陸 哲,歐 莉,張萌萌,李 瑤,謝碩男,康文倩,張依娜,王 欣

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床中藥學(xué)教研室,咸陽 712046;*通訊作者,E-mail:23127438@qq.com)

肌肉萎縮是一種進(jìn)行性骨骼肌細(xì)胞退化疾病[1],當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成與降解不平衡時(shí)就會(huì)發(fā)生肌肉萎縮[2],臨床表現(xiàn)為肌肉體積減少、力量缺失及功能下降,它是骨傷科的常見并發(fā)癥,也繼發(fā)于膿毒癥、癌癥、心力衰竭等疾病[3,4]。肌肉萎縮在中醫(yī)中歸屬于“痿證”,《素問·痿論》中提出了“治痿獨(dú)取陽明”的治法[5],陽明經(jīng)是多氣多血之經(jīng),脾與胃互為表里,皆位于中焦,與陽明經(jīng)聯(lián)系緊密,其中胃主受納,脾主運(yùn)化,脾又為“后天之本”“氣血生化之源”,只有脾運(yùn)化正常,能夠化生氣血陰陽并旁達(dá)四周,才能充養(yǎng)肢體筋脈,有助于痿病的恢復(fù)。本研究收集整理了治療肌肉萎縮的相關(guān)方藥,基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)分析其用藥規(guī)律,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究核心藥對治療肌肉萎縮的作用機(jī)制,并通過分子對接驗(yàn)證結(jié)果,以期為臨床中醫(yī)藥治療肌肉萎縮提供配伍參考,且為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)挖掘

1.1.1 資料來源及篩選 以“中藥”“肌肉萎縮”“痿證”等為關(guān)鍵詞,檢索中國知網(wǎng)(CNKI)2012年1月1日至2022年12月31日與肌肉萎縮相關(guān)的文獻(xiàn),收集中藥處方完整、劑量明確、遵循中醫(yī)辨證思想、有明確療效的文獻(xiàn)。同時(shí)收集《中醫(yī)方劑大辭典》中“主治”或“功用”項(xiàng)下明確記載“肢體軟弱無力”“肌肉松弛”“萎縮”等癥狀的方劑。通過篩選合并,共獲得182首治療肌肉萎縮的方劑。

1.1.2 藥名規(guī)范化 根據(jù)2020版《中國藥典》[6]對中藥名稱進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。例如將“薄桂”“桂心”統(tǒng)一為“肉桂”,“元胡”統(tǒng)一為“延胡索”,“破故紙”統(tǒng)一為“補(bǔ)骨脂”等。

1.1.3 數(shù)據(jù)錄入及分析 在中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)(V2.5)軟件“平臺(tái)管理”項(xiàng)下的“方劑管理”中依次錄入已收集的182首方劑,由雙人對錄入數(shù)據(jù)進(jìn)行審核,確保信息的準(zhǔn)確性。而后在該軟件“數(shù)據(jù)分析”中進(jìn)行藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)及關(guān)聯(lián)分析,獲得核心藥對。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.2.1 核心藥對活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中檢索核心藥對的所有化學(xué)成分,將口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分。在TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中獲取活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選及藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取 在OMIM、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫中以“muscle atrophy”為關(guān)鍵詞檢索疾病靶點(diǎn),利用在線韋恩分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)獲取藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集,得到的靶點(diǎn)即為核心藥對治療肌肉萎縮的作用靶點(diǎn),利用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建核心藥對治療肌肉萎縮活性成分與潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 ①在STRING 11.5數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行交集靶點(diǎn)的PPI分析,然后使用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,經(jīng)過軟件內(nèi)置的插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?得出核心靶點(diǎn);②在Metascape數(shù)據(jù)庫里完成交集靶點(diǎn)的GO及KEGG富集分析,設(shè)定P<0.01,并將相關(guān)結(jié)果利用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn)以柱狀圖和氣泡圖的形式輸出;③分子對接:在PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),蛋白的去水、去配體等操作在PyMOL軟件完成,在Pubchem數(shù)據(jù)庫下載化合物的3D結(jié)構(gòu),蛋白受體和小分子配體的常規(guī)處理在AutoDockTools 1.5.7里進(jìn)行,將結(jié)果輸出為pdbqt格式文件,利用AutoDock 4.2.6對蛋白受體與配體進(jìn)行分子對接操作并獲取二者的結(jié)合能,部分結(jié)果在PyMOL軟件中進(jìn)行可視化處理。方法步驟參考文獻(xiàn)[7,8]。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 藥物頻數(shù)分析結(jié)果 治療肌肉萎縮的182首方劑共應(yīng)用201味中藥,其中排列在前20味的中藥分別為補(bǔ)虛藥(黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、白術(shù)、人參、甘草、山藥、白芍、麥冬、肉蓯蓉、石斛)、活血化瘀藥(牛膝、川芎)、利水滲濕藥(茯苓)、溫里藥(肉桂、附子)、理氣藥(陳皮)、清熱藥(黃柏)、收澀藥(五味子、山茱萸)。按照頻次降序排列,見表1。

表1 排名前20味治療肌肉萎縮的中藥分布

2.1.2 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的藥物組合分析結(jié)果 設(shè)置支持個(gè)數(shù)為40(表示所有藥物中同時(shí)出現(xiàn)的個(gè)數(shù)),置信度為0.7,點(diǎn)擊“用藥模式”,將支持度排名前10的藥對展示,結(jié)果見表2,其中人參-黃芪組合支持度最高,黃芪-熟地黃次之,結(jié)合藥物頻數(shù)分析結(jié)果,選擇黃芪-熟地黃作為核心藥對進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 核心藥對活性成分和靶點(diǎn)的獲取 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選共得到19個(gè)活性成分,其中黃芪17個(gè),熟地黃2個(gè),具體信息見表3。從TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中獲得相應(yīng)靶點(diǎn),最終獲得黃芪-熟地黃藥對相關(guān)靶點(diǎn)319個(gè)。

表3 黃芪-熟地黃活性成分

2.2.2 核心藥對治療肌肉萎縮活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過檢索OMIM、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫,篩選得到1 799個(gè)與肌肉萎縮相關(guān)的靶點(diǎn),與藥物靶點(diǎn)交集后得到86個(gè)共同靶點(diǎn)。核心藥對治療肌肉萎縮活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape軟件構(gòu)建。該網(wǎng)絡(luò)共有102個(gè)節(jié)點(diǎn),196條邊(見圖1)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示,度值排名前三的成分分別是槲皮素(MOL000098)、山奈酚(MOL000422)和豆甾醇(MOL000449),說明這3種成分可能在治療肌肉萎縮中起到關(guān)鍵作用。

黃色三角形代表黃芪的活性成分,藍(lán)色三角形代表熟地黃的活性成分,綠色菱形代表作用靶點(diǎn),每條邊代表節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 黃芪-熟地黃藥對與肌肉萎縮交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)共有85個(gè)節(jié)點(diǎn),1 418條邊(見圖2)。圖中圓形分別代表85個(gè)交集靶點(diǎn),網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫降闹虚g中心性平均值為56.329,接近中心性平均值為0.619,度值平均值為33.365。其中度值較高的靶點(diǎn)有AKT1、TNF、IL-6等,說明這些靶點(diǎn)在黃芪-熟地黃藥對治療肌肉萎縮的作用機(jī)制中發(fā)揮了相對重要的作用。

圓形面積越大、顏色越深,表示該節(jié)點(diǎn)度值越大,在網(wǎng)絡(luò)中越重要。圖中每條邊代表各節(jié)點(diǎn)相互作用的關(guān)系,其中線條顏色越深,代表相互作用的關(guān)系越緊密

2.2.4 GO及KEGG富集分析 GO富集分析共得到1 616條生物過程(biological process,BP),90條細(xì)胞組成(cellular component,CC),117條分子功能(molecular function,MF),將部分條目可視化,結(jié)果見圖3。BP主要包括對無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對氧氣水平的反應(yīng)、磷酸化的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)等;CC主要包括膜筏、膜微區(qū)和囊泡腔等;MF主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性和信號(hào)受體活化劑活性等。

圖3 黃芪-熟地黃治療肌肉萎縮的GO富集分析

KEGG通路富集分析共得到176條通路,將部分通路進(jìn)行可視化(P值排名前20),結(jié)果發(fā)現(xiàn),主要包括癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等(見圖4)。

氣泡面積越大,顏色越深,代表基因靶點(diǎn)在該通路富集程度越高

2.2.5 分子對接結(jié)果 選取度值排名前三的成分及PPI排名前三的靶點(diǎn)使用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接,結(jié)果顯示,核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol(見表4),說明二者有較好的蛋白結(jié)合活性。將部分對接結(jié)果進(jìn)行可視化,結(jié)果見圖5。

圖5 核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接三維結(jié)構(gòu)圖

表4 核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能 (kJ/mol)

3 討論

本研究收集整理了近10年中國知網(wǎng)以及《中醫(yī)方劑大辭典》中治療肌肉萎縮的方劑,利用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示補(bǔ)虛藥應(yīng)用最多,活血化瘀藥次之,符合中醫(yī)治療肌肉萎縮的用藥原則,根據(jù)藥物頻數(shù)分析和關(guān)聯(lián)分析得出黃芪-熟地黃為治療肌肉萎縮的核心藥對。黃芪和熟地黃配伍能補(bǔ)氣養(yǎng)陰生血?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃芪具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)內(nèi)臟、調(diào)節(jié)血壓和抗腫瘤等作用[9,10],并能改善廢用性大鼠骨骼肌萎縮[11]。熟地黃具有提高免疫力、促進(jìn)造血、抗氧化、影響骨代謝和增強(qiáng)記憶力等作用[12],有研究表明地黃多糖可以顯著降低大鼠骨骼肌中FOXO1、MAFbx和MuRF1 mRNA的表達(dá)水平[13]。同時(shí),二藥配伍作為基礎(chǔ)方治療肌肉萎縮也有較好的療效。研究顯示補(bǔ)腎健脾活血方對懸尾大鼠骨丟失和肌肉萎縮具有改善作用[14]。此外,補(bǔ)腎健脾方還能有效抑制蛋白質(zhì)分解代謝,延緩糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮[15]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對黃芪-熟地黃藥對進(jìn)行分析,得出槲皮素、山奈酚、豆甾醇等可能是治療肌肉萎縮的核心成分。槲皮素是黃酮類化合物,研究表明槲皮素通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)和逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位(ΔΨm)失衡保護(hù)地塞米松誘導(dǎo)的肌肉萎縮,從而抑制細(xì)胞凋亡[16]。此外,槲皮素還可以通過上調(diào)HO-1,從而減少在肥胖條件下TNF-α誘導(dǎo)的肌肉萎縮[17]。研究表明山奈酚通過抑制NOX活化,發(fā)揮胞質(zhì)中的抗氧化作用,減少ROS生成,從而完成對細(xì)胞的保護(hù)作用[18]。豆甾醇是一種天然存在的類固醇,研究顯示豆甾醇通過SREBF2減少IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷中的細(xì)胞損傷[19]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅贸鯝KT1、TNF、IL-6等可能是黃芪-熟地黃藥對治療肌肉萎縮的重要靶點(diǎn)。AKT1是AKT基因家族的一員,對于骨骼肌質(zhì)量和功能的調(diào)節(jié)非常重要,有研究表明缺乏AKT1的小鼠肌肉質(zhì)量和收縮力都會(huì)降低[20]。TNF家族包括TNF-α和TNF-β,其中TNF-α是一種多向性的促炎性細(xì)胞因子,研究表明高水平的TNF-α?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)合成減慢及蛋白質(zhì)分解加快,其結(jié)果是骨骼肌萎縮[21]。此外,TNF-α還可通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族,從而抑制骨骼肌再生與修復(fù)[21]。IL-6能促進(jìn)蛋白質(zhì)降解并抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo),這可能會(huì)減少肌肉蛋白質(zhì)合成,從而減少蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[22]。

KEGG通路富集結(jié)果顯示,黃芪-熟地黃藥治療肌肉萎縮主要與PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路和癌癥通路有關(guān)。PI3K-Akt信號(hào)通路主要參與細(xì)胞增殖、分化等,研究顯示P13K-Akt信號(hào)通路活性降低,可導(dǎo)致肌肉萎縮[23]。IGF-1是一種促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的重要因子,當(dāng)發(fā)生肌肉萎縮時(shí),IGF-1水平降低,抑制PI3K-Akt通路從而減少成肌相關(guān)蛋白合成[24]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子是PI3K-Akt信號(hào)通路的一個(gè)下游靶點(diǎn),當(dāng)磷酸化時(shí)留在細(xì)胞質(zhì)中,去磷酸化后可進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用[23]。AKT是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,被激動(dòng)后通過磷酸化可以抑制FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族的核轉(zhuǎn)位,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成來阻止肌肉萎縮誘導(dǎo)的Atrogin-1和MURF1等相關(guān)基因的表達(dá)[25,26]。HIF-1α是一種缺氧誘導(dǎo)因子,主要參與氧轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝適應(yīng)、新血管形成和各種細(xì)胞功能[27]。已有研究表明,HIF-1α在肌肉減少癥中起作用,并參與肌衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[28]。此外,有研究闡釋了一種新的肌肉萎縮機(jī)制,當(dāng)發(fā)生肌肉損傷時(shí),HIF-1α被激活使鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)升高,受傷肌肉中鐵濃度降低,導(dǎo)致肌細(xì)胞丟失和線粒體膜電位明顯耗竭,從而導(dǎo)致肌肉萎縮[29]。最后,癌癥通路雖然富集程度最高,但它與肌肉萎縮的相關(guān)性缺乏研究支持。

分子對接結(jié)果顯示,黃芪-熟地黃核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol,提示二者之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

綜上所述,本研究通過數(shù)據(jù)挖掘探究中藥治療肌肉萎縮的用藥規(guī)律,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析得出核心藥對的有效成分槲皮素、山奈酚、豆甾醇可能通過PI3K-Akt、HIF-1等信號(hào)通路調(diào)控AKT1、TNF、IL-6等基因靶點(diǎn)對肌肉萎縮起到治療作用。本研究揭示了黃芪-熟地黃藥對通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)治療肌肉萎縮的可能的作用機(jī)制,并且經(jīng)過分子對接技術(shù)得以初步驗(yàn)證,但仍需進(jìn)一步通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證。