秦李楊,刁玉剛,韓曉航

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科,沈陽(yáng) 110011;*通訊作者,E-mail:medicine0426@163.com)

肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高,患者通常在晚期才被診斷,治療選擇少,手術(shù)及化療等常規(guī)治療效果不好,預(yù)后差[1]。開(kāi)發(fā)新的藥物治療尤為迫切。肝癌跟炎癥密切相關(guān),肝癌通常由慢性肝病發(fā)展而成,而持續(xù)性炎癥會(huì)促進(jìn)和加劇肝癌發(fā)展[2]。因此,從炎癥方向?qū)ふ铱垢伟┧幬镉兄匾饬x。脂多糖(LPS)被報(bào)道在體外能夠誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥性反應(yīng),被Toll樣受體4識(shí)別并激活絲裂原活化蛋白激酶,從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)[3],其中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肝損傷的形成和發(fā)展過(guò)程中起重要作用[4]。丙泊酚是一種短效靜脈麻醉藥,被報(bào)道可抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移及血管生成[5],抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的增殖、促進(jìn)凋亡[6],說(shuō)明丙泊酚有抗腫瘤功能;丙泊酚聯(lián)合七氟醚能夠明顯改善血清炎癥因子表達(dá),保護(hù)肝炎患者肝腎功能[7],證明了其抗炎作用,但其抗炎及抗癌的作用機(jī)制尚不完全明確。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路是一種對(duì)炎癥反應(yīng)至關(guān)重要的通路,NF-κB是將慢性炎癥與癌癥聯(lián)系起來(lái)的最重要分子之一,NF-κB激活誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄,如促增殖和抗凋亡基因,參與多種腫瘤增殖、凋亡及遷移等行為[8]。但丙泊酚是否可以通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路影響LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞的惡性行為尚未可知。因此,本研究探討丙泊酚干預(yù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及炎癥因子的影響以及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制,可為肝癌的治療提供新研究方向,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞MHCC97H購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 丙泊酚(批號(hào):N18GB168406,純度≥98%)、LPS(批號(hào):J07HS174755,純度≥98%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082(批號(hào):J07HS173399,純度≥99%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):Feb-22)購(gòu)自睿信生物科技有限公司,活細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試劑盒(批號(hào):C6205060)購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(批號(hào):042621211123)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Hoechst 33258染色試劑盒(批號(hào):20220304)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,鼠抗人IKKα、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及β-actin一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(二抗)均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.1.3 儀器 MF52-N型倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電技術(shù)有限公司);Multiskan Ascent型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);H4-20kr型低溫高速離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司);DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肝癌MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將人肝癌MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青-鏈霉素)中,待細(xì)胞培養(yǎng)貼壁達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,取第4代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)MHCC97H細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及給藥 選取第4代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌MHCC97H細(xì)胞,調(diào)整密度至2×105個(gè)/ml,接種到96孔板中,每孔100 μl。將肝癌MHCC97H細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和中劑量+BAY 11-7082組,對(duì)照組細(xì)胞不做干預(yù),LPS組加入1 μg/ml LPS,低劑量組、中劑量組、高劑量組以1 μg/ml LPS分別與12.5,25,50 μmol/L丙泊酚同時(shí)給藥共培養(yǎng),中劑量+BAY 11-7082組1 μg/ml LPS與25 μmol/L丙泊酚和10 μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082同時(shí)給藥共培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,后置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α表達(dá)水平 收集各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞上清液,按照TNF-α ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎癥因子TNF-α表達(dá)水平。

1.2.4 CCK-8法測(cè)定MHCC97H細(xì)胞的活力 選取第4代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,調(diào)整密度至2×105個(gè)/ml,接種到96孔板中,每孔加100 μl,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組干預(yù)24 h后,加入CCK-8溶液10 μl,繼續(xù)孵育2 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組OD值(450 nm)。細(xì)胞活力(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.2.5 EdU法測(cè)定MHCC97H細(xì)胞的增殖率 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞,進(jìn)行EdU處理,去除培養(yǎng)液,加入4%多聚甲醛0.5 ml,固定,洗滌,去除BSA后再洗滌3次;加200 μl Click反應(yīng)液(現(xiàn)配現(xiàn)用),室溫避光孵育30 min,洗滌后去除Click反應(yīng)液;加入Hoechst孵育10 min;洗滌后裝片,拍照,再用ImageJ軟件處理圖片。EdU陽(yáng)性染色細(xì)胞(紅色)占總細(xì)胞(藍(lán)色)的百分比表示細(xì)胞增殖率。

1.2.6 Hoechst 33258染色法測(cè)定MHCC97H細(xì)胞凋亡率 干預(yù)24 h的細(xì)胞,洗滌后加入多聚甲醛固定并洗滌,染色后洗滌,封固后熒光顯微鏡觀察拍照。凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征是細(xì)胞核染色不均濃染且所發(fā)熒光較強(qiáng),呈亮藍(lán)色。Image-J圖像分析軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Transwell小室法測(cè)定MHCC97H細(xì)胞的遷移能力 將Transwell小室放入24孔板中,在Transwell小室的上室中加細(xì)胞懸液(1×106/ml),下室加入600 μl含有10% FBS的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄上清,棉簽擦去小室薄膜上層細(xì)胞清洗后固定。晾干后染色并清洗。在顯微鏡下觀察拍照。Image-J圖像分析軟件計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1、Caspase-3和NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 干預(yù)24 h時(shí),收集各組細(xì)胞于RIPA液在冰上進(jìn)行裂解,4 ℃,12 000 r/min離心20 min,取上清進(jìn)行蛋白變性后,制膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,并封閉2 h,然后參照抗體說(shuō)明書(shū)加入一定稀釋比例的一抗[IKKα(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶2 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、Cyclin D1(1∶5 000)、Caspase-3(1∶2 000)及β-actin(1∶5 000)],4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000),孵育2 h,棄去液體并洗滌,最后加顯影液,拍照記錄。蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞的炎癥

人肝癌MHCC97H細(xì)胞的炎癥水平用炎癥因子TNF-α的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞炎癥因子TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,丙泊酚中、高劑量組細(xì)胞炎癥因子TNF-α表達(dá)水平降低(P<0.05),而低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),丙泊酚中、高劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與LPS組相比,#P<0.05

2.2 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞的活力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干預(yù)24 h時(shí),與對(duì)照組比較,LPS組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,丙泊酚中、高劑量組細(xì)胞活力降低(P<0.05),而低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),丙泊酚中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖2)。為避免細(xì)胞死亡過(guò)多對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,我們選擇對(duì)細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的較低濃度中劑量組加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082進(jìn)行NF-κB通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與LPS組相比,#P<0.05

2.3 丙泊酚通過(guò)抑制NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞的增殖

EdU結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

2.4 丙泊酚通過(guò)抑制NF-κB通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞的凋亡

Hoechst 33258實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

圖4 Hoechst染色檢測(cè)丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡的影響 (×20)

2.5 丙泊酚通過(guò)抑制NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞的遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

2.6 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)并促進(jìn)Caspase-3蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著升高,Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05);與LPS組相比,中劑量組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低,而Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低,而Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

2.7 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞NF-κB通路的活化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組之間IκBα和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對(duì)照組相比,LPS組IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖7)。

3 討論

肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高,往往診斷時(shí)已處于肝癌晚期,導(dǎo)致其預(yù)后不良,手術(shù)和放化療是最佳選擇,但治療后病情易反復(fù)甚至加劇,影響患者生活質(zhì)量[9],開(kāi)發(fā)新的治療方法是必要的。炎癥已被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志,并且已知在大多數(shù)癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,肝炎通過(guò)分泌各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移,參與腫瘤進(jìn)展[10,11]。丙泊酚是一種常用的鎮(zhèn)靜藥物,在癌癥手術(shù)用于全身麻醉,近來(lái)發(fā)現(xiàn)丙泊酚在各種癌癥發(fā)揮抗腫瘤作用[12],但丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)研究丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的肝癌炎性作用、增殖、凋亡及遷移等惡性行為及對(duì)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞炎癥因子TNF-α表達(dá)水平和細(xì)胞活力顯著升高,提示LPS可以誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞的炎癥發(fā)生,促進(jìn)細(xì)胞的活力。加入丙泊酚處理后,中劑量組和高劑量組TNF-α表達(dá)水平和細(xì)胞活力顯著低于LPS組,說(shuō)明25 μmol/L和50 μmol/L丙泊酚可抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞炎癥和細(xì)胞活力,其中高劑量組細(xì)胞活力較低,為避免細(xì)胞死亡過(guò)多對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,我們選擇對(duì)細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且濃度較低的中劑量組進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,LPS組細(xì)胞增殖率和遷移數(shù)顯著高于對(duì)照組,細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明LPS促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞的增殖和遷移,抑制其凋亡,加入25 μmol/L丙泊酚處理后,顯著扭轉(zhuǎn)了這些指標(biāo)的變化,證明了丙泊酚可以抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞增殖和遷移能力,促進(jìn)其凋亡能力,與丙泊酚抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲這一報(bào)道結(jié)果相符[13]。細(xì)胞的增殖與凋亡是細(xì)胞功能中較為重要的兩個(gè)指標(biāo),Cyclin D1作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物,其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)從G1期到S期的轉(zhuǎn)變[14]。細(xì)胞凋亡是一種多種因素誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的生物學(xué)過(guò)程,Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子,在細(xì)胞凋亡中起重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,LPS誘導(dǎo)促進(jìn)Cyclin D1蛋白表達(dá),抑制Caspase-3蛋白表達(dá),加入25 μmol/L丙泊酚處理后,顯著扭轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)Cyclin D1和Caspase-3的表達(dá),提示丙泊酚可能是通過(guò)下調(diào)Cyclin D1和上調(diào)Caspase-3來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡。

NF-κB通路是炎癥和癌癥之間聯(lián)系的重要通路,NF-κB激活主要發(fā)生在癌細(xì)胞中,受到多種機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控,由細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS等)和腫瘤壞死因子(如TNF-α)等促炎細(xì)胞因子啟動(dòng),激活后誘導(dǎo)多種靶基因,串?dāng)_許多信號(hào)通路,參與調(diào)控多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[16]。NF-κB信號(hào)通路被報(bào)道在肝炎與肝癌的發(fā)展中均有重要調(diào)節(jié)作用,且與細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)[17,18]。有研究表明,丙泊酚可以促進(jìn)心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19],丙泊酚通過(guò)抑制NF-κB活化抑制LPS誘導(dǎo)的羊膜細(xì)胞炎癥[20]。但關(guān)于丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道,因此本研究分析了丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞中NF-κB通路蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高;而加入25 μmol/L丙泊酚處理后,IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低,提示了丙泊酚可能抑制了NF-κB通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在中劑量組中加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082進(jìn)行NF-κB通路驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與中劑量組相比,加入抑制劑后,中劑量+BAY 11-7082組細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)及Cyclin D1、IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低,細(xì)胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高,提示丙泊酚可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路以及上調(diào)Caspase-3和下調(diào)Cyclin D1來(lái)抑制細(xì)胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)其凋亡的。

綜上所述,丙泊酚可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的人肝癌MHCC97H細(xì)胞增殖和遷移,降低炎癥,誘導(dǎo)凋亡。本實(shí)驗(yàn)證明丙泊酚可抑制LPS誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的炎性作用及惡性行為,對(duì)治療肝癌有重要意義,但本文僅在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,還需進(jìn)一步在動(dòng)物模型上分析丙泊酚的抗癌作用,為肝癌的治療提供更為全面的理論支持。