何金盼,崔 鍵,戴 慶

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科,新疆圍術期器官保護重點實驗室(XJDX1411),烏魯木齊 830054)

包蟲病作為一種人畜共患疾病,是由寄生在肝臟和肺等器官的細粒棘球蚴幼蟲導致的嚴重寄生蟲病[1]。人體感染包蟲后,幼蟲在人體內形成囊性包蟲,誘發(fā)囊腫,并釋放包蟲囊液。包蟲囊液所致過敏性休克(anaphylactic shock,AS)是引起患者死亡的主要并發(fā)癥,在臨床實踐中發(fā)生率高達2.0%[2]。如果治療不及時,將會危及生命。

中性粒細胞是人體循環(huán)中最豐富的白細胞。它們在抵抗細菌、真菌和寄生蟲病原體的免疫防御中起著至關重要的作用[3]。2004年Brinkmann等[4]首次報道稱中性粒細胞在受到刺激后可形成中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)。其中,精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)通過催化組蛋白的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸,導致染色質解凝,這是NETs形成的關鍵[5]。NETs表面裝飾大量中性粒細胞胞質蛋白和顆粒蛋白,如髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、乳鐵蛋白和基質金屬蛋白酶等[6]。NETs可以結合并釋放毒力因子,殺死病原微生物防止其傳播。然而據(jù)研究發(fā)現(xiàn),過度的NETs形成可能導致蛋白水解酶以及組蛋白的大量釋放,從而產生細胞毒性,引起過敏反應并加重組織損傷[7]。例如在細菌感染引起的膿毒血癥中,NETs可以加速器官衰竭。而抑制PAD4酶活性可通過抑制NETs產生,提高膿毒癥小鼠生存率[8]。除此之外,機體過敏期間形成的IgG免疫復合物(包括組胺和蛋白酶等)可能通過誘導NETs釋放加重過敏反應[9]。然而未有研究報道PAD4介導的NETs是否加重包蟲囊液所致AS,其分子機制也有待進一步研究。

本研究通過給小鼠注射包蟲囊液抗原,構建AS模型,通過敲除PAD4抑制NETs形成,觀察是否可以改善模型小鼠癥狀,并研究其分子機制,以期為包蟲囊液所致AS的臨床防治研究提供一定的參考思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

20只野生型(wild type,WT)CB7BL/6 PAD4+/+小鼠以及20只同窩PAD4-/-敲除型小鼠(SPF級),8～10周,體質量平均(20.18±2.04)g,均購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,動物生產許可證號:SYXK(蘇)2018-0019。所有小鼠均置12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中,于24 ℃的恒定溫度中飼養(yǎng),實驗期間可自由獲取標準飲食和水。本動物實驗經我院倫理委員會審核,審批號:20220416-062。

1.2 主要儀器和試劑

100×青霉素-鏈霉素溶液(貨號:PB180120)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;紅細胞裂解液(貨號:C3702)購自上海碧云天生物技術有限公司;Percoll細胞分離液(貨號:17089101)購自北京智杰方遠科技有限公司;胎牛血清(貨號:C0235)購自美國Gibco公司;RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號:PM150110B)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;TRIzol試劑(貨號:abs9331)購自愛必信(上海)生物科技有限公司;M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(貨號:MT403-01)購自北京博邁德基因技術有限公司;qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;SYBR Real-Time PCR試劑盒(貨號:QPG-040)購自上海吉瑪生物科技有限公司;綠箐SYTOX Green(貨號:001-TY9036)購自北京畢特博生物技術有限責任公司;離子霉素(貨號:I9657)購自美國Sigma;Picogreen(貨號:12641ES01)購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;流式抗體:FITC標記的CD4(貨號:ab59474)、PE標記的IFN-γ(貨號:ab95673)和APC標記的IL-4(貨號:ab95715)購自美國abcam公司;Ficol1分離液(貨號:LDS1075)購自天津灝洋生物公司。IL-4、IL-5和IgE的ELISA檢測試劑盒購自上海雨桐生物科技有限公司。

Spark多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司;倒置熒光顯微鏡(型號:TS2)購自尼康儀器(上海)有限公司;7300 Plus Real-Time PCR system、FACSCalibur多色流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗制包蟲囊液抗原 于本市屠宰場獲取自然感染細粒棘球蚴的綿羊,取綿羊肝臟。在無菌條件下獲取肝臟中的包蟲囊液,待其自然沉淀后,棄上清液。根據(jù)張秦[10]研究方法,使用含有抗生素(青霉素、鏈霉素各500 U)的生理鹽水沖洗底部沉淀3次。隨后將其凍存于-80 ℃冰箱內。

1.3.2 包蟲囊液所致AS模型建立 將小鼠分為WT組、WT模型組、PAD4-/-組和PAD4-/-模型組,每組各10只。WT模型組和PAD4-/-模型組小鼠腹腔注射細粒棘球絳蟲的幼蟲微囊建立包蟲感染小鼠模型,每只小鼠的注射劑量約為50個微囊。WT組和PAD4-/-組給予等量生理鹽水代替。1個月后,將小鼠進行全身麻醉,解剖若發(fā)現(xiàn)包蟲囊泡時則認為包蟲囊液模型成功。兩個模型組小鼠均再次注射相同劑量的包蟲囊液。若小鼠出現(xiàn)喘息,呼吸困難,嘴和尾巴周圍發(fā)紺,甚至表現(xiàn)為震顫和抽搐,則認為小鼠出現(xiàn)包蟲囊液所致AS[11]。并記錄小鼠24 h內死亡情況。將成功造模的小鼠數(shù)據(jù)納入后續(xù)實驗。

1.3.3 脾臟中性粒細胞的分離培養(yǎng) 將小鼠眼球摘除后頸椎脫臼處死,置于75%酒精中浸泡消毒10 min,在無菌環(huán)境下打開小鼠腹腔,取小鼠脾臟,置于1 ml生理鹽水中充分研磨,使用200目篩網進行過濾,得到脾臟單細胞懸液。4 ℃,1 000 r/min離心5 min后,棄上清,加入適量紅細胞裂解液以去除紅細胞。再次離心棄上清,使用無菌生理鹽水洗滌2次。使用適量生理鹽水重懸細胞沉淀,緩慢加入配制好的Percoll細胞分離液中,室溫1 000 r/min離心30 min。輕輕吸出位于中層的中性粒細胞,1 000 r/min離心5 min,使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞。置于37 ℃,含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.3.4 qRT-PCR檢測PAD4基因表達 用TRIzol試劑從中性粒細胞中提取總RNA,并使用酶標儀檢測RNA質量(濃度、純度)。使用M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒將所得到的RNA逆轉錄為cDNA,按照SYBR Real-Time PCR試劑盒的說明配制qRT-PCR反應體系。反應條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt值比較各組之間目的基因的相對表達量,以GAPDH為內參基因。引物序列如下:PAD4上游引物:5′-TTCAAGTGGTGGCACATGGT-3′,下游引物:5′-AGATCTCTTGCTGCACCTCG-3′;GAPDH上游引物:5′-CAGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′;下游引物:5′-GATGGGCTTCCCGTTGATGA-3′。

1.3.5 綠菁染色法檢測NETs形成水平 綠箐SYTOX Green是一種可輕易穿過受損細胞質膜而不能透過活細胞質膜的綠色核酸染料,可用來檢測NETs的DNA網狀結構。將提取的脾臟中性粒細胞均勻鋪于24孔板內,每孔1×106個細胞,在避光條件下,加入細胞核染料綠箐(1 μmol/L),輕輕混勻,孵育10 min,在含有氬激光488 nm激發(fā)器的熒光顯微鏡下觀察,使用Image J軟件對形成網狀結構的細胞進行統(tǒng)計。

1.3.6 NETs與外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共孵育 提取健康小鼠的脾臟中性粒細胞,以1×106的密度接種于24孔板中,加入10 μmol/L的離子霉素刺激3 h后,棄掉上清液,加入新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,輕輕吹起中性粒細胞,在1 000 r/min下離心5 min,獲取的上清液,采用picogreen熒光染料檢測雙鏈DNA的濃度,即為NETs含量。收集健康WT小鼠的外周血,Ficol1密度梯度離心法分離PBMC均勻平鋪于24孔板內。實驗分為對照組(不加NETs)和NETs組,NETs組加入200 μg/ml濃度的NETs后,置于37 ℃,含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中共孵育24 h后,進行后續(xù)實驗檢測。

1.3.7 流式細胞術檢測Th1/Th2細胞比例 分別抽取造模組和對照組外周靜脈血,Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。分別加入FITC標記的CD4抗體10 μl,混勻,室溫放置20 min對細胞表面抗原進行染色。Triton通透并固定細胞后進行PBS洗滌,進行胞內細胞因子染色,實驗管分別加入PE標記的IFN-γ抗體和APC標記的IL-4抗體各10 μl,對照管加入同型對照抗體,4 ℃避光孵育30 min后,PBS洗滌2次后,采用流式細胞儀檢測分析。用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 ELISA檢測血清中IL-4、IL-5和IgE蛋白的含量 參考ELISA試劑盒的說明書進行IL-4、IL-5和IgE的含量檢測。依次制備梯度稀釋的標準品后加入標準孔中,加入10 μl待測樣品與40 μl樣品稀釋液,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應30 min。加入50 μl的辣根過氧化物酶標試劑,繼續(xù)37 ℃反應30 min,反應結束后,分別加入顯色液A和顯色液B,室溫反應10 min后可觀察明顯顏色變化。加入終止液終止反應。使用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度值。

2 結果

2.1 敲除PAD4緩解包蟲囊液所致AS癥狀

與WT組比較,WT模型組小鼠休克率和死亡率明顯升高;與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠休克率和死亡率明顯降低(見表1)。

表1 敲除PAD4對包蟲囊液所致AS癥狀的影響 例(%)

2.2 敲除PAD4抑制包蟲囊液所致NETs形成

qRT-PCR結果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠脾臟中中性粒細胞PAD4 mRNA表達升高(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠脾臟中中性粒細胞PAD4 mRNA表達降低(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠脾臟中中性粒細胞PAD4 mRNA表達水平無顯著性差異(P>0.05,見圖1)。綠菁染色結果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠NETs形成水平升高(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠NETs形成水平降低(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠NETs形成水平無顯著性差異(P>0.05,見圖1)。

2.3 敲除PAD4恢復包蟲囊液所致Th1/Th2細胞比例失衡

流式細胞術結果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠PBMC中Th2細胞比例升高,Th1/Th2細胞比例降低(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠PBMC中Th2細胞比例降低,Th1/Th2細胞比例升高(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠PBMC中Th2細胞比例和Th1/Th2細胞比例無顯著性差異(P>0.05,見圖2)。

與WT組比較,*P<0.05;與WT模型組比較,#P<0.05

2.4 敲除PAD4緩解包蟲囊液所致過敏性反應

ELISA結果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平升高(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平降低(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平無顯著性差異(見圖3)。

2.5 NETs誘導Th1/Th2細胞比例失衡和過敏性反應

流式細胞術結果顯示,與對照組比較,NETs組Th2細胞比例升高,Th1/Th2細胞比例降低(P<0.05,見圖4)。ELISA結果顯示,與對照組比較,NETs組細胞上清中IL-4、IL-5和IgE水平升高(P<0.05,見圖5)。

與對照組比較,*P<0.05

與對照組比較,*P<0.05

3 討論

包蟲病是細粒棘球蚴幼蟲侵入人體引起的寄生蟲病。在手術過程或者發(fā)生外傷時,包蟲原頭節(jié)會脫落并擴散至腹腔或其他器官中,形成新的包囊,導致疾病反復發(fā)作。此外,包蟲囊液感染形成的囊腫可能發(fā)生破裂,進而導致AS,在臨床嚴重程度和免疫學特征上均不同于Ⅰ型超敏反應[12]。因此,臨床上針對Ⅰ型超敏反應的治療,往往無法治愈包蟲囊液所致的AS,這給臨床治療帶來了很大困難[13]。

中性粒細胞是發(fā)生炎癥或感染后快速募集并殺死病原微生物的一類免疫細胞。在人類包蟲病中,中性粒細胞在包囊中大量浸潤[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)綿羊的中性粒細胞體外接觸包蟲原頭節(jié)后,可以觸發(fā)NETs形成[15]。這表明中性粒細胞除了可以通過吞噬、釋放炎性因子等經典功能發(fā)揮作用外,還可能通過釋放NETs對抗寄生蟲感染疾病。目前針對NETs產生的機制已經有大量研究進行了報道。中性粒細胞在受到刺激后,細胞膜上的Ca2+通道打開,細胞外的Ca2+內流至細胞質中,導致PAD4酶被激活[16]。PAD4是PAD家族中唯一攜帶核定位信號的酶[17]。在被激活之后,PAD4進入細胞核,催化染色質上的組蛋白發(fā)生瓜氨酸化。這一過程使得組蛋白的正電荷減弱,降低了它們與DNA的靜電結合能力,從而導致染色質結構變得不穩(wěn)定,出現(xiàn)解螺旋。隨后,DNA被釋放到細胞質中,并與髓過氧化物酶(MPO)和中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)等細胞質顆粒蛋白結合。這個復合物隨后被從細胞中釋放出來,形成被稱為NETs的結構[18]。NETs形成受各種因素的影響,包括細胞的黏附、代謝和環(huán)境刺激,細菌和病毒往往會被中性粒細胞的吞噬作用清除,而寄生蟲更傾向于誘導NETs的形成[19]。Mendez等[20]在牛的奧氏奧斯特線蟲慢性感染疾病中觀察到了NETs的產生,同時研究表明,寄生蟲觸發(fā)的NETs形成可能反映了宿主針對寄生蟲入侵的早期先天免疫反應應答,以此對抗寄生蟲感染[21]。以上研究證據(jù)均表明NETs可能是對抗寄生蟲感染的關鍵,然而并未曾有進一步的機制探索。

值得注意的是,目前越來越多的研究已經發(fā)現(xiàn),PAD4介導的NETs形成可以加重諸如COVID-19等多種感染性疾病的發(fā)展[21]。在COVID-19感染者中,NETs在患者肺部大量浸潤。體外實驗表明NETs可對正常肺上皮細胞產生殺傷作用,而用脫氧核糖核酸酶抑制NETs后可以逆轉這種損傷[22]。在本實驗中,通過使用WT和PAD4敲除的小鼠進行腹腔注射包蟲囊液進行造模,探究PAD4介導的NETs形成是否會加重由包蟲感染導致的AS,結果表明,敲除PAD4緩解包蟲囊液所致AS癥狀,表現(xiàn)為休克率和死亡率明顯降低。同時敲除PAD4抑制了小鼠中性粒細胞NETs的形成,提示NETs可能在包蟲囊液所致AS中過度產生,進而促進了該疾病的惡化。

Th1/Th2細胞的平衡與免疫調節(jié)系統(tǒng)密切相關。Th1/Th2失衡時,Th2細胞分化增加導致過敏反應加重[23]。因此調節(jié)Th1/Th2平衡對包蟲囊液所致AS具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),WT模型組小鼠PBMC中Th1/Th2細胞比例降低,而敲除PAD4可以顯著增加Th1/Th2細胞比例。同時NETs與PBMC共孵育實驗表明,NETs可直接調節(jié)Th1/Th2比例,以上結果表明PAD4介導的NETs可能通過加重Th1/Th2細胞比例的失衡加重疾病進程。Th2細胞免疫反應是抗炎反應,IL-4和IL-5為Th2型細胞因子,它們可以刺激B細胞產生IgE抗體,繼而刺激肥大細胞釋放組胺,引起過敏反應[24]。本研究結果發(fā)現(xiàn),NETs可以增加PBMC的IL-4、IL-5和IgE分泌能力,而PAD4敲除可以顯著抑制小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平的升高,緩解包蟲囊液所致過敏性反應。

綜上所述,敲除PAD4可以通過抑制中性粒細胞NETs的形成,改善包蟲囊液所致AS。PAD4敲除可能通過恢復包蟲囊液所致Th1/Th2細胞比例失衡,抑制包蟲囊液所致過敏性反應進而緩解包蟲囊液所致AS。以上結果初步明確了PAD4介導的NETs形成在包蟲囊液所致AS中的作用,可為其臨床治療提供可能的治療靶點。