張宏琪，郝彥鳳，陳曉梅，楊永婧，劉曉倩，王 震

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工系，河北滄州 061100）

二氧化硫（SO2）是食品加工業(yè)常用的防腐劑和漂白劑，在葡萄酒釀造和貯藏過程中起著重要的抑菌和抗氧化作用[1]。然而，諸多研究表明過量的SO2不僅影響葡萄酒的風味品質(zhì)，還會產(chǎn)生人體毒性和致敏性，讓許多患有高敏癥和硫不耐受癥的消費者對含二氧化硫葡萄酒望而卻步[2-3]。近年來，天然化合物因環(huán)境友好和安全性引起了研究者的關(guān)注，其中天然中草藥在抑菌和抗氧化方面都有應(yīng)用。羅鵬[4]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪和黃柏兩種中草藥對熒光假單胞菌具有抑制作用，可以抑制云斑魚感染熒光假單胞菌，從而發(fā)展對環(huán)境無害、安全的綠色魚藥；孟令楠等[5]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥添加劑能夠提高海蘭褐蛋雞的產(chǎn)蛋率，改善抗氧化性能。也出現(xiàn)了一些利用天然化合物代替SO2發(fā)揮作用的相關(guān)研究，例如鮮酵母泥[6]和黑蘿卜提取物[7]對紅葡萄酒的抗氧化活性和揮發(fā)酸表現(xiàn)出和SO2處理相似的效果，有望降低葡萄酒釀造過程中的SO2用量。

本實驗選取了13 種常見中草藥，包含4 種抑菌效果較好的中草藥（栝樓、酸棗仁、地菜子、虎杖）和9 種抗氧化能力較強的中草藥[8]（花生殼、槐花、公丁香、荷葉、藏青果、紫丹參、山萸肉、女貞子、陳皮），使用水提取和乙醇提取兩種方法對中草藥的有效成分進行提取。通過比較4 種中草藥提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長繁殖的抑制能力大小，篩選出抑菌能力最強的中草藥；通過比較9 種中草藥提取液的還原能力和總酚含量[9]，篩選出抗氧化能力最強的中草藥；最后探究二者共同添加替代SO2抑菌和抗氧化的能力，確定二者最適添加量。對添加了中草藥的葡萄酒進行感官評價，探究中草藥對葡萄酒色澤和風味的影響并進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料及菌種：栝樓、酸棗仁、地菜子、虎杖、花生殼、槐花、丁香、荷葉、青果、丹參、山萸肉、女貞子和蘆柑皮，文擇軒中藥材店鋪；巨峰葡萄，市售；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，實驗室保藏；葡萄酒專用酵母，安琪酵母。

試劑及耗材：福林酚試劑、沒食子酸，合肥巴斯夫生物科技有限公司；葡萄糖標準溶液、鐵氰化鉀，河北弘狀元教育科技有限公司；BL 培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、YEPD 培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；鹽酸、酚酞、氫氧化鈉、氯化鈉、淀粉等，天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠；碘化鉀、硫酸銅、無水乙醇等，河北希策生物科技有限公司。

儀器設(shè)備：721型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DH-500 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、101型電熱鼓風干燥箱、SW-CJ-1 凈化工作臺，北京科偉永興儀器有限公司；HH-3 數(shù)顯恒溫水槽，常州榮華儀器制造有限公司；LDZF-50L 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械有限公司；H3-16KR 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PHS-3E 酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ZNHW 數(shù)顯電熱套，上海越眾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥有效成分的提取

1.2.1.1 水提法提取

將13 種中草藥研磨成粉末后稱取10.0 g，分別加入150 mL 蒸餾水,室溫浸泡1.5 h 后，文火煎煮1.0～2.0 h，放冷后用3 層紗布過濾，在藥渣中分別加入100 mL、50 mL 水，重復(fù)煎煮兩次，第1 次1.0 h，第2 次0.5 h。合并三次煎出液，用紗布過濾，95 ℃蒸發(fā)濃縮，用無菌水定容至10 mL（1 mL 相當于1 g 原料），即為提取液，置于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.1.2 醇提法提取

將13 種中草藥研磨成粉末后稱取10.0 g，分別加入150 mL 無水乙醇，保持沸騰回流1.5 h，放冷后過濾；在藥渣中分別添加100 mL、50 mL 無水乙醇再次提取2 次，每次0.5 h。合并濾液，減壓濃縮，定容至10 mL（1 mL 相當于1 g 原料），即為提取液，置于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 菌液制備

將活化好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)挑取單個菌落至BL 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至0.5 麥氏濁度（相當于5×107～5×108cfu/mL），即為供試菌液[12]。

1.2.3 抑菌性測定

1.2.3.1 制備帶藥濾紙片

用打孔器將定性濾紙打成6 mm的小圓片，置于小培養(yǎng)皿中；160 ℃干熱滅菌1.5 h或120 ℃條件下高壓滅菌20 min 備用；取圓形滅菌濾紙4～5 片放入裝有中草藥醇提液的離心管中浸泡過夜24 h[13]。

1.2.3.2 抑菌實驗

將活化的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液分別吸取0.1 mL 與瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，傾倒入平皿中，取3 片提前制備的含中草藥提取液的濾紙片貼在平皿培養(yǎng)基上，進行3 次重復(fù)試驗[14]。對照組分別用無菌水和無水乙醇浸泡的濾紙片進行上述試驗。所有平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，定時觀察和記錄抑菌圈直徑。

1.2.4 總還原能力測定

量取3 mL 中草藥提取液，加入0.2 mol/L pH值為6.6 的磷酸鈉緩沖液1.0 mL 和1%鐵氰化鉀1.0 mL 于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min 后急速冷卻；冷卻后加入10%三氯乙酸1.0 mL，加蒸餾水定容到10 mL，3000 r/min 離心10 min；取離心后的上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻后用蒸餾水定容至5 mL；靜置10 min 后于700 nm 測定其吸光值。吸光值越大則還原力越強，抗氧化能力就越強[15]。

1.2.5 總酚含量測定

采用福林酚法測定中草藥水提取物中的總酚物質(zhì)含量，實驗中以沒食子酸為標準檢測樣品[16-17]。具體步驟為：精確稱取0.05 g 中草藥試樣于10 mL的離心管中，加8 mL 蒸餾水，在90 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，待冷卻至室溫后5000 r/min 離心10 min，取上清液至10 mL 離心管備用。各取1 mL 中草藥提取液于25 mL 容量瓶中，加入福林酚試劑0.4 mL，振蕩混合均勻后加入0.8 mL 12 % 碳酸鈉溶液并定容至25 mL，混合均勻后于55 ℃恒溫反應(yīng)10 min，用分光光度計測定其在765 nm 處的吸光度。

以沒食子酸為標準品，建立標準曲線：精確稱量5 mg 沒食子酸于25 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到25 mL，此時得到濃度為0.2 mg/mL 的沒食子酸溶液。分別取不同量的沒食子酸溶液于25 mL容量瓶中，加入福林酚試劑0.4 mL，混合均勻后加入0.8 mL 12%Na2CO3溶液，振蕩均勻后用蒸餾水定容到25 mL，在55 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，待冷卻到室溫后，用分光光度計測定各溶液在765 nm 處的吸光度并記錄數(shù)據(jù)。以沒食子酸濃度（μ/mL）為橫坐標，765 nm 下吸光度（AU）為縱坐標[18]，繪制沒食子酸標準曲線。

1.2.6 中草藥濃度對葡萄酒發(fā)酵影響評價

1.2.6.1 最佳抑菌中草藥濃度對葡萄酒發(fā)酵的影響

在裝有40 mL 葡萄醪的100 mL 錐形瓶中，分別加入無菌水、50 mg/L 的SO2、2 % 虎杖提取液、5 % 虎杖提取液、8 % 虎杖提取液進行定容，并補加無菌水使添加物體積相同，每個處理做3 個平行。錐形瓶用封口膜封口，于25 ℃自然發(fā)酵。

1.2.6.2 最佳抗氧化中草藥濃度對葡萄酒發(fā)酵的影響

在裝有40 mL 葡萄醪的100 mL 錐形瓶中，分別加入無菌水、50 mg/L 的SO2、2%藏青果提取液、5%藏青果提取液、8 % 藏青果提取液進行定容，并補加無菌水使添加物體積相同，每個處理做3個平行。錐形瓶用封口膜封口，于25 ℃自然發(fā)酵[19]。檢測其褐變程度，褐變程度測定采用吸光值法，通過紫外-可見光分光光度計直接測定樣品在波長420 nm 處的吸光值來表示[20]。

1.2.7 最佳抑菌和抗氧化中草藥濃度共同作用對葡萄酒發(fā)酵的影響

在裝有40 mL 葡萄醪的100 mL 錐形瓶中，分別加入無菌水、50 mg/L 的SO2、最佳濃度抑菌藥物提取液、最佳濃度抗氧化藥物提取液進行定容，并補加無菌水使添加物體積相同，每個處理做3 個平行。錐形瓶用封口膜封口，于25 ℃自然發(fā)酵。利用肉湯培養(yǎng)基檢測細菌數(shù)。在無菌條件下，將發(fā)酵液以10 倍梯度稀釋涂平板，于36 ℃倒置培養(yǎng)24 h后開始計數(shù)，至平板菌落數(shù)不増加為止。最終對所釀葡萄酒中微生物、揮發(fā)酸、褐變度、還原糖等進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果

中草藥中生物堿、黃酮、有機酸、丹寧等對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌等均有一定的抑菌活性[21]。本研究探究中草藥水提物和乙醇提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。

2.1.1 栝樓提取液抑菌評價

由圖1 可知，栝樓醇提液比水提液的抑菌效果更好，24 h 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的抑菌圈大于20 mm，但醇提液對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑變化較大，可能的原因是栝樓在乙醇溶液中穩(wěn)定性較差。栝樓的水提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于對大腸桿菌的抑制效果，抑菌圈直徑在培養(yǎng)過程變化較小，表明栝樓水提液穩(wěn)定性較好。

圖1 栝樓提取液抑菌效果

2.1.2 酸棗仁提取液抑菌評價

圖2 結(jié)果表明，酸棗仁的醇提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較高的抑制能力，抑菌圈直徑均高于15 mm。24 h 時對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到最大值19.2 mm，48 h 時對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到最大值19.2 mm。隨著培養(yǎng)時間的延長，酸棗仁的醇提液抑制效果變化較小，表明酸棗仁醇提液對兩種菌的抑菌性能在長時間內(nèi)發(fā)揮其功效。酸棗仁的水提液對金黃色葡萄球菌的抑制效果要優(yōu)于大腸桿菌抑制，24 h 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到最大值18.3 mm。

圖2 酸棗仁提取液抑菌效果

2.1.3 地菜子提取液抑菌評價

圖3 結(jié)果表明，地菜子的水提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較強的抑制能力，24 h 時抑菌圈直徑均為22.2 mm，并且在長時間內(nèi)都具有一定的抑菌性。地菜子的醇提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用相對較差，24 h 時抑菌圈直徑僅為15.8 mm 和14.2 mm。表明地菜子中有效抑菌成分在水中的溶解性要優(yōu)于在乙醇中的溶解性。

2.1.4 虎杖提取液抑菌評價

圖4 結(jié)果表明，虎杖的醇提取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌產(chǎn)生的抑制效果較為明顯，24 h 時虎杖醇提液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到36 mm，24 h 后虎杖的醇提液對金黃色葡萄球菌的抑菌能力迅速下降，最終穩(wěn)定在18 mm左右。虎杖水提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果相對較差，但其可以在長時間內(nèi)發(fā)揮穩(wěn)定的抑菌作用。

圖4 虎杖提取液抑菌效果

通過對栝樓、地菜子、酸棗仁、虎杖4 種常見中草藥水提液、醇提液的抑菌性研究發(fā)現(xiàn)，4 種中草藥對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較好的抑制能力，使用4 種中草藥的水提物和醇提物處理24 h后，抑菌圈直徑均大于10 mm。其中，虎杖的醇提物對金黃色葡萄球菌抑制效果最為顯著，24 h 時抑菌圈直徑達35 mm，5 d 平均抑菌圈直徑為23.35 mm，144 h 后抑菌圈直徑依舊保持在15 mm以上，因而選擇虎杖代替SO2在葡萄酒釀造及保藏過程中發(fā)揮抑菌能力（表1）。

表1 4種中草藥抑菌性效果

2.2 還原能力測定結(jié)果與分析

物質(zhì)的抗氧化性可通過測定其還原力進行表征，總還原力越大其抗氧化能力越強[22-23]。采用莫開菊等[15]的方法測定9種中草藥提取物處理后的吸光值，吸光值越大則還原力越強，抗氧化能力就越強。由表2 可知，本研究選取的9 種中草藥提取液具有不同程度的總還原力。乙醇提取液的還原能力大小順序：藏青果＞蘆柑皮＞山萸肉＞丁香＞洋槐花＞女貞子＞花生＞丹參＞荷葉，其中藏青果的醇提液吸光值最高，為1.445；水提取液的還原能力大小順序為：山萸肉＞藏青果＞丁香＞女貞子＞丹參＞荷葉＞花生＞蘆柑皮＞洋槐花，其中山萸肉水提液吸光值最高（1.183），藏青果的水提液次之，為1.179。此外，發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取液的抗氧化性大小不同，除丹參和荷葉外，其他7 種中草藥的還原能力均是：乙醇提取物>水提取物，說明其他7 種中草藥用乙醇提取出的抗氧化性成分含量更高。

表3 總酚含量吸光度測定結(jié)果

2.3 總酚量測定結(jié)果與分析

總酚含量的高低是抗氧化能力的重要指標[24]。本研究以沒食子酸為標品，采用福林酚法測定9 種中草藥水提取液中總酚含量[16-17]。圖5 結(jié)果表明，在測定范圍內(nèi)沒食子酸與吸光度具有良好的線性關(guān)系。由標準曲線可得出，在一定范圍內(nèi)，沒食子酸濃度越大，吸光值越大，與之前研究結(jié)果相符[25]。對9 種中草藥的水提液進行測定，總酚含量大小順序：藏青果＞丁香＞洋槐花＞荷葉＞女貞子＞丹參＞蘆柑皮＞山萸肉＞花生，其中藏青果的總酚含量最高，所測得的藏青果總酚平均值為10.634 μg/mL。綜上所述，藏青果在總還原力測定和總酚含量測定中均顯示出最強的抗氧化能力，因此選用藏青果進行后續(xù)的葡萄酒發(fā)酵實驗。

圖5 沒食子酸標準曲線

2.4 虎杖和藏青果的在葡萄酒中使用濃度測定

加入不同濃度虎杖乙醇提取液進行葡萄酒釀造，分別在0 d、4 d、8 d、12 d 和16 d 測定葡萄酒中總細菌殘留數(shù)。由圖6 可知，各實驗組總細菌數(shù)量前4 d 增加，4 d 后開始減少。不同濃度的虎杖乙醇提取液對細菌均有抑制作用，虎杖醇提液添加濃度越大，葡萄酒中細菌數(shù)量越少。故在后續(xù)實驗中選擇用濃度為8 % 的虎杖提取液。

圖6 葡萄酒中不同濃度虎杖醇提液抑菌評價

圖7 葡萄酒中不同濃度藏青果醇提液抗氧化評價

隨著葡萄酒發(fā)酵過程的進行，所有酒樣的褐變程度（吸光度/OD420nm）都迅速降低，然后趨于平緩。添加藏青果實驗組的褐變程度略低于對照組。隨著藏青果濃度的增大，褐變程度有所降低，5%藏青果組與8%藏青果組的褐變程度接近，均優(yōu)于2 % 藏青果組。故后續(xù)實驗中為減少藏青果本身氣味帶來的影響，選擇濃度較低的5%藏青果提取液進行葡萄酒釀造。

2.5 添加8 %虎杖和5 %藏青果提取液釀造葡萄酒分析測定

由表4 可知，添加8 % 虎杖和5 % 藏青果所釀的葡萄酒對細菌和霉菌都起到了抑制作用，但對霉菌的抑制不完全。SO2會減慢自然發(fā)酵的酵母增長速度[26]，而這兩種中草藥對酵母有促進作用，隨著酒精發(fā)酵過程的進行，總酵母數(shù)增加，有助于后續(xù)葡萄酒的發(fā)酵。

表4 發(fā)酵16 d后檢測的菌落數(shù)據(jù)

葡萄酒中揮發(fā)酸的主要成分是乙酸，其產(chǎn)生主要與醋酸菌有關(guān)[27-28]。由表5 可知，添加8 % 虎杖和5%藏青果的葡萄酒能夠減少揮發(fā)酸含量，說明中草藥能抑制醋酸菌的生長和代謝。發(fā)酵降糖是多種微生物共同作用的結(jié)果，SO2的存在會使葡萄酒發(fā)酵過程中耗糖減慢，添加中草藥的葡萄酒也可以很好的降低發(fā)酵耗糖速度。葡萄酒發(fā)酵液中的總酸包括葡萄中原有的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸等，以及發(fā)酵中微生物產(chǎn)生的乳酸和醋酸[29]，虎杖和藏青果提高了葡萄酒發(fā)酵過程中的總酸含量，可能是虎杖和藏青果為產(chǎn)酸微生物提供了營養(yǎng)物質(zhì)，促進了產(chǎn)酸微生物的生長和代謝。與對照組自然發(fā)酵比，中草藥發(fā)酵組色度有所增加。葡萄酒褐變主要是由于酚類物質(zhì)發(fā)生氧化變色造成的，由實驗結(jié)果可知，加入中草藥使葡萄酒褐變度由0.887 降低至0.765，說明藏青果在葡萄酒發(fā)酵過程中起到了一定的抗氧化功效。

表5 發(fā)酵16 d葡萄酒各項指標

3 結(jié)論與展望

本研究初步鑒定出虎杖醇提取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用較強，24 h 時虎杖的醇提液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到36 mm，在144 h 后抑菌圈直徑依舊保持在15 mm 以上。通過還原能力測定藏青果的吸光度最大為1.445，且總酚含量達到了10.634 μg/mL，表現(xiàn)出較強的抗氧化性。進一步研究發(fā)現(xiàn)添加8 %的虎杖醇提液和5 %的藏青果醇提液在葡萄酒中具有較好的抑菌和抗氧化能力，經(jīng)過16 d 發(fā)酵后葡萄酒中細菌數(shù)和褐變程度均較對照組有所降低。

本研究抑菌結(jié)果顯示不同中草藥采用水提法和醇提法得到的提取液對細菌的抑制效果不同[30]，可能的原因有多個方面，可能是由于中草藥中有效抑菌物質(zhì)在不同溶劑中的溶解度不同，或是由于水提法提取溫度較高導(dǎo)致有效抑菌物質(zhì)變性，抑菌效果差異的原因還有待進一步研究。添加中草藥的葡萄酒色澤較深，所以優(yōu)化中草藥有效成分的提取工藝是非常有必要的[31]。本研究初步發(fā)現(xiàn)中草藥在葡萄酒釀造過程中有替代SO2抑菌和抗氧化的能力，但中草藥提取液的加入對葡萄酒風味的影響未進行系統(tǒng)評價，在風味方面進行優(yōu)化或是提取中草藥中有效抑菌和抗氧化成分用于葡萄酒的釀造將是未來工作的重點方向。

虎杖和藏青果具有抑菌和抗氧化性，已有將其運用到食品保鮮和醫(yī)療衛(wèi)生[32-33]等的相關(guān)研究，但尚未有將其作為抑菌劑和抗氧化劑應(yīng)用于葡萄酒釀制的文獻報道，如何充分利用中草藥的特性，還需進一步的深入研究。本實驗最終綜合評估虎杖和藏青果代替SO2的可能性，研究了虎杖和藏青果在葡萄酒釀造中的適宜添加量，為天然抑菌劑在葡萄酒中的應(yīng)用提供參考，有助于開發(fā)安全且具有藥用保健功能的新型葡萄酒產(chǎn)品。符合未來食品綠色、安全的發(fā)展潮流，有助于加深人們對抑菌和抗氧化機理的解析，利用中草藥提取液中有效成分開發(fā)出天然的食品添加劑。