XhoⅠ切割，酶切前后電泳條帶的大小及數(shù)量保持一致（圖5B）。該方法可以用于鑒別冬蟲夏草和此類特殊蟲草。

圖5 冬蟲夏草和特殊蟲草ITS序列XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點的PCR-RFLP鑒別

4 討論

冬蟲夏草是一種名貴的中藥材，具有多種有益人體健康的化學成分，應用歷史悠久。隨著人們對健康的重視程度越來越高，對冬蟲夏草的需求也越來越多。然而冬蟲夏草以野生品為主，資源匱乏，近年來市場價格不斷攀升，各種偽品和替代品應運而生，真假難辨，主要偽品來源有古尼蟲草、亞香棒蟲草、新疆蟲草等。偽品和替代品與冬蟲夏草的成分有一定差異，需要進行嚴格區(qū)分以保證冬蟲夏草的安全性和有效性，以及維護市場的公平競爭秩序。通過特異性PCR 或者PCR 結(jié)合限制性內(nèi)切酶的方法，可以有效鑒別冬蟲夏草和相關(guān)偽品及替代品。在運用DNA 分子鑒定方法進行鑒別檢驗時，本課題組發(fā)現(xiàn)了一種特殊的“冬蟲夏草”，其與某些偽品一樣不能被限制性內(nèi)切酶XhoⅠ酶切，而以往本課題組檢測的多批次冬蟲夏草均具有這一酶切位點。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種特殊蟲草的明顯外部特征為復眼顏色偏紅、蟲體較??；寄生真菌的ITS 序列與典型冬蟲夏草比對，發(fā)現(xiàn)多個變異位點，但與幾種常見偽品相比，跟典型冬蟲夏草具有更近的親緣關(guān)系；宿主蝙蝠蛾昆蟲的COⅠ序列與典型冬蟲夏草比對，發(fā)現(xiàn)56 個變異位點，與常見偽品更為近緣。以上結(jié)果表明，特殊蟲草的真菌部分與典型冬蟲夏草最為接近，而蟲體部分與一些偽品更為相似。經(jīng)調(diào)研，這種蟲草一般發(fā)現(xiàn)于四川低海拔地區(qū)，通常以較低的價格作為冬蟲夏草出售。然而，鑒于特殊蟲草與典型冬蟲夏草的真菌子座及宿主蝙蝠蛾昆蟲部分均有明顯不同，是否能夠?qū)⑵渥鳛槎x夏草使用，還應結(jié)合地方用藥歷史考察和物質(zhì)基礎(chǔ)分析[15-18]，必要時進行生物活性和安全性方面的比較評價研究[19-20]，從而確保冬蟲夏草用藥的有效性和安全性。

此外，本研究基于特殊蟲草在ITS 區(qū)域不存在XhoⅠ酶切位點建立了一種基于PCR-RFLP的鑒別方法，為準確鑒別特殊蟲草與典型冬蟲夏草提供了客觀簡便的工具，為冬蟲夏草的精準質(zhì)控提供了技術(shù)儲備。