王瑞雪,王海如,李 浩,楊志寧

(1山西白求恩醫(yī)院檢驗科,太原 030032;2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科;3山西省心血管病醫(yī)院檢驗科;*通訊作者,E-mail:mrexcel@yeah.net)

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)是經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKP)的高毒力變種,近幾十年臨床感染率不斷上升[1,2]。hvKP不僅是社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體,還可以引起人體多種部位的單獨感染或共感染,涉及臨床科室眾多,表現(xiàn)復(fù)雜多樣。然而由于人們對hvKP及其相關(guān)疾病認識不足,往往導(dǎo)致漏診、誤診或延遲診斷,引起嚴重的臨床后果[3,4]。目前,hvKP發(fā)病機制尚不明確,更傾向于是宿主、病原體以及宿主和病原體相互作用的綜合結(jié)果[5]。更為棘手的是,近年來隨著高毒力和耐藥性的共同進化,尤其是碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯桿菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae, CR-hvKP)的出現(xiàn),使hvKP的治療成為臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)[6,7]。為了進一步提高人們對非呼吸道hvKP感染相關(guān)疾病的認識,提高診療水平,本研究將從臨床感染特點、細菌耐藥性、高毒力莢膜多糖血清分型及分子分型方面對山西白求恩醫(yī)院非呼吸道標本分離的hvKP進行綜合調(diào)查和分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

171株非呼吸道樣本分離的肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae, KP)來自山西白求恩醫(yī)院2021年10月至2022年12月住院患者血液、膿液、穿刺液、傷口拭子及及清潔中段尿樣本,去除同一患者相同部位重復(fù)分離樣本。

1.2 分組及主要分析指標

分離到的菌株如果攜帶毒力基因iucA及prmpA/prmpA2則納入hvKP組,其余菌株納入cKP組。分析指標包括兩組病例的感染部位、感染類型、年齡、性別、基礎(chǔ)疾病(糖尿病、腫瘤)、血清白蛋白水平,以及菌株耐藥性和高毒力莢膜多糖血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)分布。采用多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)對hvKP進行分子分型。

1.3 患者臨床資料獲取

患者人口學(xué)資料、臨床數(shù)據(jù)通過查閱患者電子病例及實驗室信息系統(tǒng)((laboratory information system, LIS)系統(tǒng)獲得。本次研究得到山西白求恩醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(批準文件號:YXLL-2019-057)。

1.4 菌株鑒定及耐藥性檢測

采用MALDI-TOF MS(德國Bruker公司)對分離菌進行鑒定,得分≥8則視為可靠的鑒定結(jié)果。使用紙片擴散法(K-B法)對所有菌株進行了藥物敏感性檢測。藥敏結(jié)果按照2021年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M100-S31進行結(jié)果判讀。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853由衛(wèi)生部臨床檢驗中心贈送。

1.5 毒力基因及高毒力莢膜多糖血清型檢測

采用PCR擴增方法檢測菌株高毒力基因(iucA、prmpA和prmpA2)以及高毒力莢膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)。擴增引物、體系和擴增條件參考文獻[8,9]。

1.6 多位點序列分析(multilocus sequence typing,MLST)

根據(jù)MLST網(wǎng)站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers-used/)提供的7個管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB及tonB)擴增引物及擴增條件,分別擴增每株菌的7個管家基因,經(jīng)測序后將測序結(jié)果提交到https://bigsdb.pasteur.fr/中進行比對,獲得每株菌的ST分型。管家基因擴增引物、測序引物的合成及測序服務(wù)均由上海生工公司提供。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗、連續(xù)校正χ2檢驗或Fisher’s確切概率法;采用二分類logistic回歸篩選hvKP宿主易感因素;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株及病例收集

本研究共收集了171例菌株,分別來自血液標本55例(32.16%),膿液標本21例(12.28%),穿刺液標本29例(16.96%),傷口拭子21例(12.28%),尿液標本45例(26.32%)。經(jīng)確認后得到hvKP 65株,cKP 106株。在收集的病例中,男性患者99例,女性患者72例;最小年齡3個月,最大年齡91歲。其中0～20歲患者8例,平均(8.2±3.5)歲;20～40歲患者24例,平均(31.2±9.3)歲;40～60歲患者62例,平均(50.1±5.6)歲;≥60歲患者77例,平均(77.6±9.8)歲。

2.2 非呼吸道標本分離的hvKP感染部位分布特點

卡方檢驗結(jié)果提示,引起肝膿腫、膿毒血癥、其他部位膿腫及腹部感染的患者以hvKP引起的更多。hvKP在這4種感染部位具有分布優(yōu)勢(均P<0.05);cKP在尿路感染中具有分布優(yōu)勢(P=0.004)。同時結(jié)果表明,hvKP主要參與社區(qū)獲得性感染(P<0.001),cKP主要參與醫(yī)院獲得性感染(P<0.001,見表1)。

2.3 非呼吸道標本分離hvKP耐藥性分析

目前該醫(yī)院非呼吸道分離的hvKP對多種常見抗菌藥物耐藥率保持在3.08%～18.46%之間。其中阿米卡星和妥布霉素耐藥率最低(分別為3.08%和4.62%),環(huán)丙沙星和頭孢曲松耐藥率最高(分別為18.46%和13.85%)。在65株hvKP中檢出4株CR-hvKP,分離率為6.15%。經(jīng)卡方檢驗,除阿米卡星外,hvKP對其他所測抗菌藥物的耐藥率均顯著低于cKP組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見表2)。

表2 非呼吸道標本分離的hvKP耐藥性分析 株(%)

2.4 非呼吸道標本分離的hvKP宿主易感因素分析

二元logistic回歸表明,患者血清ALB水平<28.6 g/L是非呼吸道hvKP感染獨立危險因素(OR=2.832,95%CI為1.207～6.646,P=0.017)。年齡、性別、糖尿病、腫瘤與hvKP感染相關(guān)性不強(均P>0.05,見表3)。

表3 非呼吸道標本分離hvKP宿主易感性二分類logistic回歸分析 株(%)

2.5 非呼吸道標本分離的hvKP高毒力莢膜多糖血清分型

由表4可見,高毒力莢膜多糖血清型K1、K2是該醫(yī)院非呼吸道標本分離的hvKP的主要流行血清型,分別占hvKP總量的52.31%及21.54%。經(jīng)卡方檢驗,二者在hvKP組中的檢出率顯著高于cKP組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。高毒力莢膜多糖血清型K57、K54、K5、K20在hvKP中檢出率較低分別為4.62%,3.08%,1.54%及1.54%,在兩組之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 非呼吸道標本分離hvKP高毒力莢膜多糖血清分型分析 株(%)

2.6 非呼吸道分離hvKP的MLST結(jié)果分析

本研究共篩選到非呼吸道感染的hvKP 65株,經(jīng)MLST分為18個ST型,其中ST23為33株,占50.77%;ST65及ST86各5株,分別占7.70%;ST11為3株,占4.62%;ST29、ST218、ST380、ST592、ST1049各2株,分別占3.08%;ST25、ST314、ST375、ST412、ST420、ST833、ST1265、ST1557、ST2280各1株,分別占1.54%。7個管家基因擴增片段電泳圖見圖1。將65株hvKP對應(yīng)的7個管家基因序列號進行整理,上傳網(wǎng)址https://online.phyloviz.net/index,繪制最小生成樹(minimum spanning tree, MST)(見圖2)。該醫(yī)院非呼吸道標本分離的hvKP,除外2個單獨型ST11和ST2880,其他克隆均以ST23型為中心進行演化,發(fā)現(xiàn)的4株CR-hvKP分別屬于ST1049、ST833、ST11和ST65,與ST23型管家基因差異數(shù)量多,親緣關(guān)系遠。

圖1 hvKP 7個管家基因瓊脂糖凝膠電泳圖

不同顏色表示不同分群;連線之間的數(shù)值表示管家基因差異數(shù)量

2.7 非呼吸道標本分離的ST23型與非ST23型hvKP高毒力莢膜多糖血清型分布

將65株hvKP分為ST23型和非ST23型,進一步探討ST23型hvKP高毒力莢膜多糖血清型的分布特點?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示,K1血清型在ST23型hvKP存在優(yōu)勢分布(P<0.001),K2血清型在非ST23型hvKP中存在優(yōu)勢分布(P<0.001),K2血清型主要對應(yīng)ST65型(35.71%,5/14)和ST86型(28.57%,4/14),K5、K20、K54、K57和K其他型在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05,見表5)。

表5 非呼吸道標本分離ST23型與非ST23型hvKP高毒力莢膜多糖血清型分布 株(%)

2.8 非呼吸道標本分離的ST23型與非ST23型hvKP耐藥性分析

ST23型hvKP對臨床常用抗菌藥物環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、美羅培南以及亞胺培南的耐藥率均低于非ST23型,但差異均未達到統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。頭孢曲松在ST23型hvKP中耐藥率要高于非ST23型(P=0.027,見表6)。

表6 非呼吸道標本分離的ST23型與非ST23型hvKP耐藥性分析 株(%)

3 討論

hvKP是近些年來備受人們關(guān)注的一種病原微生物,最早由我國臺灣學(xué)者提出,是化膿性肝膿腫的主要病原體。在臨床上hvKP可經(jīng)血流播散感染,引起腦膜炎、腦炎、內(nèi)源性眼內(nèi)炎、壞死性筋膜炎等特殊部位感染,導(dǎo)致嚴重的臨床后果。相關(guān)研究表明,該菌在感染部位、感染人群、傳播途徑、生物學(xué)特征以及耐藥性等方面均與cKP存在顯著的差異[10,11]。然而由于hvKP定義尚不統(tǒng)一,同時亦缺乏簡單可靠的實驗室檢測手段,致使hvKP流行病學(xué)數(shù)據(jù)相對缺乏,在太原市還未有相關(guān)的調(diào)查報告。由于hvKP的高毒力來源于攜帶的特異性毒力基因[12,13],相關(guān)文獻表明毒力基因iucA聯(lián)合prmpA2或prmpA可以很好體現(xiàn)hvKP的特征[1,5,14],故本研究用于定義hvKP進行流行病學(xué)調(diào)查。

研究結(jié)果顯示,該醫(yī)院非呼吸道標本分離hvKP主要引起CAI,僅有27.69%的hvKP參與HAI的發(fā)生,但在醫(yī)院環(huán)境下hvKP很容易獲得耐藥性的突破,成為臨床治療中棘手的問題。因此,很有必要對醫(yī)院環(huán)境中hvKP進行檢測,避免此類菌株在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)的傳播。除泌尿系統(tǒng)感染外,其他部位感染均與hvKP有密切關(guān)系。尿路感染一般認為與病原微生物的逆行感染有關(guān),hvKP則以血流播散進行感染,可能是造成這種現(xiàn)象的主要原因。血清ALB是人體營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn),血清ALB<28.6 g/L的患者更容易遭受hvKP的侵襲,其風(fēng)險是血清ALB>34.7 g/L宿主的2.8倍。然而,2019年Liu等[5]在中國老年人群hvKP感染特征研究中發(fā)現(xiàn),較好營養(yǎng)狀態(tài)的宿主更容易發(fā)生hvKP感染,這與本研究得到的結(jié)果不一致。對于機體營養(yǎng)狀態(tài)與hvKP感染的關(guān)系,可能還需要更細致的年齡分層以及前瞻性研究去揭示二者之間的內(nèi)在聯(lián)系。

hvKP耐藥性調(diào)查結(jié)果表明,現(xiàn)階段該醫(yī)院非呼吸道標本分離的hvKP對臨床常見抗菌藥物耐藥性處于較低水平,除阿米卡星外,均明顯低于cKP。hvKP通常被認為不容易獲得耐藥性,可能的機制為菌株在獲得高毒力質(zhì)粒時,就丟失了耐藥性質(zhì)粒。學(xué)者們最初認為高毒力和高耐藥性不會出現(xiàn)在同一菌株中,但隨著高毒力和高耐藥的共同進化,hvKP的耐藥性也日趨嚴峻。2015年我國首次報道了CR-hvKP,在隨后幾年內(nèi)CR-hvKP檢出率逐漸增高[15],現(xiàn)在該醫(yī)院非呼吸道分離的hvKP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率達到6.15%,是不可忽視的。近年來,以Aerobactin為靶向抗毒力治療的研究,有望最大限度地減少細菌選擇性耐藥,成為解決這一問題的新型途徑[16,17]。

大量研究表明,K1、K2血清型與hvKP高度相關(guān)[1,18],本研究亦得出相同的結(jié)果。同時K1、K2血清型共占該醫(yī)院非呼吸道標本分離的hvKP的70%以上,占有絕對優(yōu)勢。而其他高毒力血清型未發(fā)現(xiàn)與hvKP存在相關(guān)性,可能由于檢出率低,還需要進一步擴大樣本含量進行檢驗,以獲得更準確的結(jié)果。MLST結(jié)果顯示,ST23型為該醫(yī)院非呼吸道標本分離hvKP主要克隆群,與K1血清型高度相關(guān)。與非ST23型hvKP相比,ST23型hvKP更容易獲得頭孢曲松的耐藥,機制尚不清楚。發(fā)現(xiàn)的4株CR-hvKP均不屬于ST23型,并與ST23型存在較遠的親緣關(guān)系,推測ST23型可能更不容易獲得碳青霉烯耐藥表型。

本研究亦存在諸多不足之處,首先本研究納入菌株數(shù)量有限,未能進行更詳細分層去明確不同感染部位hvKP耐藥性、高毒力莢膜多糖血清型、遺傳背景否存在差異。其次,雖然毒力基因iucA聯(lián)合prmpA2或prmpA可以很好體現(xiàn)hvKP的特征,但對hvKP的定義仍然需要動物模型的進一步驗證。在今后研究中將不斷完善實驗設(shè)計,獲得更詳盡的研究數(shù)據(jù)。

綜上所述,本研究表明,該醫(yī)院非呼吸道分離的hvKP主要引起社區(qū)獲得性感染,容易侵犯多個部位形成膿腫(包括肝膿腫)、膿毒血癥及腹部感染,很少引起泌尿系統(tǒng)感染。提高宿主血清ALB水平可能有益于hvKP感染的預(yù)防。目前hvKP對臨床常用抗菌藥物耐藥率保持在較低水平。ST23是其主要分子型別,K1、K2莢膜多糖血清型是其主要血清流行型別。