高天樂(lè),郭志強(qiáng),孫 青,劉 建,李 俊

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻喉科,上海 201700)

喉癌是起源于喉腔黏膜的一種惡性腫瘤,其主要類(lèi)型是黏膜來(lái)源的鱗狀細(xì)胞癌,大約占95%左右[1]。近年來(lái)喉癌的發(fā)病率居高不下,呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而且死亡率占所有癌癥死亡率的1%[2]。喉癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素主要受吸煙、酒精、空氣污染和病毒性感染的影響,據(jù)統(tǒng)計(jì),70%以上的病例和吸煙有關(guān),其次是酒精、空氣污染和人乳頭狀瘤病毒(HPV)的病毒性感染[3],HPV感染多見(jiàn)于不吸煙和不飲酒的年輕人,通常預(yù)后良好[4]。喉癌早期可以通過(guò)手術(shù)或者放射治療的方式達(dá)到臨床治愈,晚期需要多模式的聯(lián)合治療,而且留喉率低,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,預(yù)后較差。因此繼續(xù)尋找喉癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制,早期診斷對(duì)于喉癌的臨床治療具有重要意義。miRNAs是數(shù)據(jù)基因中最豐富的調(diào)控基因,降解靶基因或者抑制其翻譯,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因水平的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控,從而參與細(xì)胞代謝、分化、增殖和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[5]。相關(guān)研究表明,miR-29a-3p抑制表達(dá)能增強(qiáng)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[6],說(shuō)明miRNAs可能與喉癌頭頸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白(PTEN)基因是具有磷脂酶活性的抑癌基因,PTEN具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡等作用[7],它的甲基化與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[8]。miR-26家族在腫瘤調(diào)控過(guò)程中具有重要的作用,屬于腫瘤的一致因子[9]。miR-4465屬于miR-26家族,相關(guān)研究表明,miR-4465可以抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[10]。基于上述研究結(jié)果,本研究擬探討miR-4465調(diào)控PTEN甲基化對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響,為喉癌的診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系購(gòu)買(mǎi)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。喉癌組織及相應(yīng)的癌旁組織20例,均來(lái)自2017年1月至2022年1月本院耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)治療的患者,均經(jīng)喉鏡下病理組織活檢確診,屬于凍存標(biāo)本,采用qRT-PCR檢測(cè)miR-4465和PTEN mRNA的表達(dá)。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胰蛋白酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;mimic NC、miR-4465 mimic、pcDNA3.0質(zhì)粒、pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司;PTEN抗體、山羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物有限公司;離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系置于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先將Hep-2細(xì)胞分為空白組(不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理)、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染mimic NC)、miR-4465 mimic組(轉(zhuǎn)染miR-4465 mimic),采用qRT-PCR檢測(cè)PTEN mRNA表達(dá),Western blot檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá),CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲,細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。再將Hep-2細(xì)胞分為pcDNA3.0組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒)和pcDNA3.0-PTEN組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-PTEN質(zhì)粒),CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲,細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。按照脂質(zhì)體Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-4465和PTEN的表達(dá) 稱(chēng)取喉癌組織和癌旁組織適量,振蕩研磨,采用RNA試劑盒分別抽提組織和細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備好cDNA,放在-20 ℃冰箱中保存。miR-4465引物序列F:5′-ACGCCTCTTGCAGCGCGGCGGCTTCGAA-3′,R:5′-ATTGCTGGGAGAGCGGGACGGTCCGGG-3′;PTEN引物序列F:5′-GCGGGACCCGACTCGCAAACTG-3′,R:5′-AGCCGCTCCAGTGCTGTACA-3′。PCR總反應(yīng)體系10 μl,上游/下游引物混合物(5 μmol/L)為1 μl,2×SYRB Green Master為5 μl,Q水為3 μl,cDNA為1 μl。PCR反應(yīng)步驟:95 ℃預(yù)變性10 min后,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸35 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),最后72 ℃終末延伸10 min。采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-4465和PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)變化。

1.3.3 PTEN甲基化狀態(tài)的檢測(cè) 采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒提取喉癌組織和癌旁組織DNA,放于-20 ℃保存,采用亞硫酸氫鹽對(duì)甲基化與非甲基化的DNA樣品修飾作為對(duì)照。對(duì)喉癌組織和癌旁組織的DNA提純和亞硫酸氫鹽修飾、測(cè)序。PTEN基因甲基化引物,正向:5′-GAGCTAGGCCCTCGCCCAC-3′,反向:5′-TCCGAGATCCCGGGGAG-3′;PTEN基因非甲基化引物,正向:5′-ATCGCGCGAGCG-CCTCGCTCAC-3′,反向:5′-GCATATCGATTGCATCCGCTAG-3′;按照試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系:10×PCR Buffer為5 μl,2.5 mmol/L dNTPs為5 μl,10 μmol/L混合基因引物為4 μl,甲基化回收產(chǎn)物為1.5 μl,5 U/μl TaqHS為0.2 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃進(jìn)行預(yù)變性5 min;95 ℃進(jìn)行變性30 s;72 ℃延伸30 s;操作40次后,溫度72 ℃進(jìn)行末端延伸5 min;保持溫度16 ℃,2 min。得到的產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸法測(cè)序,取下結(jié)合珠與PCR產(chǎn)物,冷卻后,室溫進(jìn)行雜交。在反應(yīng)儀器中加入底物混合物、脫氧核苷酸和所需要的酶,將96孔板和試劑艙置于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)儀中檢測(cè),應(yīng)用Pyro Q-CpG軟件對(duì)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。本次檢測(cè)的甲基化率的位點(diǎn)為連續(xù)的胞嘧啶和胸腺嘌呤片段,片段中有4個(gè)胞嘧啶和胸腺嘌呤,樣本中4個(gè)胞嘧啶和胸腺嘌呤位點(diǎn)的甲基化率總和即為樣本中PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率。

1.3.4 Western blot檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中,加入RAPI裂解液進(jìn)行蛋白提取,BCA法蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入含有PTEN一抗(1∶500稀釋)的5%脫脂奶粉中,放入4 ℃冰箱過(guò)夜,加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(濃度1∶5 000),室溫孵育1 h后,TBST洗膜3次,GAPDH作為內(nèi)參,ECL化學(xué)發(fā)光,將條帶掃描至計(jì)算機(jī),用Image J軟件分析目的蛋白灰度值。

1.3.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后,胰酶消化,以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的濃度平鋪在96孔板中,設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24,48,72 h,每個(gè)反應(yīng)孔中加入10 μl的CCK-8溶液,37 ℃下避光培養(yǎng)2 h,在450 nm采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于Transwell小室置于24孔板內(nèi),采用無(wú)血清的培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,以2×105個(gè)/200 μl的濃度接種于Transwell小室的上室,Transwell小室的上室底部的膜表面涂抹Matrigel膠,下室內(nèi)加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基。12 h后取出24孔板,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定15 min,吉姆薩染色約30 min,顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野照相并計(jì)數(shù)。

1.3.7 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 收集生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞,以2×105個(gè)細(xì)胞/ml鋪至6孔板中,6 h后,以直尺輔助,使用100 μl槍頭在每孔內(nèi)垂直背側(cè)標(biāo)記線劃痕。PBS洗滌3次,按照劃痕后0 h和48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行漂洗細(xì)胞并拍照取樣測(cè)距,計(jì)算遷移率,其公式如下:遷移率=(原始劃痕距離-48 h后劃痕距離)/原始劃痕距離×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-4465和PTEN在喉癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)和相關(guān)性

喉癌組織中miR-4465和PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)低于癌旁組織(P<0.001,見(jiàn)圖1)。Person相關(guān)分析結(jié)果顯示,癌組織中miR-4465表達(dá)和PTEN呈正相關(guān)性(r=0.524,P=0.021,見(jiàn)圖1)。

與癌旁組織相比,***P<0.001

2.2 喉癌組織PTEN基因甲基化的情況及其與臨床病理學(xué)的相關(guān)性

PTEN在癌組織的甲基化率明顯高于癌旁組織(P<0.001);PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率與性別、年齡、臨床分型無(wú)相關(guān)性(P>0.05);與腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)系(P<0.001,見(jiàn)表1)。

表1 PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率與臨床病理學(xué)的相關(guān)性

2.3 miR-4465對(duì)PTEN mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空白組和對(duì)照組相比,miR-4465 mimic組Hep-2細(xì)胞中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.001),PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001,見(jiàn)圖2)。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-4465對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響

24,48,72 h時(shí),空白組與對(duì)照組Hep-2細(xì)胞增殖能力比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);miR-4465 mimic組Hep-2細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組(P<0.001,見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組相比,***P<0.001

2.5 過(guò)表達(dá)miR-4465對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲的影響

空白組與對(duì)照組Hep-2細(xì)胞侵襲能力相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-4465 mimic組Hep-2細(xì)胞侵襲能力明顯低于空白組和對(duì)照組(P<0.001,見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組相比,**P<0.001

2.6 過(guò)表達(dá)miR-4465對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移的影響

與空白組和對(duì)照組相比,miR-4465 mimic組Hep-2細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.001,見(jiàn)圖5)。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-4465對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移的影響

2.7 PTEN對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響

與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-PTEN組24,48,72 h的Hep-2細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.001,見(jiàn)圖6)。

與pcDNA3.0組相比,***P<0.001

2.8 PTEN對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲的影響

與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-PTEN組Hep-2細(xì)胞侵襲能力明顯降低(P<0.001,見(jiàn)圖7)。

與pcDNA3.0組相比,***P<0.001

2.9 PTEN對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移的影響

與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-PTEN組Hep-2細(xì)胞遷移能力明顯降低(P<0.001,見(jiàn)圖8)。

圖8 PTEN對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移的影響

3 討論

miRNA在喉癌中的治療、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后方面也有著廣闊的應(yīng)用前景,很多研究表明,miRNA在喉癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)上具有一定的預(yù)測(cè)作用,而且可以通過(guò)基因靶向調(diào)控喉癌的多耐藥性[11]。除此之外,miRNA還可以通過(guò)其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化修飾來(lái)促進(jìn)喉癌的發(fā)展。喉癌是喉部的惡性腫瘤。近年來(lái),喉癌的發(fā)病率雖然呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但是喉癌患者的總生存率并未得到提高,而且該病有40%的喉癌患者一旦確診即為晚期,甚至發(fā)生了轉(zhuǎn)移[12],嚴(yán)重影響了患者預(yù)后。目前喉癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確,并且在診斷、治療和預(yù)后方面仍缺少有效的生物標(biāo)志物,所以探索喉癌的分子發(fā)病機(jī)制,提高喉癌患者的臨床療效,對(duì)于喉癌的診斷和潛在的靶向治療具有重要意義。

研究表明,miRNAs在喉癌的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[13]。越來(lái)越多的研究表明,miRNAs參與腫瘤的各個(gè)過(guò)程,包括腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等[14]。miRNAs可以反映起源組織的病理生理狀況,可能成為新的有前途的生物標(biāo)志物。多項(xiàng)研究報(bào)道,miRNAs在喉癌中的表達(dá)差異[15],喉癌中miR-133b表達(dá)顯著下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-133b可以顯著抑制喉癌細(xì)胞的增殖、影響喉癌細(xì)胞周期、促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡以及抑制喉癌細(xì)胞遷移[16]。miR-181d在喉癌組織中的表達(dá)量明顯升高,下調(diào)miR-181d能降低Hep2細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,并使細(xì)胞周期主要阻滯于G1期[17]。但目前關(guān)于miR-4465在喉癌的相關(guān)報(bào)道較少,miR-4465屬于miR-26家族的主要成員,miR-26家族主要有4個(gè)成員,包括miR-26a、miR-26b、miR-1297和miR-4465,在乳腺癌、肝癌、胃癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤都出現(xiàn)低表達(dá),屬于抑癌基因[18],所以推測(cè)miR-4465在喉癌中也具有類(lèi)似的作用。本研究首先驗(yàn)證miR-4465和PTEN在喉癌組織和癌旁組織中的表達(dá),結(jié)果顯示,喉癌組織中miR-4465和PTEN的相對(duì)表達(dá)低于癌旁組織,提示miR-4465和PTEN在喉癌中均有可能屬于抑癌基因。Person相關(guān)分析結(jié)果顯示,miR-4465和PTEN又呈現(xiàn)正相關(guān)性。而且與pcDNA3.0組相比,pcDNA3.0-PTEN組Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力明顯降低。DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)的一種,是胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng),DNA被甲基化后將與蛋白結(jié)合,DNA高度緊密排列,結(jié)果無(wú)法生成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,影響基因表達(dá)[19]。DNA甲基化修飾作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵方式,在分化、發(fā)育和維持組織特異性等許多方向起著關(guān)鍵的作用[20]。DNA甲基化與許多種疾病的發(fā)生有關(guān),研究表明,抑制PTEN基因啟動(dòng)子甲基化來(lái)減緩慢性粒細(xì)胞白血病的進(jìn)展[21]。PTEN甲基化與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切,已有研究表明,在乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中均存在PTEN甲基化異常的情況[22]。本研究結(jié)果顯示,PTEN在癌組織的甲基化率明顯高于癌旁組織,而且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)系。相關(guān)研究表明,組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ-Ⅲ級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者的膀胱組織中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于組織學(xué)分級(jí)為0-Ⅰ級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者[23],與本研究結(jié)果類(lèi)似。本研究采用模擬體miR-4465 mimic在Hep-2細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)miR-4465后,明顯提高了PTEN mRNA和蛋白表達(dá),抑制了Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。提示miR-4465可能在喉癌的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中起著抑癌基因的作用,為臨床喉癌的治療提供新靶點(diǎn)。相關(guān)研究表明,miR-4465能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[24];也有研究表明,miR-4465過(guò)表達(dá)能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞侵襲[25],與本研究在腫瘤中的驗(yàn)證結(jié)果相似。

綜上所述,miR-4465在喉癌組織中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-4465可以抑制Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,這可能與PTEN啟動(dòng)子甲基化程度降低,促進(jìn)PTEN表達(dá)有關(guān)。本研究為臨床上喉癌的治療提供了有利的依據(jù),但關(guān)于miR-4465降低PTEN啟動(dòng)子甲基化水平的相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本研究存在一定的局限性,本研究只進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)研究,下一步將探討臨床樣本中的miR-4465的表達(dá),以及對(duì)喉癌預(yù)后的影響,以期為喉癌的臨床治療提供依據(jù)。