師國袁,陳 璇

(1山西醫(yī)科大學藥學院,太原 030000;2山西醫(yī)科大學藥物分析教研室;*通訊作者,E-mail:wanfamoni_852@tom.com)

甜夢口服液(甜夢合劑),具有益氣補腎、健脾和胃、養(yǎng)心安神等功能,臨床主要用于治療頭暈耳鳴、視減聽衰、失眠健忘、食欲不振、腰膝酸軟、心慌氣短、中風后遺癥等病癥的治療,且其對腦功能減退、冠狀血管疾患、腦血管栓塞及脫發(fā)也有一定作用[1-3]。甜夢口服液(甜夢合劑)系由刺五加、制馬錢子、炙淫羊藿、澤瀉、黃精等17味藥材,采用煎煮、過濾、濾液濃縮、滅菌、灌封等工藝加工制成的口服中藥制劑,藥材組成中刺五加具有益氣健脾、補腎安神等功效[4-6],淫羊藿具有促進人體造血功能、免疫功能、抗衰老、抗腫瘤等功效[7-9];澤瀉具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效[10-12]。目前,隨著我國人口老齡化趨勢的加重,越來越多的老年朋友患有失眠健忘、腰膝酸軟等癥狀,因此甜夢口服液(甜夢合劑)在醫(yī)院臨床使用范圍和使用量也日趨增多。甜夢口服液(甜夢合劑)現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》一部中,其質(zhì)量控制項目中的含量測定項,是以淫羊藿藥材為檢測對象,即通過控制淫羊藿苷成分的含量[13],實現(xiàn)對甜夢口服液(甜夢合劑)的含量質(zhì)量控制。因甜夢口服液(甜夢合劑)藥材組成較多,僅通過控制一種藥材進行含量的質(zhì)量控制,不能較全面地監(jiān)測該藥品的質(zhì)量水平。因此,實驗建立RP-HPLC法同時檢測甜夢口服液中的淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰澤瀉醇B成分含量的分析方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-30A型高效液相色譜儀,配置在線脫氣機、DAD檢測器等(日本Shimadzu科技有限公司);梅特勒-托利多AE200型電子天平(精度為萬分之一,瑞士Mettler-Toled科技有限公司);Shimadzu CLC ODS C18液相色譜柱(日本Shimadzu科技有限公司);KQ-3200 ES型超聲波清洗機(昆山超聲設備公司)。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品(CAS號為118-34-3,批號為111574-202106,含量以94.3%計,規(guī)格為20 mg/支)、淫羊藿苷對照品(CAS號為489-32-7,批號為110737-202017,含量以98.1%計,規(guī)格為20 mg/支)、23-乙酰澤瀉醇B對照品(CAS號為26575-95-1,批號為111846-202006,含量以98.3%計,規(guī)格為20 mg/支),均購買于中國食品藥品檢定研究院。甜夢口服液(甜夢合劑)供試品,為榮昌制藥(淄博)有限公司生產(chǎn)的市售產(chǎn)品(規(guī)格:每支裝10 ml,批號:20220112、20220232、20220302);乙腈、甲醇:HPLC級,購自德國賽爾策FLUKA試劑有限公司;實驗用水:去離子水,自制;其他試劑:分析純,購自國藥集團。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shimadzu CLC ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),色譜柱溫:30 ℃。以0.3%磷酸溶液(流動相A)-乙腈(流動相B)為流動相,梯度洗脫(0～4 min,95%A;4～7 min,95%～78%A;7～10 min,78%～38%A;10～16 min,38%～26%A;16～23 min,26%～19%A;23～28min,19%A;28～28.5 min,95%A;流速:1.0 ml/min),測定波長:淫羊藿苷為271 nm、紫丁香苷為265 nm和23-乙酰澤瀉醇B為207 nm,進樣體積:10 μl。

2.2 溶液制備方法

2.2.1 單個對照品儲備液 取淫羊藿苷對照品,精密稱取適量,置10 ml量瓶中,制備每1 ml溶液中含淫羊藿苷196.2 μg的對照品儲備液,同法分別制備每1 ml溶液中含754.4 μg紫丁香苷和196.6 μg 23-乙酰澤瀉醇B的單個對照品儲備液,分別加甲醇定容,搖勻。

2.2.2 對照品溶液 取2.2.1淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰澤瀉醇B單個對照品儲備溶液,分別準確吸取1.0 ml,置同一支10 ml棕色量瓶中,加甲醇定容,搖勻即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按甜夢口服液(甜夢合劑)制備方法和藥材比例,分別制備缺淫羊藿、刺五加和澤瀉藥材的陰性供試品,陰性供試品按2.2.4供試品溶液制備方法,分別制備缺淫羊藿、刺五加和澤瀉的陰性供試品溶液。

2.2.4 供試品溶液 取甜夢口服液(甜夢合劑)供試品,精密移取1.0 ml,置10 ml棕色量瓶中,加95%甲醇溶液溶解,超聲提取15 min(超聲功率250 W,頻率50 Hz),取出放冷,加95%甲醇溶液定容,搖勻,0.45 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即為供試品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性考察 取2.2.2對照品溶液、2.2.3陰性供試品溶液和2.2.4供試品溶液,按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述溶液分別注入10 μl,采集譜圖峰面積。結果發(fā)現(xiàn),在陰性供試品溶液譜圖中,淫羊藿苷、紫丁香苷和23-乙酰澤瀉醇B組分對應的位置無干擾,3種成分分離良好,理論塔板數(shù)均大于2 000(見圖1)。

2.3.2 儀器精密度考察 取2.2.2對照品溶液,按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述溶液連續(xù)進樣6次,每次注入10 μl,采集譜圖峰面積。根據(jù)譜圖記錄的紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷峰面積計算RSD(相對標準偏差)。結果顯示,紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷峰面積RSD分別為1.2%,1.0%和1.1%,表明儀器具有良好的精密度。

2.3.3 方法重復性考察 取甜夢口服液(甜夢合劑)供試品(規(guī)格:每支裝10 ml,批號:20220112),精密移取1.0 ml,置10 ml棕色量瓶中,平行取樣6份,后續(xù)按2.2.4供試品溶液制備方法進行處理,得6份供試品溶液,按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述溶液分別注入10 μl,采集譜圖峰面積。以紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷6次檢測結果計算RSD。結果顯示,紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷檢測結果RSD分別為1.5%,1.2%和1.4%,表明方法具有良好的重復性。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取甜夢口服液(甜夢合劑)供試品(規(guī)格:每支裝10 ml,批號:20220112),按2.2.4供試品溶液制備方法進行處理,得供試品溶液,常溫放置,分別于0,4,8,12,16,24 h取樣分析,按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述取樣點分別注入10 μl,采集譜圖峰面積。以紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷峰面積計算RSD。結果發(fā)現(xiàn),紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷峰面積RSD分別為1.1%,1.4%和0.9%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 線性關系考察 取2.2.1紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷單個對照品儲備溶液,分別準確移取0.01,0.05,0.1,0.5,1 ml,置5個10 ml棕色量瓶中,加95%甲醇溶液定容,搖勻,按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述溶液分別注入10 μl,采集譜圖峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標、濃度(X)為橫坐標進行線性回歸,計算曲線方程。結果表明,紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷分別在0.196 2～19.62 μg/ml,0.754 4～75.44 μg/ml和0.196 6～19.66 μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系,相關系數(shù)均在0.995以上(見表1)。

表1 三種組分曲線方程、線性系數(shù)及范圍

2.3.6 加樣回收考察 取已測定紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷含量的甜夢口服液(甜夢合劑)供試品(規(guī)格:每支裝10 ml,批號:20220112),精密移取1.0 ml,置10 ml棕色量瓶中,平行取樣6份,分別加入2.2.1紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷單個對照品儲備溶液適量,再按2.2.4供試品溶液制備方法進行處理,得6份加標溶液;按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述溶液分別注入10 μl,采集譜圖峰面積。計算回收考察結果。結果表明,紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷平均加樣回收率分別為99.47%,98.69%和100.26%(見表2),表明方法準確度良好。

表2 甜夢口服液供試品加標回收考察結果

2.4 市售供試品檢測

取甜夢口服液(甜夢合劑)供試品(榮昌制藥(淄博)有限公司生產(chǎn)的市售產(chǎn)品,規(guī)格:每支裝10 ml,批號:20220112、20220232、20220302),按2.2.4供試品溶液制備方法進行處理,每個供試品處理2份平行樣;按2.1色譜條件設置液相色譜儀,上述溶液分別注入10 μl,采集譜圖峰面積。根據(jù)峰面積計算3批供試品中紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷的含量,結果見表3。

表3 甜夢口服液中紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷含量檢測結果 (mg/ml)

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

甜夢口服液(甜夢合劑)供試品基質(zhì)較為復雜,由17味藥材組成,因此選擇合適的提取條件對提高檢測靈敏度、降低基質(zhì)干擾等具有關鍵的作用。實驗分別考察選擇85%,90%,95%甲醇溶液和無水甲醇[14-16]時,對甜夢口服液(甜夢合劑)供試品中紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷的提取效果,結果選擇95%甲醇溶液時提取效果最佳;確定提取溶劑后,分別考察超聲功率和超聲時間的影響,最終確定最佳的提取條件為:甲醇作為提取溶劑,超聲功率控制250 W,時間控制15 min。

3.2 流動相體系的選擇

液相色譜法常用的流動相有甲醇體系和乙腈體系[17-19],試驗分別選擇甲醇-水、乙腈-水、0.3%磷酸溶液-甲醇和0.3%磷酸溶液-乙腈作為流動相體系時,考察紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷3種待測組分的出峰時間、分離效果等。結果發(fā)現(xiàn),選擇甲醇體系時,紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷出峰時間較長,且因23-乙酰澤瀉醇B最大吸收波長在207 nm附近,故23-乙酰澤瀉醇B信號背景干擾較大,定量準確度偏低;選擇乙腈-水體系時,淫羊藿苷色譜峰發(fā)生分叉,定量準確度偏低;選擇0.3%磷酸溶液-乙腈時,3種待測組分分離良好,分析時間較短,且無基質(zhì)干擾。故實驗選擇0.3%磷酸溶液-乙腈作為流動相體系。

3.3 檢測波長的選擇

實驗選取甜夢口服液(甜夢合劑)藥材組成中的淫羊藿、刺五加和澤瀉3種藥材,通過控制這3種藥材的藥效活性成分作為其質(zhì)量控制的指標。取2.2.2紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷對照品溶液,按2.1色譜條件設置液相色譜儀,設置波長掃描為200～400 nm[20-22],上述溶液注入10 μl,采集紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷光譜圖。結果顯示,紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷最大吸收波長分別在265 nm,207 nm和271 nm,差異較大。為提高檢測效率,實驗采用程序波長切換技術,實現(xiàn)了在同一色譜條件下,在3種成分最大吸收波長處測定其指標性成分的含量,即波長切換法定性、定量檢測甜夢口服液(甜夢合劑)中紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷組分的含量。

綜上,實驗建立以甜夢口服液(甜夢合劑)為研究對象,采用超聲提取法將甜夢口服液(甜夢合劑)中的紫丁香苷、23-乙酰澤瀉醇B和淫羊藿苷3種組分提取出來,RP-HPLC法定性、定量檢測的分析方法。對方法的線性、溶液穩(wěn)定性、重復性等進行了系統(tǒng)的考察,實驗結果證明,此方法具有前處理簡單、分析時間短、檢測結果準確等優(yōu)點,可以用于甜夢口服液(甜夢合劑)供試品的質(zhì)量控制。