唐陽芳,張少華,陳國平

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:zhangshaohua72@163.com)

宮頸癌是全球第四大最常見癌癥,也是女性癌癥死亡的第四大原因,2020年全球?qū)m頸癌的發(fā)生率約6.5%,死亡率約7.7%,估計(jì)有60.4萬例新增病例和34.2萬死亡病例[1]。在我國,每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬人次,占全球總體新發(fā)病例的28%,其中死亡病例約為5.3萬[2],因此,對(duì)宮頸癌的防治是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的工作重點(diǎn)。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒,目前已報(bào)道有 120多種基因型,是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要高危因素[3]。單獨(dú)的HPV感染不足以導(dǎo)致宮頸癌,基因改變和轉(zhuǎn)錄異常同樣發(fā)揮著重要作用[4]。非編碼RNA(ncRNA)包括微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)等,在mRNA翻譯、RNA加工等生理過程中起重要作用,在宮頸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦扮演著重要角色[5]。

一種組織特異性的稱為核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄物1(NEAT1)的lncRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[6],也是乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等女性腫瘤的新型生物標(biāo)志物[7]。miRNA是生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子,與宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成等過程密切相關(guān),扮演著癌基因或抑癌基因的角色[8,9]。miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c的5p和3p鏈組成,miR-34a-5p可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞侵襲[10]。本研究旨在體外觀察NEAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移功能的影響,并驗(yàn)證其與miR-34a的靶向關(guān)系,有助于我們尋找有效的宮頸癌治療分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將EEC和HeLa細(xì)胞從液氮中取出,快速放入37 ℃水浴鍋中,輕搖凍存管使凍存液溶解;溶解后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5 ml MEM培養(yǎng)基的離心管中,離心收集細(xì)胞(1 000 r/min 離心5 min),棄上清;用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,接種到培養(yǎng)皿中,輕輕吹打混勻,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí),棄去培養(yǎng)基,用PBS洗一遍;加2 ml胰蛋白酶消化細(xì)胞,顯微鏡下觀察,消化2 min,可看到細(xì)胞相互分離變圓,即消化完成;快速棄去胰酶,加入完全培養(yǎng)基,吹打細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,按1∶3的比例傳代,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NEAT1、miR-34a-5p的基因表達(dá)

Trizol法提取EEC及HeLa細(xì)胞的總RNA后,去除基因組DNA,配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為反應(yīng)模板。利用合成的引物序列,在ABI proFlex實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)。用于檢測(cè)目的的引物序列如下:①NEAT1:正向5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′,反向5′-GCACAACACAATGACACCCT-3′;②內(nèi)參GAPDH:正向5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反向5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′;③miR-34a-5p:正向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACCAG-3′,反向5′-TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′;④內(nèi)參U6:正向5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取處于對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;轉(zhuǎn)染前2 h,換成無血清MEM培養(yǎng)基;用10 μl無血清opti-MEM稀釋0.5 μl siRNA(20 μmol/L),并用槍頭輕輕混勻,室溫下靜置5 min;使用前輕輕混勻LipofectamineTM2000,然后取0.25 μl的LipofectamineTM2000稀釋在10 μl opti-MEM中,室溫下靜置5 min;混合LipofectamineTM2000和siRNA的稀釋液(總體積為20 μl),輕輕混勻并在室溫下靜置20 min;每個(gè)培養(yǎng)孔分別加混合液20 μl,前后輕輕搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使混合液與培養(yǎng)板中培養(yǎng)液混勻,細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);5 h后吸出混合液換入正常培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)計(jì)3條siRNA-NEAT1序列(siRNA-NEAT1-366,siRNA-NEAT1-3312,siRNA-NEAT1-2352),然后轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染組(正常組)和陰性對(duì)照組(NC組),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出干擾效率最好的1條siRNA,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA-NEAT1-366引物序列:正向5′-GGAGGAGUCAGGAGGAAUATT-3′,反向5′-UAUUCCUCCUGACUCCUCCTT-3′;siRNA-NEAT1-3312引物序列:正向5′-GCGUCUAUUGAAUUGGUAATT-3′,反向5′-UUACCAAUUCAAUAGACGCTT-3′;siRNA-NEAT1-2352引物序列:正向5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAATT-3′,反向5′-UUUCUAAGCAACUUCUCACTT-3′。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取處于對(duì)數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)96孔板,在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μl無菌PBS;37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(siRNA-NC組,轉(zhuǎn)染非特異性序列)和siRNA-NEAT1-3312組(轉(zhuǎn)染siRNA-NEAT1-3312序列),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后向每孔加入10 μl CCK-8,37 ℃培養(yǎng)2 h;酶標(biāo)儀OD450測(cè)定各孔吸光值,計(jì)算細(xì)胞增殖率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白孔)/(OD空白對(duì)照組-OD空白孔)×100%。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力

HeLa細(xì)胞處理和分組同1.5。胰酶分別消化收集細(xì)胞,1 000 r/min,5 min離心,去上清,PBS潤洗一次,清洗掉殘余血清;無血清MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),無血清MEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至3×105個(gè)/ml,備用。細(xì)胞遷移:在24孔板中預(yù)先加入700 μl含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(含雙抗),并放入Transwell小室,在Transwell上室分別接入200 μl各組細(xì)胞懸液,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;取出Transwell,用PBS小心清洗小室一遍,用70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h;用0.5%結(jié)晶紫染液染色,室溫中放置20 min,PBS清洗一下,用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)未遷移的細(xì)胞擦干凈,顯微鏡下觀察拍照;在3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)視野下對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

細(xì)胞侵襲:將Matrigel在4 ℃提前一天融化,Transwell小室、24孔培養(yǎng)板和槍頭在-20 ℃過夜預(yù)冷;用的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/ml,冰上操作;在24孔板中加入4 ℃預(yù)冷800 μl含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(含雙抗),并放入Transwell小室,在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μl終濃度為0.5 mg/ml的Matrigel,37 ℃溫育使其干成膠狀,待Matrigel干成膠狀后在Transwell上室分別接入200 μl各組細(xì)胞懸液,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);細(xì)胞固定染色及計(jì)數(shù)同細(xì)胞遷移。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

HeLa細(xì)胞處理和分組同1.5。胰酶消化收集細(xì)胞;用marker筆在6孔板背后,用直尺比著,均勻地劃橫線,橫穿過孔;以1×106個(gè)/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜;待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上,鋪滿6孔板底部,用槍頭比著直尺,垂至于背后的橫線劃痕;用PBS洗細(xì)胞3次,去除劃下的細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基,同時(shí)拍取0 h照片;放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在24 h拍照;計(jì)算細(xì)胞遷移距離(像素)=0 h劃痕距離-24 h劃痕距離,取平均值。

1.8 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

HeLa細(xì)胞處理和分組同1.5。胰酶消化收集細(xì)胞,用PBS將細(xì)胞潤洗2次,1 200 r/min,5 min離心;按照Annexin Ⅴ-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行:加入500 μl Binding Buffer,重懸細(xì)胞;加入5 μl Annexin Ⅴ-APC混勻后加入5 μl 7-AAD,混勻;室溫避光反應(yīng)5～15 min(同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照,即正常細(xì)胞不加Annexin Ⅴ-APC和7-AAD);流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,37 ℃培養(yǎng)過夜。在293T細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定,檢測(cè)NETA1是否與miR-34a-5p相互作用,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)NEAT1與miR-34a-5p基因之間的相互作用位點(diǎn),采用基因合成技術(shù)直接合成NEAT1基因包含靶位點(diǎn)區(qū)域的3′UTR片段,并克隆至pYr-miRTarget載體,同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)突變,分別構(gòu)建野生型和突變型雙熒光素酶質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒(野生型NEAT1-WT和突變型NETA1-MUT)分別與miR-34a-5p模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性,比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NEAT1、miR-34a-5p在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與EEC細(xì)胞相比,HeLa細(xì)胞中NEAT1的mRNA表達(dá)增強(qiáng),miR-34a-5p的mRNA表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05,見圖1)。

與EEC細(xì)胞相比,*P<0.05

2.2 siRNA-NEAT1干擾序列篩選

本研究設(shè)計(jì)3條siRNA序列,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,siRNA-NEAT1-3312組NEAT1的表達(dá)最低,即siRNA-NEAT1-3312的干擾效果最佳(見圖2),將之用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

與正常組相比,*P<0.05;與NC組相比,#P<0.05;與siRNA-NEAT1-366組相比,&P<0.05;與siRNA-NEAT1-3312組相比,@P<0.05

2.3 敲低NEAT1對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,siRNA-NEAT1-3312轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組相比,siRNA-NEAT1-3312轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量明顯降低,遷移距離明顯縮短(均P<0.05,見圖4和圖5)。凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,siRNA-NEAT1-3312轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05,見圖6)。以上結(jié)果提示,敲低NEAT1的基因表達(dá)可抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

與siRNA-NC組相比,*P<0.05

與siRNA-NC組相比,*P<0.05

圖6 siRNA-NEAT1對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 (n=3)

2.4 NEAT1和miR-34a-5p靶向關(guān)系的驗(yàn)證

我們通過ENCORI在線網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/),將NEAT1的預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)與來自CLIP-seq數(shù)據(jù)的Ago蛋白結(jié)合位點(diǎn)相交來展示miRNA-lncRNA相互作用,使用miRanda程序預(yù)測(cè)miRNA-lncRNA的相互作用,根據(jù)檢索策略設(shè)置為CLIP Data(low stringency≥1),發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p可能是NEAT1潛在的結(jié)合靶點(diǎn)(見圖7)。然后,NEAT1-WT和NETA1-MUT分別與miR-NC、miR-34a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了NEAT1與miR-34a-5p的靶向關(guān)系。與NEAT1-WT+miR-NC組相比,NEAT1-WT+miR-34a-5p mimics組熒光素酶表達(dá)降低(P<0.05);而與NEAT1-MUT+miR-NC組相比,NEAT1-MUT+miR-34a-5p mimics組熒光素酶表達(dá)不變(P>0.05,見圖8),提示NEAT1靶向miR-34a-5p參與調(diào)控HeLa細(xì)胞功能。

RL:海腎熒光素酶;FL:螢火蟲熒光素酶;WT:野生型;MUT:突變型

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,也是導(dǎo)致女性腫瘤死亡的主要原因之一,盡管治療和篩查取得了很大進(jìn)展,但大多數(shù)宮頸癌患者確診時(shí)已處于晚期,且治療耐藥性和高復(fù)發(fā)率使患者預(yù)后不佳,因此,尋找新的宮頸癌生物標(biāo)志物以改善治療至關(guān)重要。近年來,lncRNA的生物學(xué)功能得到了廣泛的研究,人類基因組測(cè)序結(jié)果表明只有不到2%的基因組是蛋白質(zhì)編碼基因,其余基因組則轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA,lncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA,其通過與蛋白質(zhì)、RNA和DNA的相互作用,在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平上發(fā)揮多種功能,參與表觀遺傳調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾,并且是許多病理和生理過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。lncRNA不僅廣泛參與機(jī)體的正常生長發(fā)育,而且與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA的異常表達(dá)被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵因素,并且越來越多研究表明lncRNA表達(dá)失調(diào)與宮頸癌密切相關(guān),lncRNA不僅參與了宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,還在癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、治療抵抗、HPV調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[12,13]。如Gan等[14]研究表明lncRNA AC010883.5表達(dá)增強(qiáng)誘導(dǎo)ERK1/2和MEK1/2磷酸化增加并激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Buranjiang等[15]研究表明子宮頸癌組織中miR-331-3p與lncRNA HOTAIR和RCC2呈負(fù)相關(guān),lncRNA HOTAIR通過靶向miR-331-3p/RCC2軸促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展。Gibb等[16]采用長片段基因表達(dá)關(guān)系序列技術(shù)檢測(cè)16例不同級(jí)別的宮頸上皮內(nèi)瘤病變(CIN)組織樣本,分析識(shí)別出人類宮頸組織中表達(dá)的lncRNA共1 056種,確定了CIN中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平存在差異,這與宮頸癌前病變以及發(fā)展存在密切關(guān)系。

lncRNA NEAT1位于染色體11q13.1,又稱為NCRNA00084,已被鑒定為人染色體11q13.1上的副核小體穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)劑。研究表明NEAT1在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[6]。Wen等[17]研究表明lncRNA NEAT1上的m6A在調(diào)節(jié)Pol II ser2磷酸化中起著關(guān)鍵作用,新型復(fù)合物CYCLINL1/CDK19/NEAT1-1可能為骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展提供新的見解。NEAT1在卵巢癌表達(dá)高于癌旁組織,且與腫瘤分級(jí)、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[18]。在宮頸組織表達(dá)量隨著宮頸病變程度增加而增高,提示NEAT1參與了從早期炎癥到晚期癌變的全過程[19]。本研究結(jié)果表明,NEAT1在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照細(xì)胞,提示了NEAT1在宮頸癌中的重要作用,與在宮頸癌組織和細(xì)胞系中的其他研究結(jié)果一致[20]。為了進(jìn)一步研究NEAT1對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的影響,本研究篩選了合適的siRNA敲低NEAT1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)的NEAT1可以促進(jìn)癌細(xì)胞存活,并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移和侵襲能力,從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。miRNA是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一類長度約為22nt的ncRNA,主要通過抑制翻譯或促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中的mRNA降解來控制轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)[21]。lncRNA可充當(dāng)miRNA的競爭內(nèi)源性RNA,并參與一系列細(xì)胞途徑[11]。本研究結(jié)果同時(shí)發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中,miR-34a-5p的mRNA表達(dá)降低,與在宮頸癌組織中檢測(cè)到的結(jié)果一致[21]。而我們通過生物信息學(xué)分析顯示miR-34a是NEAT1的靶基因,故推測(cè)NEAT1可能通過參與調(diào)控miR-34a表達(dá)參與宮頸癌變過程。最后我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了NEAT1與miR-34a-5p的關(guān)系,提示NEAT1通過miR-34a-5p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之,在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)NEAT1在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NEAT1靶向miR-34a-5p參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲,為將NEAT1作為治療宮頸癌的潛在分子提供理論依據(jù)。然而該研究存在局限性,包括未進(jìn)行可靠的臨床特征分析、未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究不足,這些限制可能導(dǎo)致本結(jié)果的局限性,在后續(xù)研究中,我們將挖掘調(diào)節(jié)機(jī)制,進(jìn)一步開展臨床分析和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證本研究結(jié)果。