黃娜娜,龐碧瀅&,黃曉霞,李 馨,熊文婷,孔 波*,劉吉升

(1廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院代謝性疾病實(shí)驗(yàn)室,廣州 510006;2廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)教研室;&共同第一作者;*通訊作者,E-mail:kongbo@gzhu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:jisheng.liu@gzhu.edu.cn)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver di-sease,NAFLD)是全球性重大公共健康問(wèn)題[1],目前,NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,臨床上尚無(wú)有效的治療藥物和手段。肝細(xì)胞中脂肪過(guò)度累積,導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷,并引發(fā)肝臟的炎癥反應(yīng),是NAFLD的關(guān)鍵特征[2]。降低肝臟的脂肪積累和提高肝臟的脂肪酸β氧化是延緩或阻止NAFLD發(fā)展進(jìn)程的有效手段。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferation activated receptor α,PPARα)是肝臟中促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其參與調(diào)控的代謝過(guò)程與NAFLD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),是開(kāi)發(fā)NAFLD相關(guān)治療藥物的重要靶點(diǎn)[3]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15(fibroblast growth factor 15,FGF15)是小鼠腸道中的一種調(diào)節(jié)肝膽汁酸(bile acids,BAs)合成的腸因子,FGF19是其人類(lèi)同源物[4]。FGF15/19與肝細(xì)胞表面的FGFR4受體結(jié)合后激活下游的ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路,從而調(diào)控膽汁酸的負(fù)反饋抑制合成[5]。本課題前期研究表明,在FGF15轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟中,PPARα及其下游靶基因的水平顯著上調(diào)[6],PPARα mRNA水平升高表明FGF15可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控PPARα的表達(dá),其具體機(jī)制還尚不清楚。FGF15/19可能通過(guò)其下游的ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路調(diào)控PPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此外,FGF15轉(zhuǎn)基因小鼠中膽汁酸水平及組成發(fā)生變化,膽汁酸作為信號(hào)分子也可能通過(guò)激活不同的受體或信號(hào)通路調(diào)控PPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。法尼酯X受體(farnesoid X receptor,FXR)是膽汁酸的生理受體,作為轉(zhuǎn)錄因子與FXR反應(yīng)元件(FXR response element, FXRE)結(jié)合調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),是膽汁酸發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要部分[7]。本研究構(gòu)建了包含hPPARα基因5′端啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中研究了ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路、FXR以及膽汁酸對(duì)hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用,并進(jìn)一步驗(yàn)證參與調(diào)控的順式作用元件,為防治NAFLD的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);人胚胎腎細(xì)胞HEK293T由廣州大學(xué)精準(zhǔn)基因編輯中心喬云波教授課題組饋贈(zèng);螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL4-UPRE-luc2P-Hygro(101788)、海腎熒光素酶報(bào)告基因內(nèi)參質(zhì)粒phR-Luc(139644)購(gòu)自美國(guó)Addgene平臺(tái);PCI-T7-EGFP質(zhì)粒由廣州大學(xué)精準(zhǔn)基因編輯中心王剛教授課題組饋贈(zèng);熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL4-3×FXRE、熒光素酶報(bào)告基因陰性對(duì)照質(zhì)粒PGL4-Basic、hFXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒PCI-T7-hFXR由本實(shí)驗(yàn)室(廣州大學(xué)精準(zhǔn)基因編輯中心孔波教授課題組)構(gòu)建。DNA膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、T4 DNA連接酶、2×Taq Master Mix PCR試劑、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、ExFect轉(zhuǎn)染試劑、BCA蛋白定量試劑盒等購(gòu)自南京諾唯贊公司;海腎熒光素酶檢測(cè)試劑、螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、ERK1/2一抗、JNK1/2一抗、β-actin一抗、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗、超敏ECL發(fā)光反應(yīng)液、U0126、SP600125、GW4064等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;p-ERK1/2一抗、p-JNK1/2一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司;限制性內(nèi)切酶SfiⅠ購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司;胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、penicillin-streptomycin雙抗、胰酶、Opti-MEM培養(yǎng)基等購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;膽汁酸(CDCA、LCA、DCA、GDCA、UDCA)購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑網(wǎng)。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司,SW-CJ-1FD型);二氧化碳培養(yǎng)箱(上海一恒公司,BPN-150CW型);微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermofisher公司,NanoDrop);PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermofisher公司,ABI miniAMP PCR);多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司,Infinite M Plex);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,KX-41型);多功能凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司,Biospectrum615型)。

1.3 螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

以hPPARα基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1,將hPPARα基因的5′端上游約2 kb的序列分為兩個(gè)片段,命名為P1和P2。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,為了進(jìn)一步研究SP600125調(diào)控hPPARα基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的順式作用元件,將P2片段分為3個(gè)短片段,命名為P2-1、P2-2、P2-3。利用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 6設(shè)計(jì)合成特異引物,所克隆片段及相應(yīng)引物見(jiàn)表1。參考諾唯贊2×Taq Master Mix PCR試劑說(shuō)明書(shū),以HepG2細(xì)胞基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增hPPARα基因啟動(dòng)子片段,參考SfiⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切、連接和轉(zhuǎn)化,在報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL4-luc2P-Hygro)啟動(dòng)子上游插入hPPARα基因啟動(dòng)子片段,構(gòu)建得到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL4-P1、PGL4-P2(見(jiàn)圖1)和PGL4-P2-1、PGL4-P2-2和PGL4-P2-3(見(jiàn)圖2)。將構(gòu)建得到的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h檢測(cè)熒光素酶的表達(dá),驗(yàn)證所克隆片段的轉(zhuǎn)錄活性。

圖1 包含hPPARα基因啟動(dòng)子片段的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒示意圖

圖2 包含P2截短片段的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒示意圖

表1 DNA片段及相應(yīng)引物序列

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞1次,加入適量0.25%的胰酶消化液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置消化3 min,加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化,輕柔吹打成單細(xì)胞懸液,按照1∶4的比例分到新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)條件同上,傳代時(shí)加入適量胰酶消化液,靜置消化30 s。

1.5 Western blot檢測(cè)U0126、SP600125對(duì)ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路的抑制作用

通過(guò)Western blot檢測(cè)ERK1/2信號(hào)通路小分子抑制劑U0126、JNK1/2信號(hào)通路小分子抑制劑SP600125在HepG2細(xì)胞中對(duì)ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路的抑制作用。參照說(shuō)明書(shū)以及已發(fā)表文獻(xiàn)中的常用濃度[8],分別用5 μmol/L和10 μmol/L的U0126或SP600125處理HepG2細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑處理作為對(duì)照組,處理1 h,去除細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,加入RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞10 min,4 ℃離心收集上清,使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。樣品加入蛋白上樣緩沖液,混勻后于100 ℃變性5 min。SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,使用1×TBST于室溫?fù)u床上洗膜3次,5 min/次。以適當(dāng)比例稀釋一抗(pERK1/2、pJNK1/2、ERK1/2、JNK1/2、β-actin稀釋度均為1∶1 000),將膜與一抗于4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后與稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,加入ECL反應(yīng)液,置于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光和圖像采集。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

以合適的密度將細(xì)胞鋪到6孔板中,待細(xì)胞密度生長(zhǎng)到90%～95%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前更換新鮮的無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基。每孔轉(zhuǎn)染3 μg螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和20 ng海腎熒光素酶報(bào)告基因內(nèi)參質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染試劑用量為10 μl,質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別用200 μl opti-MEM培養(yǎng)基稀釋,將稀釋后的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合均勻,靜置15～20 min,滴入細(xì)胞培養(yǎng)孔中,輕輕搖勻,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h進(jìn)行后續(xù)處理。

共轉(zhuǎn)染hFXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(PCI-T7-hFXR)時(shí),每孔轉(zhuǎn)染2.5 μg hFXR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、2.5 μg螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和20 ng海腎熒光素酶報(bào)告基因內(nèi)參質(zhì)粒。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)

1.7.1 細(xì)胞處理及分組 為了研究ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路以及膽汁酸對(duì)hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用。在HepG2細(xì)胞中分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包含hPPARα基因啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(PGL4-P1、PGL4-P2)以及陰性對(duì)照質(zhì)粒(PGL4-basic),同時(shí)轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(phR-Luc)作為內(nèi)參,轉(zhuǎn)染6～8 h,用胰酶消化,離心收集細(xì)胞,以每個(gè)6孔板接種于30個(gè)96孔板孔的比例將細(xì)胞均勻分到96孔板中,分別用5 μmol/L U0126,5 μmol/L SP600125,50 μmol/L膽汁酸(CDCA、LCA、DCA、GDCA、UDCA)處理,同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑處理作為對(duì)照組,每組3個(gè)重復(fù)。處理不同時(shí)間(12,24,36,48 h)進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)。

在過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2細(xì)胞中研究hFXR對(duì)hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用。首先使用帶有3個(gè)串聯(lián)FXRE的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(PGL4-3×FXRE)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)的hFXR在HepG2細(xì)胞中的活性。在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行不同轉(zhuǎn)染:PGL4-3×FXRE與PCI-T7-hFXR共轉(zhuǎn)染;PGL4-3×FXRE與PCI-T7-EGFP(PCI-T7-hFXR的對(duì)照質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染;PGL4-basic與PCI-T7-hFXR共轉(zhuǎn)染;PGL4-basic與PCI-T7-EGFP共轉(zhuǎn)染,然后用2 μmol/L GW4064(FXR高效特異性激動(dòng)劑)處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞;同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑處理作為對(duì)照組,每組3個(gè)重復(fù),處理48 h進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)。接下來(lái)檢測(cè)hFXR對(duì)hPPARα基因啟動(dòng)子片段的調(diào)控作用,在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染:包含hPPARα基因啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與PCI-T7-hFXR共轉(zhuǎn)染、包含hPPARα基因啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與PCI-T7-EGFP共轉(zhuǎn)染、PGL4-Basic與PCI-T7-hFXR共轉(zhuǎn)染、PGL4-Basic與PCI-T7-EGFP共轉(zhuǎn)染,然后用2 μmol/L GW4064處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑處理作為對(duì)照組,每組3個(gè)重復(fù),處理48 h進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)。

1.7.2 雙熒光素酶活性檢測(cè) 細(xì)胞處理結(jié)束后,去除培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞1次,每孔加入60 μl報(bào)告基因細(xì)胞裂解液,室溫裂解細(xì)胞5 min,吹打并吸取細(xì)胞裂解產(chǎn)物至1.5 ml離心管中,15 000g離心3 min,取上清用于檢測(cè)。將10 μl上清加入96孔檢測(cè)板,加入50 μl螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑,迅速混勻后置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性(firefly luciferase activity,FLuc),再取10 μl同一上清,加入50 μl海腎熒光素酶檢測(cè)試劑于酶標(biāo)儀中檢測(cè)海腎熒光素酶活性(renilla luciferase activity,RLuc)。以相對(duì)熒光素酶活性(FLuc/RLuc)反映所插入片段的轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)弱。以轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒PGL4-basic的細(xì)胞中處理組與DMSO溶劑組的相對(duì)熒光素酶活性比值為1,對(duì)轉(zhuǎn)染包含hPPARα基因啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒細(xì)胞中處理組與DMSO溶劑組的相對(duì)熒光素酶活性比值作歸一化,得到相對(duì)熒光素酶活性變化倍數(shù),消除質(zhì)粒上啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的本底變化,從而反映處理試劑對(duì)啟動(dòng)子片段的調(diào)控作用。

1.8 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

為了進(jìn)一步研究JNK1/2信號(hào)通路調(diào)控hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的順式作用元件,使用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站PROMO(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)和JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)對(duì)P2片段上可能存在的JNK1/2信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(AP-1、c-Jun、cFos等)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

為了進(jìn)一步研究FXR調(diào)控hPPARα基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的順式作用元件,使用核受體結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(https://www.nubiscan.unibas.ch/)對(duì)P2片段上可能存在的FXR結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.9 重組PCR定點(diǎn)突變

以突變位點(diǎn)為中心,設(shè)計(jì)1對(duì)部分重疊的正反向突變引物,所突變位點(diǎn)及相應(yīng)突變引物見(jiàn)表2。使用兩組引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增:①片段全長(zhǎng)的正向引物與突變位點(diǎn)的反向突變引物;②突變位點(diǎn)的正向突變引物與片段全長(zhǎng)的反向引物。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DNA Oligo退火,并以退火產(chǎn)物為模板,用片段的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到突變后的片段。

表2 突變的位點(diǎn)及相應(yīng)突變引物序列

對(duì)P2-1片段中預(yù)測(cè)得到的兩個(gè)c-Jun結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變驗(yàn)證。c-Jun結(jié)合位點(diǎn)序列為T(mén)GA(C/G)TCA,將預(yù)測(cè)得到的位點(diǎn)1序列AGCGTCA突變?yōu)锳TCTATT,位點(diǎn)2序列ACAAAGTCA突變?yōu)锳CGTATTAG。將突變后的片段分別插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL4-luc2P-Hygro)的啟動(dòng)子上游,得到位點(diǎn)突變后的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL4-P2-1_MUT1和PGL4-P2-1_MUT2。

對(duì)預(yù)測(cè)得到的潛在FXR結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變驗(yàn)證,FXRE片段為被一個(gè)核苷酸分隔的反向重復(fù)序列(AGGTCAnTGACCT),將預(yù)測(cè)所得到的潛在FXR結(jié)合位點(diǎn)序列GGGTCAcACACCT突變?yōu)镚TAGGCcACATTA,將突變后的片段插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL4-luc2P-Hygro)的啟動(dòng)子上游,得到位點(diǎn)突變后的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PGL4-P2-3_MUT。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hPPARα基因啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證

雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示,與PGL4-basic相比,轉(zhuǎn)染PGL4-P1、PGL4-P2質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性顯著上調(diào),其中P2片段的轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng)(P<0.05,見(jiàn)圖3)。轉(zhuǎn)染PGL4-P2-1、PGL4-P2-2、PGL4-P2-3質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性顯著上調(diào),其中P2-1片段的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)(P<0.000 1,見(jiàn)圖4)。

與PGL4-Basic組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

與PGL4-basic組相比,****P<0.000 1

2.2 ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路對(duì)hPPARα啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用

Western blot結(jié)果顯示,5,10 μmol/L的U0126顯著抑制ERK1/2的磷酸化活性(P<0.01);5,10 μmol/L的SP600125顯著抑制JNK1/2的磷酸化活性(P<0.01,見(jiàn)圖5)。

與對(duì)應(yīng)的DMSO組相比,*P<0.05,**P<0.01

雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示,5 μmol/L U0126處理的細(xì)胞中,P1、P2片段的啟動(dòng)子活性沒(méi)有顯著變化;5 μmol/L SP600125處理的細(xì)胞中,P1片段的啟動(dòng)子活性沒(méi)有顯著變化,而P2片段的啟動(dòng)子活性顯著下調(diào)(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

2.3 SP600125對(duì)P2截短片段的調(diào)控作用

雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示,5 μmol/L SP600125處理對(duì)3個(gè)短片段的啟動(dòng)子活性均有顯著的抑制作用(P<0.001,見(jiàn)圖7)。

與PGL4-basic組相比,***P<0.001

2.4 P2片段中JNK1/2信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及定點(diǎn)突變驗(yàn)證

P2-1片段中預(yù)測(cè)得到兩個(gè)c-Jun結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖8)。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示,位點(diǎn)1突變后SP600125對(duì)P2-1片段的抑制作用減弱了約13.3%(P<0.000 1),而位點(diǎn)2突變后SP600125的抑制作用未發(fā)生變化(見(jiàn)圖9)。

圖9 PGL4-P2-1質(zhì)粒中的位點(diǎn)突變示意圖及SP600125對(duì)突變前后P2-1片段的調(diào)控作用

2.5 FXR對(duì)hPPARα啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用

雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示,在過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染PGL4-3×FXRE,GW4064處理48 h顯著增強(qiáng)了相對(duì)熒光素酶活性(P<0.001,見(jiàn)圖10)。過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2細(xì)胞中,GW4064處理48 h,P1、P2片段的轉(zhuǎn)錄活性均顯著上調(diào)(P<0.01,見(jiàn)圖10)。

A.雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的hFXR活性 B.雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)hFXR對(duì)P1、P2片段的調(diào)控作用與PGL4-Basic組相比,**P<0.01,***P<0.001

2.6 P2片段中FXR潛在結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及定點(diǎn)突變驗(yàn)證

P2片段中預(yù)測(cè)得到兩個(gè)潛在的FXR結(jié)合位點(diǎn),分別位于P2-2和P2-3片段上(見(jiàn)圖11)。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示,在過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2和HEK293T細(xì)胞中,GW4064處理顯著增加了P2-3片段的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.01),而P2-2片段的轉(zhuǎn)錄活性僅在HEK293T細(xì)胞中顯著增加(P<0.05,見(jiàn)圖12)。對(duì)P2-3中的位點(diǎn)進(jìn)行突變后,HepG2細(xì)胞中hFXR對(duì)P2-3片段轉(zhuǎn)錄活性的誘導(dǎo)作用減弱了約20%(P<0.05,見(jiàn)圖13)。

圖11 P2片段上所預(yù)測(cè)的FXRE位點(diǎn)示意圖

圖13 PGL4-P2-3質(zhì)粒中FXRE位點(diǎn)突變示意圖及突變前后hFXR對(duì)P2-3片段的調(diào)控作用

2.7 膽汁酸對(duì)hPPARα啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用

雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示,未過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2細(xì)胞中,50 μmol/L LCA處理24 h和48 h顯著抑制了P2片段的啟動(dòng)子活性(P<0.05),而DCA、CDCA、GDCA和UDCA處理后,P2片段的啟動(dòng)子活性無(wú)顯著變化(見(jiàn)圖14)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,50 μmol/L LCA處理24 h時(shí),P2-1片段的啟動(dòng)子活性被顯著抑制(P<0.05),P2-2和P2-3片段的啟動(dòng)子活性無(wú)顯著變化(見(jiàn)圖15)。100 μmol/L LCA處理24 h時(shí),3個(gè)片段的啟動(dòng)子活性均被顯著抑制(P<0.01或P<0.05),其中對(duì)P2-1片段的啟動(dòng)子活性抑制最強(qiáng)(見(jiàn)圖15)。

A.處理24 h B.處理48 h

3 討論

NAFLD患病率逐年升高,已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的主要公共健康威脅,其通常與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、高血壓、血脂異常、動(dòng)脈粥樣硬化、全身性炎癥相關(guān),是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[9-12]。PPARα是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,在體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、炎癥和胰島素信號(hào)等過(guò)程的調(diào)控,在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用[13]。

基于FGF15轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中PPARα及其下游靶基因水平顯著上調(diào)的研究基礎(chǔ),本研究探究了HepG2細(xì)胞中FGF15/19下游的ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路以及膽汁酸對(duì)hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用。首先構(gòu)建包含hPPARα啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒并在HepG2細(xì)胞中驗(yàn)證了所克隆的片段具有轉(zhuǎn)錄活性,尤其P2片段中可能存在調(diào)控hPPARα基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示,P1、P2片段在HepG2細(xì)胞中對(duì)熒光素酶基因表達(dá)的調(diào)控作用隨時(shí)間先增強(qiáng)后減弱,轉(zhuǎn)染24,32 h的調(diào)控作用最強(qiáng),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染8 h的HepG2細(xì)胞,再繼續(xù)處理12,16,24,36 h進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)。使用ERK1/2信號(hào)通路的選擇性小分子抑制劑U0126和JNK1/2信號(hào)通路的選擇性小分子抑制劑SP600125研究ERK1/2、JNK1/2信號(hào)通路對(duì)hPPARα基因啟動(dòng)子片段的調(diào)控作用。本結(jié)果表明抑制ERK1/2信號(hào)通路后,P1、P2片段的轉(zhuǎn)錄活性均無(wú)顯著變化;抑制JNK1/2信號(hào)通路后,P1片段的轉(zhuǎn)錄活性無(wú)顯著變化,而P2片段的轉(zhuǎn)錄活性被顯著抑制。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,SP600125對(duì)P2片段的抑制作用是由片段中預(yù)測(cè)到的一個(gè)c-Jun結(jié)合位點(diǎn)部分介導(dǎo)的,表明JNK1/2信號(hào)通路參與調(diào)控hPPARα的基因轉(zhuǎn)錄,FGF19在體內(nèi)可能通過(guò)激活JNK1/2信號(hào)通路調(diào)控PPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

此外,膽汁酸、FXR、FGF15/19三者相互作用,在體內(nèi)維持著動(dòng)態(tài)平衡。FGF15轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中PPARα及其下游靶基因水平的增加也可能是由于膽汁酸的水平和組成發(fā)生變化。FXR是膽汁酸的生理受體,是膽汁酸發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要部分,許多研究顯示了FXR和PPARα在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的串?dāng)_作用[14,15]。文獻(xiàn)報(bào)道,PPARa與FXR共同激活在特定生理?xiàng)l件或環(huán)境下可以對(duì)NAFLD產(chǎn)生積極信號(hào),在NAFLD患者中聯(lián)合使用PPARa與FXR激動(dòng)劑可能是未來(lái)治療NAFLD的一種新選擇[16,17]。因此,本研究探究了FXR對(duì)hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控作用,結(jié)果表明,在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hFXR,用GW4064激活后能夠誘導(dǎo)P1、P2片段的轉(zhuǎn)錄活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道[18],膽汁酸通過(guò)激活FXR誘導(dǎo)hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá),并在hPPARα的啟動(dòng)子中驗(yàn)證了1個(gè)位于P1片段的FXR反應(yīng)元件。本研究在P2片段中驗(yàn)證了1個(gè)新的FXR結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為人類(lèi)FXR和PPARα通路之間的串?dāng)_提供了更多的分子證據(jù)。

除了激活FXR之外,膽汁酸還可能激活其他的受體或信號(hào)通路調(diào)控hPPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本研究結(jié)果表明,在沒(méi)有過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2細(xì)胞中,LCA處理顯著降低了P2片段的啟動(dòng)子活性,并且可能主要作用于P2-1片段中的順式作用元件。不同膽汁酸對(duì)受體的結(jié)合能力不同[19],對(duì)FXR的結(jié)合和激活能力CDCA>CA>LCA>DCA,這些膽汁酸在體內(nèi)可能通過(guò)激活FXR調(diào)控PPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。由圖10結(jié)果可知,在沒(méi)有過(guò)表達(dá)hFXR的HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染PGL4-3×FXRE,GW4064處理沒(méi)有增強(qiáng)相對(duì)熒光素酶活性,表明HepG2細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的FXR水平很低,因此LCA對(duì)P2片段的調(diào)控作用可能是獨(dú)立于FXR的,可能通過(guò)LCA激活的PXR、VDR、CAR等受體或相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)[19],其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。膽汁酸代謝與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān),許多研究表明,NAFLD患者的血液和肝臟中膽汁酸水平升高[20]。而還有一些研究表明,與健康人相比,NAFLD患者的總膽汁酸水平?jīng)]有差異,但膽汁酸的組成發(fā)生了顯著變化[21]。干擾膽汁酸合成和代謝的方法是目前防治NAFLD的重要研究方向[22]。本研究結(jié)果表明,膽汁酸調(diào)控PPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá),體內(nèi)膽汁酸池中CDCA等激活FXR的膽汁酸水平升高可能誘導(dǎo)hPPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而LCA水平升高則可能抑制hPPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。不同膽汁酸對(duì)hPPARα的調(diào)控作用不同,表明膽汁酸的組成變化可能通過(guò)調(diào)控hPPARα的轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而影響脂質(zhì)代謝。

綜上所述,本研究驗(yàn)證了JNK1/2信號(hào)通路、FXR以及LCA對(duì)hPPARα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,FGF19在體內(nèi)調(diào)控hPPARα轉(zhuǎn)錄表達(dá)的機(jī)制一方面可能通過(guò)激活JNK1/2信號(hào)通路起作用,另一方面可能通過(guò)影響膽汁酸的水平和組成起作用。膽汁酸、FGF15/19、FXR、PPARα在NAFLD的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,是開(kāi)發(fā)相關(guān)治療藥物的重要靶點(diǎn),目前相關(guān)治療藥物的廣泛使用受到其不良反應(yīng)的限制,研究FXR、FGF19、膽汁酸調(diào)控PPARα的信號(hào)通路和參與作用的蛋白因子能為科學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供更多的思路。