張 瑩,高硯麗,任引剛

(空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:yingangr937@163.com)

肺動脈高壓是一類常見的心血管疾病,預后極差,嚴重危害人類的健康[1]。肺動脈高壓可導致右心室肥大和衰竭,最終引起死亡[2]。肺動脈高壓的病理相當復雜,血管重塑被認為是肺動脈高壓的主要病理特征[3]。平滑肌細胞過度增殖和肥大導致的中膜增厚,是血管重塑重要過程之一。在病理條件的刺激下,肺動脈平滑肌細胞由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型,合成型的平滑肌細胞具有更強的增殖和遷移能力,從而導致肺動脈中膜增厚,血管阻力增加,導致血管壓力持續(xù)升高[4]。目前臨床治療肺動脈高壓的效果并不令人滿意,無法阻止和逆轉(zhuǎn)疾病的進展過程[5]。肺動脈高壓涉及多種基因的異常表達和信號通路的調(diào)控,發(fā)掘?qū)Ψ蝿用}平滑肌增殖和遷移具有重要調(diào)控的基因,可為該疾病的臨床治療干預提供新的思路和治療靶標。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一個多能效的細胞因子,調(diào)控多種生物學過程,并參與多種疾病的發(fā)生和進展過程[6,7]。TGF-β1與轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅰ(transforming growth factor-β receptor Ⅰ,TβRⅠ)結(jié)合,引起細胞質(zhì)內(nèi)Smad2和Smad3的磷酸化,然后磷酸化的Smad2/3蛋白復合體入核,從而激活下游基因的表達[8]。激活后的TGF-β1/Smad信號通路可調(diào)控細胞增殖、遷移、細胞外基質(zhì)合成、細胞分化和細胞表型轉(zhuǎn)化等生物學功能[9]。據(jù)報道,TGF-β1/Smad信號通路的過度激活與肺動脈高壓的進展密切相關(guān)[10]。TGF-β1/Smad信號通路通過促進肺動脈平滑肌細胞的過度增殖和遷移,引起血管重塑,導致肺動脈高壓的發(fā)生[11]。靶向抑制TGF-β1/Smad信號通路已成為開發(fā)肺動脈高壓治療的新策略。因此,TGF-β1/Smad信號通路在肺動脈高壓中的調(diào)控機制值得進一步的研究,探尋對該信號通路具有重要調(diào)控作用的分子,對于開發(fā)新的治療方法具有十分重要的意義。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類7(silent information regulator 2 related enzyme 7,SIRT7)是SIRTs蛋白家族的重要一員,具有組蛋白去乙酰化酶和去琥珀?；傅幕钚訹12]。SIRT7參與多種生物學過程,包括細胞衰老、細胞應激、代謝反應和炎癥反應等,在多種病理條件下發(fā)揮關(guān)鍵作用[13,14]。據(jù)報道,SIRT7過表達能夠促進氣道平滑肌細胞的增殖和遷移[15],表明SIRT7可能參與平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化。目前,關(guān)于SIRT7是否參與肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移,還沒有相關(guān)研究。體外低氧培養(yǎng)人肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)引起細胞的過度增殖和遷移,是體外模擬肺動脈高壓研究的經(jīng)典模型。本文通過該模型研究SIRT7對低氧誘導的HPASMCs增殖和遷移的調(diào)控作用,并探討其可能的分子作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

HPASMCs購自美國菌種保藏中心ATCC;RNA提取試劑Trizol、CCK-8和EdU試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;cDNA合成試劑盒和FastSYBR Mixture購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司;蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司;LV-sh-SIRT7購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;兔抗人SIRT7抗體、GAPDH抗體、TGF-β1抗體和HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔抗人TβRⅠ抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司;兔抗人Smad2抗體、p-Smad2抗體、Smad3抗體和p-Smad3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和慢病毒感染 將HPASMCs接種于含平滑肌細胞生長因子的專屬培養(yǎng)基中,置于5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃生長。將HPASMCs接種于6孔板中(1×106個/孔),按感染復數(shù)(multiply of infection,MOI)為50加入慢病毒,并添加5 μg/ml Polybrene提高感染效率。將細胞板放回細胞培養(yǎng)箱孵育,24 h后更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d;中途更換細胞液,保持良好細胞狀態(tài)。收集細胞檢測靶基因表達變化,并進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組和處理 將HPASMCs分為:常氧對照組、低氧組、低氧+LV-sh-Ctrl組和低氧+LV-sh-SIRT7組。常氧對照組HPASMCs置于常氧培養(yǎng)箱中(含5% CO2和95%空氣)孵育48 h。低氧組HPASMCs置于厭氧培養(yǎng)箱中(含3% O2、5% CO2和92% N2)孵育培養(yǎng)48 h,建立低氧誘導模型。低氧+LV-sh-Ctrl組HPASMCs感染對重組照腺病毒LV-sh-Ctrl,然后進行低氧處理。低氧+LV-sh-SIRT7組HPASMCs感染表達SIRT7 shRNA的重組腺病毒LV-sh-SIRT7,然后進行低氧處理。

1.2.3 RT-qPCR檢測SIRT7的mRNA表達 待細胞處理完成,收集細胞,加入Trizol充分裂解細胞,按試劑盒步驟抽提細胞總RNA。采用SuperRT cDNA合成試劑盒,根據(jù)試劑盒操作步驟,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、FastSYBR Mixture和引物混合為20 μl反應體系,采取預變性95 ℃,20 s;40個循環(huán)的熱循環(huán)程序(變性95 ℃,3 s;退火/延伸60℃,30 s)進行PCR擴增。以GADPH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt公式分析RT-qPCR結(jié)果,計算基因相對表達水平。

1.2.4 Western blotting檢測SIRT7、TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達 待細胞處理完成,收集細胞,加入蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑,充分裂解細胞,提取細胞總蛋白。測定蛋白濃度后,按30 μg/孔將蛋白樣品加到配置好的濃縮膠孔中,進行SDS-PAGE電泳。電泳完成,將蛋白從分離膠中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜放入5%脫脂奶粉中,室溫封閉1 h。將膜放入一抗稀釋液(SIRT7抗體稀釋度為1∶1 000;TGF-β1抗體稀釋度為1∶800;TβRⅠ抗體稀釋度為1∶1 000;Smad2抗體稀釋度為1∶1 000;p-Smad2抗體稀釋度為1∶500;Smad3抗體稀釋度為1∶1 000;p-Smad3抗體稀釋度為1∶500;GAPDH抗體稀釋度為1∶2 000),4 ℃搖床過夜。TBST洗膜,放入到二抗的稀釋液(稀釋度為1∶5 000)中,室溫孵育1 h。二抗孵育完成后,TBST洗膜。將ECL發(fā)光液均勻涂抹膜上,孵育2 min。將膜放入成像儀中,進行成像和拍照。

1.2.5 CCK-8檢測細胞生長活性 將HPAMSCs集中到96孔中,置于5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng),使細胞貼壁。待細胞處理完成,加入CCK-8溶液(10 μl/孔),繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標儀測定細胞溶液在450 nm波長處的吸光度。

1.2.6 EdU檢測細胞增殖 將HPAMSCs接種在蓋玻片上,待細胞處理完成,將EdU溶液加入到細胞培養(yǎng)孔中,使終濃度達到20 μmol/L,細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h。吸去培養(yǎng)液,加入4%多聚甲醛,室溫固定15 min。洗滌細胞,然后加入含0.3% Triton X-100的PBS,室溫避光孵育30 min。洗滌細胞后,加入DAPI溶液,室溫避光孵育10 min,對細胞核進行染色。采用抗熒光淬滅封片液封片,熒光顯微鏡檢測和拍照,選取固定視野對EdU陽性細胞(綠色熒光)數(shù)量和細胞核(藍色)數(shù)量計數(shù),計算細胞增殖率。

1.2.7 Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡實驗 待細胞處理完成后,采用胰酶消化細胞,PBS洗滌和重懸細胞,進行計數(shù)。收集2×105個細胞,重懸在500 μl的1×Annexin Ⅴ Binding Buffer緩沖液中,并加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和5 μl的PI染色液。室溫避光孵育20 min,反應完成后,立即采用式細胞儀分析細胞凋亡比例。

1.2.8 Transwell細胞遷移實驗 收集HPASMCs重懸在不含血清生長因子的培養(yǎng)基中,并加入到Transwell小室(200 μl/孔)。將500 μl含血清生長因子的完全培養(yǎng)基加入到下室。將細胞放入?yún)捬跖囵B(yǎng)中,低氧誘導48 h。取出小室,用棉簽擦除上層殘留的細胞,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min;洗滌后,加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。洗滌并干燥后,采用倒置顯微鏡觀察和拍照。隨機選取3個固定大小的視野,進行計數(shù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 低氧處理HPAMSCs對SIRT7表達的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組SIRT7的mRNA表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖1A)。Western blotting結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組SIRT7的蛋白表達量顯著增加(P<0.01,見圖1B),與SIRT7的mRNA表達水平變化一致。

A.RT-qPCR檢測SIRT7 mRNA表達變化 B. Western blotting檢測SIRT7蛋白表達變化

2.2 感染慢病毒LV-sh-SIRT7對HPAMSCs中SIRT7表達的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示,與低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組SIRT7的mRNA表達水水平顯著降低(P<0.01,見圖2A)。Western blotting結(jié)果顯示,與低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組SIRT7的蛋白表達量顯著減少(P<0.01,見圖2B)。

A.RT-qPCR檢測SIRT7 mRNA表達變化 B.Western blotting檢測SIRT7蛋白表達變化

2.3 基因沉默SIRT7對低氧誘導的HPASMCs生長和增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組HPASMCs的生長活性升高(P<0.01);與低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組HPASMCs的生長活性顯著降低(P<0.01,見圖3)。EdU結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組HPASMCs的增殖率顯著增加(P<0.01);與低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組HPASMCs的增殖率顯著降低(P<0.01,見圖3)。

2.4 基因沉默SIRT7對低氧處理的HPASMCs凋亡的影響

細胞凋亡實驗結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組HPASMCs的凋亡率降低(P<0.05);與低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組HPASMCs的凋亡率顯著升高(P<0.01,見圖4)。

圖4 流式細胞術(shù)檢測基因沉默SIRT7對低氧處理的HPASMCs凋亡的影響

2.5 基因沉默SIRT7對低氧誘導的HPASMCs遷移的影響

Transwell結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組HPASMCs的遷移水平升高(P<0.01);與低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組HPASMCs的遷移水平顯著降低(P<0.01,見圖5)。

圖5 Transwell實驗檢測基因沉默SIRT7對低氧誘導的HPASMCs遷移的影響 (×200)

2.6 基因沉默SIRT7對低氧誘導的HPASMCs中TGF-β1/Smad信號通路的影響

Western blotting結(jié)果顯示,與常氧對照組比較,低氧組和低氧+LV-sh-Ctrl組TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達量增加(P<0.01);與低氧和低氧+LV-sh-Ctrl組比較,低氧+LV-sh-SIRT7組TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達量顯著減少(P<0.01,見圖6)。

3 討論

肺動脈高壓的發(fā)病機制涉及多種基因的異常表達和信號通路的異常調(diào)控。肺動脈平滑肌細胞介導的血管重塑是肺動脈高壓發(fā)病的重要因素。鑒定對肺動脈平滑肌細胞異常增殖和遷移具有調(diào)控作用的基因,對于了解肺動脈高壓的發(fā)病機制,具有十分重要的意義。本文通過低氧處理HPASMCs建立肺動脈高壓研究的一個常用細胞模型,發(fā)現(xiàn)基因敲除SIRT7有效抑制低氧誘導的HPASMCs過度增殖和遷移,并且抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活。本研究表明SIRT7可能通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路在肺動脈高壓的血管重塑過程中發(fā)揮重要作用。

SIRT7對于細胞的存活和增殖具有重要的調(diào)控作用。SIRT7在代謝活躍的細胞中高表達,并且通過調(diào)控rDNA的轉(zhuǎn)錄來促進細胞周期的進展[16,17]。在一些壓力應激條件下,SIRT7能夠抑制細胞凋亡和損傷,提高細胞的存活[18]。但是,細胞過度的增殖和存活會導致其他疾病發(fā)生,例如腫瘤。據(jù)報道,SIRT7在多種腫瘤組織中高表達,并且促進腫瘤細胞的增殖和遷移[19-21]。目前,關(guān)于SIRT7是否參與調(diào)控肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移,尚未有研究報道。本研究發(fā)現(xiàn),SIRT7在低氧處理的HPAMSCs中表達水平升高。通過基因沉默技術(shù)敲低SIRT7在HPAMSCs中的表達水平,則可抑制低氧誘導的細胞增殖和遷移,同時促進細胞的凋亡發(fā)生。本研究結(jié)果與過往研究發(fā)現(xiàn)一致,表明SIRT7對細胞增殖、遷移和凋亡具有重要調(diào)控作用,其介導的肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移可能在肺動脈高壓發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

既往研究表明,SIRT7高度參與平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換,而平滑肌細胞表型的轉(zhuǎn)換是多種疾病發(fā)生的基礎。Fang等[15]報道SIRT7能夠促進氣道平滑肌細胞的增殖和遷移,與哮喘中的氣道重塑密切相關(guān)。在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中,基因沉默SIRT7顯著抑制細胞的增殖和遷移能力[22]。另外,在小鼠股動脈損傷模型中,敲除SIRT7可以減輕內(nèi)膜的增生,與抑制血管平滑肌細胞的增殖密切相關(guān)[22]。這些研究表明,SIRT7與平滑肌細胞過度增殖和遷移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,基因沉默SIRT7有效抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移,表明SIRT7是肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移的促進調(diào)控因子。然而,有一些研究也表明SIRT7對平滑肌細胞的增殖和遷移具有抑制作用。在氧化型低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌細胞中,過表達SIRT7可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[23]。因此,SIRT7可能在不同的病理條件下對平滑肌細胞的增殖和遷移發(fā)揮不同的調(diào)控作用。本研究結(jié)果支持SIRT7對平滑肌細胞的增殖和遷移發(fā)揮促進作用。鑒于此,SIRT7在不同病理條件下對不同類型的平滑肌細胞的調(diào)控作用,值得進一步研究和探討。

TGF-β1/Smad信號通路是調(diào)控肺動脈高壓中血管重塑的一個關(guān)鍵信號通路[10]。TGF-β1通過與細胞膜受體TβRⅠ結(jié)合,引起Smad2/3的磷酸化,引起下游通路的激活,從而促進肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移,導致肺動脈高壓的發(fā)生和進展[24]。鑒定對TGF-β1/Smad信號通路具有調(diào)控作用的分子,對于開發(fā)靶向抑制TGF-β1/Smad信號通路治療肺動脈高壓具有十分重要的意義。目前,多項研究已表明,SIRT7對TGF-β1/Smad信號通路調(diào)控具有重要的調(diào)控作用。在心肌纖維細胞中,基因沉默SIRT7抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活,從而減輕心肌纖維化的發(fā)生[25]?；虺聊琒IRT7通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活,降低瘢痕成纖維細胞的增殖水平,并且促進細胞凋亡的發(fā)生[26]。在氣道平滑肌細胞中,基因沉默SIRT7通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活來減弱細胞的增殖和遷移能力[15]。這些研究表明,SIRT7對TGF-β1/Smad信號通路的激活發(fā)揮促進作用。本研究發(fā)現(xiàn),基因沉默SIRT7可降低TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2和p-Smad3在低氧處理的HPASMCs中的表達水平。因此,本研究結(jié)果與過往報道一致,進一步證明了SIRT7是TGF-β1/Smad信號通路激活的關(guān)鍵調(diào)控分子。

綜上所述,基因沉默SIRT7抑制低氧誘導的HPASMCs的增殖和遷移,其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路密切相關(guān)。本研究表明SIRT7通過調(diào)控肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移介導血管重塑的發(fā)生,在肺動脈高壓的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。本研究為解釋肺動脈高壓的分子發(fā)病機制提供了新的思路,為臨床治療方法的研發(fā)提供了新的靶標和理論基礎。但是,肺動脈高壓發(fā)病機制相當復雜,僅憑體外細胞研究數(shù)據(jù),還不能說明SIRT7在肺動脈高壓的發(fā)病過程中的重要性。因此,關(guān)于SIRT7在肺動脈高壓發(fā)病中的明確作用和分子機制還需通過開展動物模型實驗進行更深入的研究和驗證。