白立曦,許 靜,段 鵬,謝萬科,徐之超,杜俊凱

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診中心,西安 710061;*通訊作者,E-mail:68631784@qq.com)

骨折是臨床中最常見的創(chuàng)傷之一,雖然手術(shù)治療后大多數(shù)骨折患者都能正常愈合,然而,仍有5%～10%的患者會(huì)出現(xiàn)骨折不愈合或延遲愈合的現(xiàn)象[1]。如何有效加速骨折愈合是骨科重點(diǎn)研究領(lǐng)域,服用促進(jìn)骨折愈合的藥物具有重要作用。L-白雀木醇(L-quebrachitol,L-Q)是一種存在于多種植物中具有光學(xué)活性的肌醇甲氧基類似物。L-白雀木醇具有多種生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗癌等活性[2]。其異構(gòu)體D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞生成具有抑制活性,但對(duì)成骨細(xì)胞生成沒有任何影響[3]。最近有學(xué)者報(bào)道,L-白雀木醇促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1的增殖、分化和礦化[4]。然而,尚不清楚L-白雀木醇在體內(nèi)是否可促進(jìn)骨折愈合。骨折愈合過程中的骨再生類似于胚胎發(fā)生過程,參與這一過程的有骨膜骨化和軟骨內(nèi)骨化兩個(gè)方面,后者的作用更為重要[5]。在軟骨內(nèi)骨化過程中,損傷組織周圍的間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞,形成軟骨橋,然后被編織骨再生替代并最終轉(zhuǎn)變?yōu)榘鍖庸荹6]。多種生長因子和信號(hào)通路參與骨折愈合過程,其中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路扮演重要角色,參與骨折愈合中軟骨細(xì)胞的增殖和分化、軟骨內(nèi)骨化、骨痂改建等各個(gè)階段的調(diào)節(jié)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活通過上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)的表達(dá)促進(jìn)成骨分化[7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制會(huì)延遲軟骨內(nèi)骨化和骨折愈合[8]。本研究通過觀察L-白雀木醇對(duì)脛骨骨折大鼠模型的治療作用及其對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響,旨在探討L-白雀木醇治療骨折愈合的作用和機(jī)制,為骨折的臨床治療提供候選天然藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

L-白雀木醇(HY-N2375)購自美國MedChemExpress。二甲基亞砜(DMSO,SC05064)購自北京凱詩源生物科技有限公司。番紅O-固綠染色試劑盒(G1371)購自北京索萊寶科技有限公司。TRIzol(R0016)、RIPA裂解緩沖液(P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(P0018S)購自碧云天生物技術(shù)研究所Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(4379012001)購自瑞士Roche。SYBR Green Master Mix(Q111)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。Wnt-3a(ab81614)、Wnt-5a(ab235966)、β-catenin(ab223075)、GSK-3β(ab32391)和GAPDH(ab9485)、HRP標(biāo)記的二抗(ab6721)購自英國Abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

ABX Pentra X-120血細(xì)胞分析儀購自法國HORIBA公司。7020全自動(dòng)生化分析儀購自日本日立公司。μCT-40 Micro-CT系統(tǒng)購自瑞士Scanco Medical公司。7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(6～7周,250～280 g)和雌性大鼠(6～7周,180～120 g)購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(陜)2020-001。大鼠飼養(yǎng)于25 ℃、55%相對(duì)濕度的環(huán)境中,光照調(diào)節(jié)設(shè)置為12 h光照/黑暗交替,大鼠自由飲水和進(jìn)食。本研究已獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):2022動(dòng)倫審科字第(216)號(hào))。

1.4 L-白雀木醇安全性評(píng)價(jià)

大鼠預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后,將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和白雀木醇組(L-Q組),每組20只,雌雄各半。對(duì)照組大鼠腹腔注射2 ml的1%二甲基亞砜(DMSO),L-Q組大鼠腹腔注射2 ml劑量為30 mg/(kg·d)的L-白雀木醇,共給藥4周。給藥期間觀察大鼠外觀和行為有無異常,給藥4周后測定大鼠體質(zhì)量、攝食量。末次給藥24 h后,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,使用X-120血細(xì)胞分析儀檢測大鼠的血液學(xué)指標(biāo),包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)。使用7020全自動(dòng)生化分析儀檢測血清生化指標(biāo),包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)和血糖(GLU)。分離大鼠心臟、肝臟和腎臟,計(jì)算臟器系數(shù)(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%),并進(jìn)行HE染色觀察臟器形態(tài)。

1.5 骨折大鼠模型的建立和分組處理

參考文獻(xiàn)[17]方法建立脛骨骨折模型。腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠。右后肢剃毛,在脛骨中上1/3交界處進(jìn)行15 mm的縱向皮膚切口,切開皮膚、皮下組織和筋膜,暴露脛骨,將克氏針自脛骨下端逆行向上打入脛骨上端,用手術(shù)鉗在脛骨中上1/3處切斷脛骨,然后縫合傷口。40只大鼠共有36只建模成功,4只死亡。將36只建模成功的大鼠隨機(jī)分為3組:模型組、10 mg/(kg·d)L-白雀木醇組(10L-Q組)和30 mg/(kg·d)L-白雀木醇組(30L-Q組),每組12只。10L-Q組和30L-Q組大鼠分別腹腔注射2 ml的10 mg/(kg·d)和30 mg/(kg·d)的L-白雀木醇,模型組大鼠腹腔注射2 ml的1% DMSO,各組大鼠均給藥3周。

1.6 X線檢查和Mirco-CT分析大鼠脛骨骨折愈合情況

各組大鼠治療3周后,首先進(jìn)行X線片檢查大鼠脛骨骨折愈合情況。然后解剖并取出脛骨髓內(nèi)釘,使用μCT-40 Micro-CT系統(tǒng)掃描骨痂組織。

1.7 番紅O-固綠染色評(píng)價(jià)骨折愈合情況

分離大鼠脛骨,4%多聚甲醛固定72 h,在4 ℃下用10% DETA脫鈣4周,然后固定在70%乙醇中。再使用75%～100%乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后切成4 μm厚的切片。根據(jù)試劑盒說明對(duì)切片進(jìn)行番紅O-固綠染色。

1.8 qRT-PCR檢測骨痂組織中成骨相關(guān)基因和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol試劑提取大鼠骨痂組織的總RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit將RNA(50 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Master Mix在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR分析。PCR程序如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40次循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。基因特異引物見表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測骨痂組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解緩沖液提取大鼠骨痂組織中的蛋白質(zhì)并使用BCA法測定其含量,取25 μg蛋白質(zhì)采用10% SDS-PAGE電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,并在4 ℃下與Wnt-3a(1∶2 000稀釋)、Wnt-5a(1∶2 000稀釋)、β-catenin(1∶2 000稀釋)、GSK-3β(1∶2 000稀釋)和GAPDH(1∶1 000稀釋)一抗孵育過夜。然后將膜與1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h,并用ECL試劑盒顯影。用ImageJ對(duì)蛋白質(zhì)條帶密度進(jìn)行定量分析。GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 L-白雀木醇的安全性評(píng)價(jià)

對(duì)照組和L-Q組大鼠在給藥4周期間均無明顯外觀和行為異常。在給藥4周期間內(nèi),對(duì)照組和L-Q組大鼠的體質(zhì)量和攝食量均無顯著差異(P>0.05,見表2)。給藥4周后,對(duì)照組和L-Q組大鼠的血液學(xué)指標(biāo)(WBC、RBC、HGB、PLT和LYM)和血清生化指標(biāo)(ALT、AST、BUN、CRE、GLU)水平均無顯著差異(P>0.05),兩組大鼠的心臟、肝臟和腎臟臟器系數(shù)均無顯著差異(P>0.05,見表3～5)。L-Q組大鼠心臟、肝臟和腎臟細(xì)胞形態(tài)正常、排列規(guī)則,無明顯炎性細(xì)胞浸潤,未見明顯臟器組織損傷(見圖1)。

表2 對(duì)照組和L-Q組大鼠給藥4周期間內(nèi)的體質(zhì)量和攝食量

表3 對(duì)照組和L-Q組大鼠給藥4周后的血液學(xué)指標(biāo)水平

表4 對(duì)照組和L-Q組大鼠給藥4周后的血清生化指標(biāo)水平

表5 對(duì)照組和L-Q組大鼠給藥4周后的心臟、肝臟和腎臟臟器系數(shù)

2.2 L-白雀木醇促進(jìn)脛骨骨折大鼠骨折愈合

X線檢查和Mirco-CT分析結(jié)果顯示,給藥3周后,模型組大鼠骨折線明顯,骨痂開始形成,但密度較低;10L-Q組大鼠骨痂致密,骨折線模糊,骨痂跨越骨折端,出現(xiàn)骨性愈合;30L-Q組大鼠骨折線基本消失,骨折愈合情況最佳(見圖2)。骨痂組織番紅O-固綠染色顯示,模型組大鼠骨折端存在較多纖維組織和軟骨細(xì)胞,骨痂內(nèi)可見新生骨小梁和成骨分化;10L-Q組大鼠軟骨細(xì)胞減少,骨痂內(nèi)新生骨小梁明顯增多,成骨分化過程明顯;30L-Q組大鼠可見軟骨細(xì)胞逐漸被編織骨替代,骨痂跨越骨折端,骨性愈合良好(見圖3)。

圖2 各組大鼠建模3周后的X線檢查和Mirco-CT分析

2.3 L-白雀木醇對(duì)脛骨骨折大鼠骨痂組織中成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

與模型組相比,10L-Q組和30L-Q組大鼠骨痂組織中OCN、OPN、Runx2、ALP和BMP-2的mRNA水平均升高(P<0.05,見圖4)。

與模型組比較,*P<0.05;與10L-Q組比較,#P<0.05

2.4 L-白雀木醇對(duì)脛骨骨折大鼠骨痂組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

與模型組相比,10L-Q組和30L-Q組大鼠骨痂組織中Wnt-3a、Wnt-5a和β-catenin的mRNA水平均升高(P<0.05),GSK-3β的mRNA水平降低(P<0.05,見圖5)。

與模型組比較,*P<0.05;與10L-Q組比較,#P<0.05

與模型組相比,10L-Q組和30L-Q組大鼠骨痂組織中Wnt-3a、Wnt-5a和β-catenin蛋白水平均升高(P<0.05),GSK-3β蛋白水平降低(P<0.05,見圖6)。

與模型組比較,*P<0.05;與10L-Q組比較,#P<0.05

3 討論

目前,尚無治療骨折不愈合或延遲愈合的特效藥,因此,急需要開發(fā)相關(guān)藥物[1]。許多植物類化合物能促進(jìn)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨形成,包括糖苷、黃酮類、萜類、香豆素、酚類、酚酸等。L-白雀木醇是從如沙棘等多種植物中分離得到的肌醇甲醚衍生物[9-11]。文獻(xiàn)報(bào)道,L-白雀木醇具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病等多種生物活性[2],并且其異構(gòu)體D-松醇可抑制核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,防止體內(nèi)卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)流失[3]。另外,L-白雀木醇可促進(jìn)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化和礦化[4]?；谏鲜鑫墨I(xiàn)報(bào)道,本研究推測L-白雀木醇可能有助于骨折愈合,因此開展了本項(xiàng)研究。

曾奇兵等[12]報(bào)道,L-白雀木醇的異構(gòu)體D-松醇對(duì)大鼠的最大無毒性作用劑量為雄性30.88 mg/(kg·d)和雌雄33.58 mg/(kg·d)。王夢等[13]應(yīng)用30 mg/(kg·d)的D-松醇治療2型糖尿病大鼠,發(fā)現(xiàn)其可提高大鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力,緩解胰島素抵抗?；谏鲜鑫墨I(xiàn),本研究首先考察了30 mg/(kg·d)的L-白雀木醇連續(xù)灌胃4周的安全性,結(jié)果表明30 mg/(kg·d)的L-白雀木醇給藥未影響大鼠的外觀和行為、體質(zhì)量和攝食量、血液學(xué)指標(biāo)、血清生化指標(biāo),且未對(duì)大鼠心臟、肝臟和腎臟造成損傷,上述結(jié)果說明L-白雀木醇具有良好的安全性。

本研究分別使用10 mg/(kg·d)和30 mg/(kg·d)的L-白雀木醇治療骨折大鼠3周,X線檢查、Mirco-CT分析和骨痂組織番紅O-固綠染色結(jié)果顯示,L-白雀木醇以劑量依賴性方式促進(jìn)脛骨骨折大鼠骨折愈合,主要表現(xiàn)為L-白雀木醇促進(jìn)了軟骨內(nèi)骨化過程,加速了軟骨向編織骨的轉(zhuǎn)化,縮短了骨痂跨越骨折端的時(shí)間。包括OCN、OPN、Runx2、ALP和BMP-2在內(nèi)的多種基因調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化,從而參與骨形成的調(diào)控[14]。據(jù)報(bào)道,BMP-2通過調(diào)節(jié)Runx2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化,Runx2的激活通過增加ALP活性和OCN、OPN等骨基質(zhì)蛋白的合成進(jìn)一步調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[15,16]。Yodthong等[4]報(bào)道,L-白雀木醇可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化和礦化,同時(shí)增加ALP、I型膠原、OCN、OPN、BMP-2和Runx2的表達(dá),下調(diào)RANKL的表達(dá)。本研究顯示,L-白雀木醇劑量依賴性地上調(diào)了脛骨骨折大鼠骨痂組織中OCN、OPN、Runx2、ALP和BMP-2的mRNA水平,這些結(jié)果充分說明L-白雀木醇具有促進(jìn)成骨分化和骨形成的作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化在骨形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞外的Wnt配體與卷曲受體及其輔助受體LRP5和LRP6結(jié)合時(shí),Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活,促進(jìn)了轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中β-catenin的釋放,從而激活靶基因的表達(dá)[17,18]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過激活BMP信號(hào)通路協(xié)同控制成骨細(xì)胞的分化和骨形成[19]。已有報(bào)道稱,Wnt/-catenin信號(hào)通路可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化基因如ALP和OPN的表達(dá)[20],Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活會(huì)抑制成骨細(xì)胞分化[21]。Yodthong等[4]研究也顯示,L-白雀木醇可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。本研究顯示,L-白雀木醇劑量依賴性地上調(diào)了脛骨骨折大鼠骨痂組織中Wnt-3a、Wnt-5a和β-catenin的蛋白表達(dá)水平,降低了GSK-3β的蛋白表達(dá)水平,從而激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路。因此,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可能介導(dǎo)L-白雀木醇對(duì)骨折愈合的促進(jìn)作用。

綜上所述,本研究首次表明L-白雀木醇可促進(jìn)脛骨骨折大鼠骨折愈合,其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。L-白雀木醇可能是治療骨折愈合的潛在天然藥物,具有較高的研究價(jià)值。