王思宇,牛旭平

(1山西醫(yī)科大學第九臨床醫(yī)學院皮膚科教研室,太原 030001;2太原市中心醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:nnxxpp1978@sina.com)

銀屑病是一種復雜的炎癥性免疫性疾病[1],目前研究發(fā)現(xiàn)銀屑病與Th1/Th2、Th17/Treg細胞失衡、分泌的細胞因子IL-23、IL-17、IL-10、TGF-β1紊亂有關[2,3],但其發(fā)生發(fā)展機制并不完全清楚。研究認為銀屑病皮損處細胞參與局部免疫機制[4,5],并相互作用。外泌體通過“內(nèi)吞”途徑在細胞內(nèi)形成,攜帶蛋白質(zhì)等關鍵生物信號參與各類病理生理過程[6,7]。間充質(zhì)干細胞通過外泌體傳遞生物信號,釋放細胞產(chǎn)物,參與各種生物信號通路的活化或抑制[8,9]。銀屑病皮損及健康人皮膚間充質(zhì)干細胞(dermal mesenchymal stem cells, DMSCs)是否通過外泌體來參與銀屑病炎癥因子的代謝尚不明確。本研究通過提取健康人及銀屑病DMSCs來源的外泌體(DMSC-derived exosomes, DMSCs-EXO),作用于健康人及銀屑病患者外周血單個核細胞,分析DMSCs-EXO對外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)分泌銀屑病相關因子的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基來自美國HyClone公司,Ultra-CULTURE無血清培養(yǎng)基來自美國LONZA公司,植物凝集素(PHA)來自北京Solarbio公司,人IL-17、TGF-β1、IL-23、IL-10 ELISA檢測試劑盒來自上海西唐生物科技有限公司,Optima XE超速離心機來自美國Beckman公司,透射電鏡來自日本電子株式會社。

1.2 實驗細胞

DMSCs來源于太原市中心醫(yī)院皮膚科門診的尋常型銀屑病患者及泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)后留存的正常包皮皮膚組織,PBMCs來源于太原市中心醫(yī)院門診診斷的尋常型銀屑病患者外周血及健康志愿者外周血。該研究已通過太原市中心醫(yī)院倫理委員會批準(批準號2022011)。所有健康志愿者均除外銀屑病。所有研究對象已排除其他免疫疾病及炎癥性疾病,取材前3個月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、生物制劑及免疫抑制劑等治療。

1.3 皮膚來源間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)

將皮膚組織清洗干凈,沖凈殘血,除去角質(zhì)及多余皮下結(jié)締組織,清洗后將組織剪碎,加入0.025%中性蛋白酶(Dispase)浸沒組織過夜,將組織真表皮分離。收集真皮,使其充分破碎。篩網(wǎng)過濾后濾液以800 r/min離心8 min,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞,進行培養(yǎng)。當傳至第2代的DMSCs細胞長至鋪滿培養(yǎng)瓶底部約70%時,直接傾倒掉原培養(yǎng)基,更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約24 h待細胞長至90%左右時,收集上清液進行ELISA法檢測IL-23、IL-17、IL-10和TGF-β1細胞因子水平。

1.4 差速超速離心法提取純化外泌體

將樣本配平后分別以300g,2 000g及10 000g離心,收集上清液,使用0.22 μm濾膜過濾,將濾液在超速離心機中,120 000g超速離心70 min。去除上清后PBS重懸,再次120 000g超速離心70 min。去除上清,用PBS收集沉淀的外泌體[10,11]。

1.5 透射電鏡分析

吸取10 μl外泌體懸液滴加在電鏡專用銅網(wǎng)上,添加10 μl醋酸雙氧鈾在銅網(wǎng)上染色,待樣本干燥后立即使用80～100 V電鏡對所提樣品進行成像檢測,鑒定其是否符合外泌體標準。

1.6 PBMCs分離

使用EDTA抗凝管采集3例銀屑病患者及3例健康人外周血各10 ml,采用Ficoll-Hypaque梯度分離法分離PBMCs。使用含有植物凝集素PHA 50 μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。

1.7 分組及處理

實驗分4組,具體如下:在健康人來源的PBMCs(healthy PBMCs,HP)中分別添加銀屑病患者皮損處的間充質(zhì)干細胞分泌來源的外泌體(psoriasis DMSC-derived exosomes,PDMSCs-EXO)及健康人皮膚組織間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(healthy DMSC-derived exosomes,HDMSCs-EXO);在銀屑病人來源的PBMCs(psoriasis PBMCs,PP)中分別添加PDMSCs-EXO及HDMSCs-EXO。將狀態(tài)良好的PBMCs按照2×106個/孔分組,于0 h(初始對照)收取上清液后,分別添加100 μl/孔不同來源的DMSCs-EXO,放置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng),并分別于培養(yǎng)24 h及72 h時收集上清液,保存于-20 ℃冰箱,隨后進行ELISA檢測。

1.8 ELISA法檢測細胞上清液中細胞因子

按照說明書操作檢測分組培養(yǎng)后細胞上清液中IL-23、IL-17、IL-10和TGF-β1細胞因子水平。將試劑盒中10×標本稀釋液及20×濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋,將標準品按照各自說明書配制標準品梯度。檢測TGF-β1樣本按照1∶2進行稀釋,余樣本不稀釋。每孔各加入標準品或待測樣品,置于37 ℃恒溫搖床反應40 min。用配好的洗滌液將反應板充分沖洗4～5次后,濾紙吸干。分別加入試劑盒中的IL-23、IL-17、IL-10、TGF-β1第一抗體工作液,將反應板置于37 ℃溫箱20 min。再次洗板后每孔加入試劑盒中的酶標抗體工作液,將反應板放置于37 ℃溫箱10 min。再次洗板后每孔加入底物工作液,放置于37 ℃溫箱避光15 min。隨后加入終止液并震蕩混勻,立即使用全自動酶標儀檢測OD450處的吸光值。繪制標準曲線后計算相應濃度。IL-17、TGF-β1、IL-23和IL-10靈敏度分別為3 pg/ml,15 pg/ml,4 pg/ml,1 pg/ml。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DMSCs形態(tài)學觀察

正常人及銀屑病DMSCs在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),可見呈典型的長梭形樣外觀,大小不一,貼壁生長(見圖1)。

2.2 外泌體形態(tài)學觀察

透射電子顯微鏡的觀察結(jié)果顯示,外泌體呈杯托狀,橢圓形,可見明顯的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu),符合外泌體特征,單個或聚集分布(見圖2),結(jié)果提示外泌體提取質(zhì)量較好。

放大倍數(shù)×150 000 放大倍數(shù)×100 000

2.3 細胞培養(yǎng)物中細胞分泌相關因子含量

ELISA檢測PBMCs被不同來源EXOs干預前后的分泌相關因子變化,結(jié)果見表1～4。HP+PDMSCs-EXO組干預24 h及72 h時IL-17及IL-23濃度相較初始對照(0 h)上調(diào)(P<0.05),24 h時IL-10及TGF-β1濃度相較初始對照時間下調(diào)(P<0.05)。PP+HDMSCs-EXO組24 h及72 h時IL-17及IL-23濃度相較初始對照時間下調(diào)(P<0.05),24 h時IL-10及TGF-β1濃度相較初始對照時間上調(diào)(P<0.05)。在24 h及72 h時,HP+PDMSCS-EXO組IL-23、IL-17高于HP+HDMSCS-EXO組(P<0.05),IL-10、TGF-β1低于HP+HDMSCS-EXO組(P<0.05);在24 h及72 h時,PP+HDMSCs-EXO組IL-23、IL-17低于PP+PDMSCS-EXO組(P<0.05),IL-10高于PP+PDMSCS-EXO組(P<0.05),24 h時,TGF-β1高于PP+PDMSCS-EXO組(P<0.05)。相較于HP+HDMSCS-EXO組,在72 h時,PP+HDMSCS-EXO組IL-23、IL-17值無明顯差異;相較于HP+PDMSCS-EXO組,在24 h,PP+PDMSCS-EXO組IL-23、IL-17及TGF-β1無明顯差異,在72 h時TGF-β1無明顯差異。

表1 不同來源的EXO干預后銀屑病患者及健康人PBMC中IL-23的變化

表2 不同來源的EXO干預后銀屑病患者及健康人PBMC中IL-17的變化

表3 不同來源的EXO干預后銀屑病患者及健康人PBMC中TGF-β1的變化

表4 不同來源的EXO干預后銀屑病患者及健康人PBMC中IL-10的變化

3 討論

銀屑病是一種復雜的炎癥性免疫性疾病,研究發(fā)現(xiàn)銀屑病與相關炎癥細胞失衡、分泌的細胞因子紊亂有關,但發(fā)生發(fā)展機制并不完全清楚[12]。已有研究顯示,間充質(zhì)干細胞對銀屑病有一定程度治療作用[13]。皮膚組織間充質(zhì)干細胞來源的外泌體攜帶相關生物功能信息,應有與間充質(zhì)干細胞類似作用,而銀屑病皮損間充質(zhì)干細胞來源的外泌體是否攜帶銀屑病相關促炎物質(zhì),是否對PBMC有促炎轉(zhuǎn)化作用尚未有定論。

本研究使用差速超速離心法提取間充質(zhì)干細胞外泌體,所提外泌體優(yōu)質(zhì)且濃度較高。統(tǒng)計結(jié)果表明,健康人皮膚間充質(zhì)干細胞外泌體抑制了銀屑病患者PBMCs中IL-17、IL-23,并加強了IL-10、TGF-β1表達,促進了健康人PBMCs中TGF-β1的分泌且抑制了IL-17的分泌;同時,結(jié)果顯示與健康人皮膚間充質(zhì)干細胞來源外泌體相比,銀屑病皮損間充質(zhì)干細胞外泌體可促進健康人外周血單個核細胞分泌IL-17、IL-23細胞因子,并減少IL-10、TGF-β1的分泌,對銀屑病患者PBMCs有繼續(xù)增強IL-17分泌的作用。本研究結(jié)果表明,銀屑病皮膚間充質(zhì)干細胞通過外泌體參與PBMCs分泌細胞因子的調(diào)節(jié),這種調(diào)節(jié)作用部分是具有放大性及選擇性的。劉佳等[14]研究表明,這種調(diào)節(jié)作用可能與間充質(zhì)干細胞外泌體中攜帶的miR-155有關。由此推測,在銀屑病皮損發(fā)生處,已有的皮損可能會通過外泌體促進皮損周圍正常皮膚向銀屑病皮損轉(zhuǎn)化,減弱皮損周圍正常皮膚的抵抗作用,從而加速銀屑病皮損的增殖與擴大。而在銀屑病皮損接受健康間充質(zhì)干細胞的外泌體弱化炎癥通路時,會糾正銀屑病的炎癥發(fā)生。

綜上所述,銀屑病間充質(zhì)干細胞可通過外泌體參與炎癥信號的傳遞,可能為銀屑病的治療提供新的靶點。